摘要GydF4y2Ba
本研究提出的研究问题是:福莫特罗(1和10 nM)和孟鲁司特(2 μM)是否对激活的人体中性粒细胞具有交互抑制作用,特别是与环AMP和胞质Ca的改变有关GydF4y2Ba2+GydF4y2Ba通量?GydF4y2Ba
用化学引诱剂激活分离的人血中性粒细胞GydF4y2BaNGydF4y2Ba-甲酰-GydF4y2BaLGydF4y2Ba-methionyl -GydF4y2BaLGydF4y2Ba-leucyl -GydF4y2BaLGydF4y2Ba-phenylalanine (fMLP) (1 μM)与cytochalasin B (CB;3μM)。采用呋喃2-乙酰氧基甲基酯荧光法、荧光素增强化学发光法、比色法和流式细胞仪测定胞质CaGydF4y2Ba2+GydF4y2Ba通量、超氧化物产生、弹性蛋白酶释放和β-2整合素(CR3)表达,而环腺苷酸和白三烯(LT)BGydF4y2Ba4.GydF4y2Ba采用竞争结合酶联免疫吸附法测定。GydF4y2Ba
用fMLP/CB激活细胞导致细胞质Ca的突然和持续增加GydF4y2Ba2+GydF4y2Ba,以及弹性蛋白酶的释放和超氧化物和LTB的产生GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba其中,福莫特罗和孟鲁司特单独,特别是联合使用这两种药物时,均可降低CR3的表达。每种药物以及联合用药的抗炎作用都与环磷酸腺苷的显著增加有关。GydF4y2Ba
目前的研究结果可以解释孟鲁司特和福莫特罗联合吸入糖皮质激素治疗严重哮喘的疗效,可能是通过控制中性粒细胞引起的气道炎症。GydF4y2Ba
抗炎化疗是支气管哮喘药物治疗的基石,是最常见的吸入性皮质类固醇GydF4y2Ba1.GydF4y2Ba.对于不能单独使用皮质类固醇的患者,指导建议是应该增加额外的控制性治疗,或者是长效βGydF4y2Ba2.GydF4y2Ba-肾上腺受体激动剂(LABA)或半胱氨酸白三烯受体(cysLTR)拮抗剂GydF4y2Ba2.GydF4y2Ba.对于仍未得到充分控制的患者,可在吸入皮质类固醇药物中加入控制药物的组合GydF4y2Ba2.GydF4y2Ba. 除了皮质类固醇对β的影响之外GydF4y2Ba2.GydF4y2Ba-受体表达与功能GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba–GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba在美国,这三种药物的临床益处被认为是由于它们独特的治疗活动机制的集体效应,而不是它们之间有意义的、有益的相互作用。皮质类固醇具有广谱抗炎活性,而LABAs和孟鲁司特分别主要是作为支气管扩张剂和通过拮抗cyltrs发挥作用GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba.然而,有证据表明LABAs和孟鲁司特除了具有传统的治疗作用外,还具有抗炎特性GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba–GydF4y2Ba10GydF4y2Ba.如果手术GydF4y2Ba在活的有机体内GydF4y2Ba这些可能补充了皮质类固醇在控制严重哮喘中的抗炎作用,特别是那些似乎对皮质类固醇有抵抗力的中性粒细胞GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba是炎症细胞的主要类型吗GydF4y2Ba11GydF4y2Ba.GydF4y2Ba
