摘要
本研究的目的是验证甲氧西林耐药模型金黄色葡萄球菌并研究生物标志物的时间进程和组织病理学变化。
预管12个仔气,用15毫升悬浮液接种10个悬浮液6.MRSA的菌落形成单位在每个叶通过支气管镜通道。仔猪通气12 h (n = 6)和24 h (n = 6)。每6 h评估临床参数,在基线和牺牲时测定血清和支气管肺泡灌洗(BAL)中的促炎细胞因子。各叶的组织病理学及血、肺、肺泡培养。
动物在尸检时发育了肺炎的组织病理学证据。在12小时,肺炎在所有动物中存在,24小时的肺炎是严重的肺炎。微生物研究证实了MRSA的存在。在12小时的24小时和IL-6中看到白细胞介素(IL)-6,IL-8和肿瘤坏死因子-α值的显着增加。在血清中,24小时只有IL-6水平显着增加。
在通风仔猪中,MRSA的支气管镜检查在12小时和24小时时诱导肺炎和严重的肺炎。这种严重程度与系统性和局部炎症反应的相应增加有关。
呼吸机相关的肺炎(VAP)是医院感染中死亡率的主要原因1.VAP的诊断、病理生理学和治疗的许多方面还不清楚。肺炎的动物研究提供了一个独特的机会,以评估一些不完全了解的机制参与VAP,而不受潜在混杂因素的影响。马奎特et al。2建立机械通气仔猪肺炎动物模型。该模型已被证明是非常有用的,以适当评价不同方面的VAP3.-9..本研究采用该动物模型,评估了实验性VAP引起的局部(肺)和全身(血清)炎症反应(IR)Pseudomona绿脓杆菌机械通气4天后9.. 尽管这些研究证明了在长时间通风的动物身上进行实验的可行性,但它们也不能避免潜在的缺点。最重要的是,4天实验产生的经济费用,需要经过专门培训的人员妥善管理通常处于危急状态的动物。此外,随着时间的推移,其他微生物污染的可能性可能会合理增加,从而使数据的解释更加复杂。因此,较短的实验将是最佳的,特别是如果我们认为,主机的IR到微生物接种和肺炎组织病理学病变发展的精确时间过程在该动物模型中是未知的。在本研究中,我们旨在验证通气仔猪的VAP模型,评估接种耐甲氧西林疫苗12小时和24小时后相关炎症生物标志物的时间进程和肺组织病理学变化金黄色葡萄球菌(耐甲氧西林金黄色葡萄球菌)。我们选择这种微生物是因为它是医院感染性肺炎的最常见原因之一,导致显著的发病率和死亡率10-12.此外,治疗MRSA感染的抗生素的缺乏,它们的潜在毒性和肺分布的变化,使得动物模型在进行药效学和药动学研究方面特别有吸引力。
方法
实验是在一个配备有心血管监测仪的实验重症监护病房(ICU)进行的(惠普658型;惠普,马德里,西班牙),通风机(Servo 900D;西门子,马德里,西班牙)和电动注入泵(Juac 591,圣地亚哥,CA,美国)。
动物的准备
12头健康家种大白猪,3-4月龄,平均±se体重20±2 kg。肌肉注射镇静(2 mg·kg)-1)αzaperone(striesnil®; Esteve,巴塞罗那,西班牙),并用30 mg·kg麻醉-1静脉注射硫喷妥钠(戊total®;方丈,马德里,西班牙)。然后用7.5 mm低压袖管(Mallinckrodt 7.5;Mallinckrodt Medical, Athlone, Ireland),并接上了呼吸机。持续输注咪达唑仑维持麻醉®;Reig-Jofré,巴塞罗那,西班牙)0.4 mg·kg-1·h-1和苯太尼(芬太尼®,Kern Pharma, Barcelona, Spain) 5 μg·kg-1·h-1,随后静脉注射硫喷妥钠。将导管插入股静脉7 French (F) (Plastimed, Prodimed, St Leu-la-Forêt, France)持续输注5%葡萄糖溶液(0.8 mL·kg)-1·h-1)和0.9%生理盐水(0.8 mL·kg-1·h-1)用输液泵。股动脉用3F聚乙烯导管(塑性化,产品)插管,用于压力监测和血液采样。通过手术中线微型细胞染色,将8°F静脉尿道导管(Rüsch,kammating,马来西亚)置于膀胱中。然后将仔猪置于俯卧位并机械通风12或24小时。
机械通风
动物被机械通气,以容量控制模式。呼吸机参数包括:潮气量(V.T.),持续吸气10ml·kg-1;呼吸频率(FR.)15呼吸·min-1;吸气时间33%;以及初始吸气部分(F阿,我2),无呼气末正压(PEEP)。之后,F阿,我2根据血气分析设置以获得动脉氧张力(P.啊,一个2),呼气末正压升高至5 cmH2在需要时。气道压力,静态肺顺应性(除以V.T.呼气末平台压和呼气末总压的差异13)和动脉血气(使用血气分析仪测量,AutomaticQC Cartridge: Siemens, Tarrytown, NY, USA)每6小时测定一次FR.达到auto-PEEP出现前的最大水平。如前所述,超过这个限度,高碳酸血症是可以耐受的14.