中性粒细胞以及其他类型的免疫细胞和炎症细胞的促炎活性被药理学药物升高细胞内循环AMP (cAMP)所抑制。GydF4y2Ba12GydF4y2Ba.因为这些细胞具有βGydF4y2Ba2.GydF4y2Ba-肾上腺素受体,它们对β的抗炎作用敏感GydF4y2Ba2.GydF4y2Ba-激动剂,包括选择性长效剂福莫特罗GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba. 孟鲁司特也被报道通过一种不同于cysLTRs拮抗作用的机制增加细胞内cAMP,其涉及非特异性抑制环核苷酸磷酸二酯酶(PDE),导致cAMP依赖性抑制中性粒细胞促炎活性GydF4y2Ba9GydF4y2Ba.福莫特罗和孟鲁司特联合用药可能通过各自与β的相互作用而增强camp依赖性的抗炎活性,这一点虽然未经试验,但似乎是可信的GydF4y2Ba2.GydF4y2Ba-肾上腺素受体和pde,特别是PDE4GydF4y2Ba13GydF4y2Ba.GydF4y2Ba
在目前的研究中,我们调查了福莫特罗和孟鲁司特单独或联合使用对激活中性粒细胞促炎活性的影响,这些活性与cAMP和Ca的改变有关GydF4y2Ba2+GydF4y2Ba由细胞处理,这是本研究的主要重点。在一系列有限的实验中,我们还将地塞米松和沙丁胺醇进行了比较。GydF4y2Ba
材料和方法GydF4y2Ba
化学药品和试剂GydF4y2Ba
富马酸福莫特罗脱水剂和地塞米松购自Sigma-Aldrich(私人)有限公司(南非约翰内斯堡)和孟鲁司特,由默克研究实验室(美国新泽西州拉威)提供,而沙丁胺醇和罗利普兰由葛兰素史克公司(英国斯托克利公园)提供。除沙丁胺醇(水溶性)外,所有试剂均溶解在二甲基亚砜(DMSO)中,储备浓度为10 mM,最终浓度为1和10 nM(福莫特罗)、2μM(孟鲁司特)、100 nM(沙丁胺醇)、1μM(地塞米松)和1μM(罗利普兰),用于下文所述的各种中性粒细胞功能测定。每次分析中二甲基亚砜的最终浓度范围为0.1–0.2%,每个实验系统都包括适当的溶剂对照。GydF4y2Ba
本研究中使用的孟鲁司特浓度(1 - 2 μM)接近使用该药物化疗期间达到的血清峰值~ 1 μMGydF4y2Ba14GydF4y2Ba. 然而,呼吸道中福莫特罗的浓度更难确定。假设最大单次剂量为24μg,肺部沉积为18.6%,到达气道的福莫特罗总量为∼4.5μgGydF4y2Ba15GydF4y2Ba.如果潮气量为500ml,这相当于局部浓度为9ng·mLGydF4y2Ba−1.GydF4y2Ba,相当于11 nM,接近本研究中使用的最高浓度10 nM。除非注明,所有其他化学品和试剂都是从Sigma-Aldrich购买的。GydF4y2Ba
化学引诱物,GydF4y2BaNGydF4y2Ba-甲酰-GydF4y2BaLGydF4y2Ba-methionyl -GydF4y2BaLGydF4y2Ba-leucyl -GydF4y2BaLGydF4y2Ba-苯丙氨酸(fMLP;1μM终末)与细胞松弛素B(CB;3μM终末)联合使用以激活中性粒细胞。由于福莫特罗和孟鲁司特的抗炎作用,使用了这种相对强效的激活剂(fMLP/CB)。在另外一个有限的系列实验中,使用了另外一种化学引诱剂,血小板活化因子(PAF;200 nM)。GydF4y2Ba
中性粒细胞的制备GydF4y2Ba
该研究得到了比勒陀利亚比勒陀利亚大学健康科学研究伦理委员会的批准,并获得了所有献血者的事先知情同意。这些细胞是从不吸烟的健康成年志愿者的肝素化静脉血(每毫升血液5单位无防腐剂肝素)中分离出来的。每名受试者在静脉穿刺前完成一份详细的健康调查问卷,并接受一名经验丰富的合格护士的健康检查(包括血压测量)。通过在Histopaque-1077(Sigma Diagnostics,St Louis,MO,USA)缓冲垫上以400×100离心分离中性粒细胞和单核白细胞GydF4y2BaGGydF4y2Ba室温下保存25分钟。所得到的微球悬浮在PBS (0.15 M, pH 7.4)中,用3%的明胶沉淀以去除大部分红细胞。离心后(280×GydF4y2BaGGydF4y2Ba用0.83%氯化铵在4°C下选择性裂解10分钟,去除残余红细胞。中性粒细胞通常纯度高(>90%)和活力(>95%),重悬于1×10GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba细胞·毫升GydF4y2Ba−1.GydF4y2Ba在PBS中,在使用前保持在冰上。GydF4y2Ba
超氧化物生成GydF4y2Ba
这是用荧光素(bis)测定的-GydF4y2BaNGydF4y2Ba-硝酸甲基吖啶)增强化学发光(LECL)程序。简单地说,中性粒细胞(10GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba细胞)在含有0.2 mM荧光素的900μL Hanks平衡盐溶液(HBSS,pH 7.4,无指示剂;Highveld Biological(Pty)Ltd,南非约翰内斯堡)中不含或与孟鲁司特(2μM)预孵育。预孵育后,将福莫特罗(1或10纳米)添加到细胞中(或将等量的溶剂添加到控制系统中),20秒后进行fMLP/CB,并使用Lumac Biocounter(型号2010;Lumac systems Inc.,Titusville,FL,USA)记录LECL反应。每个小瓶中的最终体积为1 mL,结果以相对光单位(rlu)表示,是添加活化剂后40–50 s达到的fMLP/CB活化系统的峰值。每个实验有四个系统:1)仅中性粒细胞(对照组);2) 中性粒细胞+福莫特罗;3) 中性粒细胞+孟鲁司特;中性粒细胞+孟鲁司特+福莫特罗。GydF4y2Ba
弹性蛋白酶释放GydF4y2Ba
根据初级颗粒酶弹性蛋白酶的释放程度测量中性粒细胞脱颗粒。中性粒细胞在2×10浓度下培养GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba毫升GydF4y2Ba−1.GydF4y2Ba在不含孟鲁司特(2μM)和含孟鲁司特(2μM)的HBSS中,在37°C下培养10 min,然后向相关系统中添加福莫特罗(1或10 nM)或溶剂控制,20 s后通过fMLP/CB,然后将试管在37°C下培养15 min。然后将试管转移到冰浴中,然后在400×10℃下离心GydF4y2BaGGydF4y2Ba5分钟,使细胞形成颗粒,倾析上清液,并使用标准比色法程序的微修改分析弹性蛋白酶。简而言之,向弹性蛋白酶底物中添加125μL上清液,GydF4y2BaNGydF4y2Ba-琥珀酰-GydF4y2BaLGydF4y2Ba丙氨酰-GydF4y2BaLGydF4y2Ba-丙氨酸-GydF4y2BaPGydF4y2Ba-硝基苯胺(3 mmol·LGydF4y2Ba−1.GydF4y2Ba在0.05 M Tris-HCl(pH 8.0)中,以分光光度计在405 nm波长下监测弹性蛋白酶活性。皮质类固醇地塞米松(1μM)对fMLP/CB激活的中性粒细胞释放弹性蛋白酶的影响也在更有限的一系列实验中进行了研究。在10分钟的预孵育期内,皮质类固醇与细胞一起存在。GydF4y2Ba
CR3表达式GydF4y2Ba
流式细胞术检测在福莫特罗(10 nM)和孟鲁司特(2 μM)单独或联合作用下,静息和fMLP/ cb激活的中性粒细胞中CR3的表达。中性粒细胞(1×10GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba毫升GydF4y2Ba−1.GydF4y2Ba最终)在37°C条件下,在含孟鲁司特和不含孟鲁司特的HBSS中孵育10分钟,然后在相关系统中添加福莫特罗或溶剂对照,20 s后通过fMLP/CB。试管孵育1分钟,通过在冰冷的培养基中稀释细胞停止反应。将藻红蛋白标记的CD11b单克隆抗体(Beckman Coulter,Miami,FL,USA)加入10μL体积至1mL细胞悬液中,并使用配备水冷企业激光器(Beckman Coulter)的Epics Altra流式细胞仪分析CR3表达,结果以平均荧光强度表示。GydF4y2Ba
荧光光谱法测定胞质钙GydF4y2Ba2+GydF4y2Ba
以呋喃-2乙酰氧基甲酯(fura-2AM)为荧光剂,CaGydF4y2Ba2+GydF4y2Ba-灵敏的指示物GydF4y2Ba16GydF4y2Ba.中性粒细胞(1×10GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba毫升GydF4y2Ba−1.GydF4y2Ba)用fura-2AM (2 μM)在37℃PBS中孵育30分钟,洗涤后用HBSS重悬。负载呋喃2的电池(2×10GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba毫升GydF4y2Ba−1.GydF4y2Ba),然后在37°C下预孵育10分钟,不含孟鲁司特(2 μM),然后转移到一次性反应试管中,在37°C的日立650 10S荧光分光光度计中保持,激发波长和发射波长分别设置为340和500 nm。在获得稳定的基线(±1分钟)后,在相关体系中加入福莫特罗(仅10 nM)或溶剂对照,20秒后使用fMLP/CB,并在5-10分钟的时间过程中监测荧光强度的变化。胞质钙GydF4y2Ba2+GydF4y2Ba如前所述计算浓度GydF4y2Ba16GydF4y2Ba在一系列更为有限的实验中,还研究了以下内容:1)短效βGydF4y2Ba2.GydF4y2Ba-受体激动剂,沙丁胺醇(100纳米最终值,在初步实验中预先确定),不使用或使用孟鲁司特(1μM)对PAF(200纳米)激活的细胞溶质Ca增加GydF4y2Ba2+GydF4y2Ba在中性粒细胞浓度;2)福莫特罗(10 nM)单独或联合原型PDE的影响GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba抑制剂罗利普兰(固定,终浓度1 μM);3)地塞米松(1 μM)对fMLP/ cb活化Ca的影响GydF4y2Ba2+GydF4y2Ba中性粒细胞中的通量。孟鲁司特、罗利普兰和地塞米松在10分钟预培养期内与细胞一起出现,而沙丁胺醇或福莫特罗在细胞激活前20秒加入。GydF4y2Ba
白三烯B的测定GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba和营GydF4y2Ba
竞争结合免疫分析程序(EIA)GydF4y2BaTMGydF4y2Ba;Assay Designs Inc., Ann Arbor, MI, USA)测定白三烯(LT)BGydF4y2Ba4.GydF4y2Ba在fMLP/ cb激活的中性粒细胞上清液中检测cAMP,而在没有或有福莫特罗和孟鲁司特的情况下,单独或联合检测cAMP。以LTB为例GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba中性粒细胞(2×10GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba毫升GydF4y2Ba−1.GydF4y2Ba)在37°C条件下,在孟鲁司特(2μM)不存在和存在的情况下预孵育10分钟,然后将福莫特罗(1或10 nM)添加到相关系统中,20 s后进行fMLP/CB。3分钟后,通过向试管中添加等体积的冰冷HBS终止培养,然后在离心造粒细胞之前将试管置于冰浴中。然后将无细胞上清液稀释(1:8)并测定LTBGydF4y2Ba4.GydF4y2Ba,结果表示为pg LTBGydF4y2Ba4.GydF4y2Ba每10GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba细胞。与其他中性粒细胞促炎活性测定一样,每个实验由四个系统组成:1)仅中性粒细胞(对照组);2) 中性粒细胞+福莫特罗;3) 中性粒细胞+孟鲁司特;中性粒细胞+福莫特罗+孟鲁司特。在更有限的一系列实验中,还研究了以下内容:1)沙丁胺醇(100 nM)不含孟鲁司特(1μM)和含孟鲁司特(1μM)对LTB产生的影响GydF4y2Ba4.GydF4y2BaPAF (200 nM)活化的中性粒细胞;2)地塞米松(1 μM)对LTB产生的影响GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba用fMLP/CB激活的中性粒细胞。GydF4y2Ba
在cAMP的情况下,中性粒细胞(2×10GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba毫升GydF4y2Ba−1.GydF4y2Ba)在37℃下预孵育10分钟,不含孟鲁司特(2 μM)或含孟鲁司特(2 μM),然后在相关体系中加入福莫特罗(仅10 nM),在管中加入等量的冰点HBSS后20 s反应终止。离心后弃上清,加入0.1 M HCl提取细胞微球中cAMP,离心去除细胞碎片,倒出上清,检测cAMP。这些结果用pmol cAMP / 10表示GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba细胞。GydF4y2Ba
统计分析GydF4y2Ba
除呋喃-2荧光实验的结果,其中一些以代表性的痕迹表示外,每个系列实验的结果都以平均值±表示GydF4y2Ba扫描电镜GydF4y2Ba数值,其中n等于每个系列实验中使用的不同供体的数量,每个药物浓度和每个实验的无药物对照系统的复制数量如图例所示。通过使用重复测量ANOVA和适当的多重比较后试验,将每个药物治疗系统的绝对值与每个试验的相关无药物对照系统的相应值进行比较,确定统计显著性水平。GydF4y2Ba
结果GydF4y2Ba
超氧化物产生、弹性蛋白酶释放和LTBGydF4y2Ba4.GydF4y2Ba
在福莫特罗(1和10 nM)和孟鲁司特(2 μM)单独或联合使用fMLP/CB激活的中性粒细胞的结果显示在GydF4y2Ba图1GydF4y2Ba.福莫特罗或孟鲁司特治疗中性粒细胞显著(p<0.05)减少超氧化物和LTB的产生GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba特别是,在大多数情况下,联合用药(尤其是1nm福莫特罗)的效果显著(p<0.05),尽管是添加性的,而不是协同性的,但其弹性蛋白酶的释放比单独用药的效果更显著(p<0.05)。唯一的例外是产生超氧物,联合用药的效果与单独使用孟鲁司特的效果仅略有不同。在孟鲁司特存在下观察到的弹性蛋白酶释放抑制的程度,尽管具有统计学意义,但比我们之前报道的要小GydF4y2Ba9GydF4y2Ba,可能是因为当前研究中使用的CB浓度较高。GydF4y2Ba
用地塞米松处理中性粒细胞对LTB的产生影响很小GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba以及从fMLP/ cb激活的中性粒细胞释放弹性酶。在弹性酶的情况下,在没有地塞米松和有地塞米松的情况下,fMLP/CB激活的细胞值分别为950±15和932±15毫单位弹性酶/ 10GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba细胞,分别。对应的LTB值GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba释放量分别为7213±110和7242±150 pg LTBGydF4y2Ba4.GydF4y2Ba每10GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba细胞(来自三个独立实验的数据)。沙丁胺醇(100nm)和孟鲁司特(2μM)单独或联合应用对LTB释放的影响GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba通过paf激活的中性粒细胞也进行了研究。未刺激细胞、paf激活的对照细胞、沙丁胺醇单独、孟鲁司特单独或联合处理的细胞LTB结果分别为24±2、681±29、335±55、132±38和65±17 pgGydF4y2Ba4.GydF4y2Ba每10GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba细胞,分别(每个药物处理系统与对照系统的比较,以及与单独药物的组合,p<0.05)。GydF4y2Ba
CR3表达式GydF4y2Ba
静止中性粒细胞的CR3表达水平为27±2平均荧光强度。对照组、fMLP/CB激活细胞和仅用福莫特罗(10 nM)和孟鲁司特(2μM)处理的相应系统的相应表达水平两种药物单独或联合应用的平均荧光强度分别为92±2、71±3、81±2和60±3,CR3表达水平显著降低(p<0.05)与所有三种药物治疗系统的对照系统相比,福莫特罗和孟鲁司特治疗系统的CR3表达水平显著低于单独药物治疗系统的CR3表达水平(p<0.05)。GydF4y2Ba
营GydF4y2Ba
这些结果如所示GydF4y2Ba图2GydF4y2Ba. 用福莫特罗(10nm)或孟鲁司特(2μM)治疗中性粒细胞20s后,细胞内cAMP显著升高(p<0.05)。尽管高于单独使用药物观察到的结果,但孟鲁司特和福莫特罗联合治疗细胞引起的cAMP增加与单独使用药物观察到的结果没有显著差异(GydF4y2Ba图2GydF4y2Ba).我们以前曾报道孟鲁司特能增强中性粒细胞暴露于沙丁胺醇后cAMP的增加GydF4y2Ba9GydF4y2Ba.GydF4y2Ba
胞质钙GydF4y2Ba
胞质CaGydF4y2Ba2+GydF4y2BafMLP/CB激活的中性粒细胞中的浓度使用图中所示的策略进行量化GydF4y2Ba图3GydF4y2Ba。结果如GydF4y2Ba图4GydF4y2Ba是来自一个代表性实验的痕迹,该实验描述了细胞溶质钙的变化GydF4y2Ba2+GydF4y2Ba在福莫特罗(10 nM)和孟鲁司特(2 μM)单独或联合作用下,fMLP/CB激活细胞后(fura-2荧光)。用fMLP/CB激活细胞后,胞质钙含量突然增加GydF4y2Ba2+GydF4y2Ba,峰值反应持续1-2分钟,随后逐渐下沉,在1-2分钟内趋于平稳,达到持续平台,水平远高于激活前细胞溶质钙的基础值GydF4y2Ba2+GydF4y2Ba. 在添加fMLP/CB之前,用孟鲁司特(2μM)处理细胞10分钟或用福莫特罗(10 nM)处理细胞20秒,可导致细胞溶质Ca峰值的部分但显著(p<0.05)衰减GydF4y2Ba2+GydF4y2Ba响应速度一方面加速下降,另一方面幅度下降,响应持续平稳。此外,孟鲁司特和福莫特罗的联合用药在促进钙的清除方面显著(p<0.05)优于单独用药GydF4y2Ba2+GydF4y2Ba来自fMLP/CB激活的中性粒细胞的胞浆。这些结果如所示GydF4y2Ba表1GydF4y2Ba.在福莫特罗(10 nM)存在或不存在的情况下,非选择性PDE抑制剂罗利普兰(1 μM)也获得了类似的结果(未显示)。中性粒细胞添加PAF (200 μM)后,胞质钙含量突然升高GydF4y2Ba2+GydF4y2Ba,随后是一个持续的高原阶段,随后逐渐下降到基础水平。在加入刺激剂前20 s用沙丁胺醇(100 nM)预处理中性粒细胞不会改变初始峰值反应的幅度,或持续的平台期的持续时间。而胞质钙的下降速率GydF4y2Ba2+GydF4y2Ba在孟鲁司特(1μM)存在的情况下,初始平台期明显减弱,胞浆Ca下降的速度加快GydF4y2Ba2+GydF4y2Ba浓度显著增加。沙丁胺醇和孟鲁司特联合用药比单独用药更有效。这些结果如所示GydF4y2Ba图5GydF4y2Ba和GydF4y2Ba表2GydF4y2Ba. 地塞米松没有检测到改变CaGydF4y2Ba2+GydF4y2BafMLP/CB激活的中性粒细胞中的通量(结果未显示)。GydF4y2Ba
讨论GydF4y2Ba
有报道称孟鲁司特添加治疗对吸入皮质类固醇单药治疗或LABA和吸入类固醇联合治疗控制不良的哮喘患者有益GydF4y2Ba17GydF4y2Ba–GydF4y2Ba22GydF4y2Ba.在这种情况下,我们认为孟鲁司特靶向炎症机制,特别是由半胱氨酸白三烯及其受体协调的炎症机制,从而补充吸入糖皮质激素和β的治疗作用GydF4y2Ba2.GydF4y2Ba受体激动剂。然而,这可能不是孟鲁司特附加治疗对控制不良的哮喘患者有益的唯一机制。最近描述孟鲁司特对偏二苯醚的影响GydF4y2Ba9GydF4y2Ba提高该药物与其他抗哮喘药物,特别是β-受体拮抗剂协同作用的可能性GydF4y2Ba2.GydF4y2Ba-激动剂,增强cAMP介导的抗炎活性,可能还有支气管扩张活性。GydF4y2Ba
为了验证这一假设,我们研究了福莫特罗(1和10 nM)和孟鲁司特(1 - 2 μM)单独或联合对人中性粒细胞促炎活性的影响。用任何一种药剂处理中性粒细胞,都能显著抑制超氧化物的生成,以及在fMLP/CB激活细胞后CR3的表达和弹性蛋白酶的释放,联合使用比单独的药剂更有效。最明显的是在CR3表达和弹性酶释放的情况下,这些影响是加性的,而不是协同的。在哮喘中,吞噬细胞来源的活性氧和弹性蛋白酶分别被确定为支气管亢进和阻塞以及气道重塑的可能介质GydF4y2Ba23GydF4y2Ba,GydF4y2Ba24GydF4y2Ba,而干扰CR3表达则会限制中性粒细胞进入气道。在生产LTB的情况下GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba通过活化的中性粒细胞,发现单独的药物是产生这种二十碳烯酸的极其有效的抑制剂,与福莫特罗和孟鲁司特联合使用观察到的小但显著的增强作用。尽管已被公认的半胱氨酸白三烯参与哮喘,但它不是麦汁为什么是LTBGydF4y2Ba4.GydF4y2Ba在严重的持续性哮喘的发病机制中,以及阿司匹林和运动诱发的哮喘、变应性鼻炎和特应性皮炎中也发挥了重要作用GydF4y2Ba25GydF4y2Ba此外,皮质类固醇通常不会影响LTBGydF4y2Ba4.GydF4y2Ba据报道,BLT1受体在皮质激素抵抗细胞(如中性粒细胞、单核细胞和效应记忆CD8+ t细胞)上的表达上调GydF4y2Ba24GydF4y2Ba–GydF4y2Ba27GydF4y2Ba.在目前的研究中,地塞米松,一种不能提高细胞内cAMP浓度的药物,对弹性蛋白酶或LTB没有检测到影响GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba由活化的中性粒细胞释放。GydF4y2Ba
虽然在慢性哮喘或炎症得到很好控制的哮喘的治疗中相关性有限,但我们也测量了短效β-干扰素的作用GydF4y2Ba2.GydF4y2Ba-受体激动剂沙丁胺醇,长期服用GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba由PAF激活的中性粒细胞产生,与fMLP/CB相比,PAF的刺激作用较弱。沙丁胺醇也抑制LTB的产生GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba通过paf激活的中性粒细胞,孟鲁司特的加入增强了这种效果,可能是前面描述的相互作用的camp依赖机制GydF4y2Ba9GydF4y2Ba.GydF4y2Ba
为了探讨福莫特罗/孟鲁司特介导的抑制中性粒细胞促炎活性的机制,我们研究了这些药物对cAMP和胞浆钙的改变的影响GydF4y2Ba2+GydF4y2Ba.中性粒细胞暴露于福莫特罗或孟鲁司特均伴有cAMP显著增加。在孟鲁司特的病例中,这些数值比我们以前报道的要高GydF4y2Ba9GydF4y2Ba. 这很可能是由于细胞暴露于药物的时间较长(在本研究中为10分钟,而在先前的研究中为5分钟)。尽管联合用药观察到的cAMP增加幅度略高于单独用药观察到的幅度,但差异未达到统计学意义。这可能是因为我们使用了相对较短的暴露时间(20秒),福莫特罗的影响最大;更长的暴露时间可能显示出这种组合的显著效果。GydF4y2Ba
在中性粒细胞中,提高细胞内cAMP的药物的抗炎作用主要是通过激活cAMP依赖的蛋白激酶(PKA)实现的。PKA反过来加速Ca的恢复GydF4y2Ba2+GydF4y2Ba细胞暴露于受体连接的Ca后的体内平衡和促炎活性下调GydF4y2Ba2+GydF4y2Ba通过多种机制动员刺激,包括:磷脂酶C的磷酸化失活GydF4y2Ba28GydF4y2Ba;肌醇三磷酸受体在细胞内Ca的失活GydF4y2Ba2+GydF4y2Ba商店GydF4y2Ba29GydF4y2Ba; 钙调高GydF4y2Ba2+GydF4y2Ba隔离/再隔离内膜CaGydF4y2Ba2+GydF4y2Ba三磷酸腺苷GydF4y2Ba30.GydF4y2Ba抑制p38 MAP激酶,从而干扰5-脂氧合酶的激活GydF4y2Ba31GydF4y2Ba和自分泌细胞LTB的衰减GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba-介导的Ca次级波GydF4y2Ba2+GydF4y2Ba细胞摄取GydF4y2Ba32GydF4y2Ba.GydF4y2Ba
在目前的研究中,福莫特罗和孟鲁司特与先前的研究一致GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba9GydF4y2Ba,协助Ca的过关GydF4y2Ba2+GydF4y2Ba从被fMLP/CB激活的中性粒细胞的胞质中提取,而不影响胞内储存的阳离子的移动。这两种药物联合使用时最有效。这些观察结果与福莫特罗和孟鲁司特靶向β的机制是一致的GydF4y2Ba2.GydF4y2Ba-肾上腺素受体和pde分别发挥其单独和联合的抗炎作用GydF4y2Ba通过GydF4y2Bacamp依赖,Ca的加速恢复GydF4y2Ba2+GydF4y2Ba体内稳态以下观察结果支持了这一论点:1)将fMLP/CB激活的中性粒细胞暴露于4型PDE抑制剂罗利普兰,与福莫特罗联合使用,导致细胞溶质Ca减少GydF4y2Ba2+GydF4y2Ba浓度与孟鲁司特和福莫特罗相似;孟鲁司特增强了沙丁胺醇对Ca清除的作用GydF4y2Ba2+GydF4y2Ba从paf激活的中性粒细胞的细胞质中提取。它对弹性蛋白酶和LTB的释放没有影响GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba地塞米松对Ca无影响GydF4y2Ba2+GydF4y2BafMLP/ cb激活的中性粒细胞的通量GydF4y2Ba
总之,目前的研究结果确定了一种相互作用的、cAMP依赖的机制,福莫特罗和孟鲁司特可能通过靶向控制不佳的哮喘患者的顽固性中性粒细胞支持吸入性皮质类固醇的抗炎作用。GydF4y2Ba
脚注GydF4y2Ba
支持声明GydF4y2Ba
这项研究得到了美国新泽西州罗威默克研究实验室研究员启动研究计划的研究拨款的部分支持。GydF4y2Ba
感兴趣的语句GydF4y2Ba
C. m . Gravett, C. Feldman和R. Anderson的兴趣声明,以及研究本身,可以在GydF4y2Bawww.www.qdcxjkg.com/site/misc/statements.xhtmlGydF4y2Ba
- 收到了GydF4y2Ba2009年10月6日。GydF4y2Ba
- 认可的GydF4y2Ba2010年4月5日。GydF4y2Ba
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