支气管接种
75 mL(10个)6.菌落形成单位(CFU)·mL-1致病性MRSA(株分离自Panton Valentine白细胞杀伤素(PVL)阴性患者;万古霉素最低抑菌浓度为1 μg·mL-1和2μg·毫升-1对利奈唑胺)用纤维支气管镜接种,并均匀分布于各肺叶。当动物经镇静和机械通气后血流动力学稳定后,再进行细菌接种。
抽样和程序
机械通风参数(V.T.那FR.,气道压力和F阿,我2)、心率、血压、体温、血气和血清电解质(钠、钾)在0、6、12、18和24 h监测。在0、12和24 h监测血液生化和血细胞计数。
支气管肺泡灌洗
在0小时(接种MRSA悬液前)和牺牲时(12或24小时),通过支气管镜通道将两份15ml等分的无菌生理盐水(0.9%氯化钠)注入右肺中叶并再次吸入。
炎症参数
血液和支气管肺泡灌洗液中的细胞因子
使用猪专用试剂盒(R&D Systems Inc., Minneapolis, MN, USA),采用ELISA法测定血清和支气管肺泡灌洗(BAL)上清中的肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-6和IL-8水平。
在插管时和研究结束时测定BAL细胞因子。分别在插管时(基线)和插管12、24小时测定血清细胞因子。
牺牲和事后剖析研究
6头仔猪分别在12 h和24 h诱导安乐死。全身麻醉下,快速静脉注射过量氯化钾(40 mEq)注射。;B. Braun Medical S.A, Barcelona, Spain)。
肺标本的集合
死亡后,动物一直处于机械通气状态,直到获得肺实质的手术标本进行细菌学和组织病理学评估。肺通过颈胸正中切口无菌暴露。此后,至少一个肺组织标本(3厘米3.)取自保存较好的肺叶(宏观识别)和较复杂的肺叶。标本分成两部分进行细菌学和病理学研究。
组织病理学评价
肺组织按标准方法处理。对血管(血栓和内皮病变)、胸膜(急性或慢性胸膜炎)和肺实质进行分析。肺实质的评估包括肺炎的严重程度和其他相关病变(透明膜和肺泡损伤)的存在。根据先前公布的标准对肺炎的严重程度进行分级17在以下的年级。0 =无肺炎;1 =脓性黏液堵塞;2 =细支气管炎;3 =肺炎(实变同时伴有多形核白细胞、纤维蛋白渗出物和细胞碎片进入肺泡腔);4 =合流性肺炎(沿不同次叶延伸);5 =脓肿性肺炎(细胞坏死伴细胞结构破坏)。肺炎仅限于后三种类型。根据观察到的最差的类别对每个标本进行分类。
统计分析
所有数据均表示为平均值±se.使用成对数据的非参数检验;Wilcoxon检验和Friedman检验分别用于两个或两个以上时间点的比较。p值<0.05被认为具有统计学意义。
机构委员会的批准
该研究由医院诊所的机构审查委员会和伦理委员会批准(巴塞罗那,西班牙);动物护理符合美国国家卫生研究院出版的“实验室动物护理和使用指南”18,并根据当地政府的指导方针。
结果
生理和实验室数据
生理和实验室变量显示在表1.支气管接种后,静态肺顺应性(p<0.05)和平均动脉压(p<0.01)迅速持续下降,体温(p<0.01)和心率(p<0.05)升高。此外,P.啊,一个2/F阿,我2虽然差异没有达到统计学意义,但比率随时间而下降。生化指标未见差异。
炎症反应
在12小时观察到Bal IL-6浓度的渐进增加,其在24小时进一步增加。与基线相比,BAL IL-8和TNF-α浓度也显着增加,但仅在24小时(图1).相反,在血清中,只有IL-6水平在24小时显著升高。血清中IL-8和TNF-α浓度的测量没有经历任何显著变化(图2).
微生物的发现
在研究开始时(MRSA灌注前)进行的所有BAL样本均为无菌。与此相反,在试验结束时采集的所有BAL样品和评估的12头仔猪的肺组织培养中都存在MRSA。BAL培养产生浓度为103.CFU·ML.-18只小猪和10只小猪4.CFU·ML.-1在四个小猪。肺组织培养也显示出浓度为103.cfu·g-1在所有经评估的样本中(图3).6头仔猪的血培养在12 h时均为阴性,24 h时5头为阳性。巴斯德菌multocida和coagulase-negative葡萄球菌也在一些样本中检测到,尽管计数较低。
组织病理学研究
肺样本的组织病理学评估显示所有仔猪都存在肺炎,包括12小时处死的仔猪(3-5级)。然而,在24小时处死的所有猪中均出现严重肺炎,定义为脓肿或汇合性肺炎(4级和5级),在12小时处死的猪中仅出现一例。
讨论
本研究的主要发现是,在经支气管镜接种致病性MRSA后12小时,通气仔猪的肺炎及其相关肺部IR的组织病理学体征已经很明显。接种后24小时,肺部病变的严重程度和IR的强度进一步增加。这些发现首次证实了该模型在研究抗生素治疗和协同治疗对微生物接种后12小时严重MRSA肺炎的早期效果方面的潜在效用,从而缩短了此类实验的时间和成本。
我们的研究结果证实了之前我们自己小组使用的方法铜绿假单胞菌作为这种动物模型中的VAP的微生物Aetiological9..接种MRSA后,动物出现肺炎的临床症状(发热、心动过速、低血压和气体交换障碍)和肺力学恶化(随着时间的推移静态顺应性下降)。肺炎的组织病理学征象在12小时时就已经很明显了,尽管在24小时后,当所有的动物被评估为严重肺炎(定义为脓肿或融合性肺炎)时,这些征象增加了。此外,这项研究还证实了IR的区隔化以及IL-6在相关IR中的关键作用,正如之前在同一动物模型中描述的那样9..IL-6是唯一在12小时肺中显著升高的细胞因子,也是唯一在血清中显著升高的细胞因子。BAL中IL-8和TNF-α的浓度在随后的肺炎严重程度进展时增加。值得注意的是,血清中IL-6浓度已被证明是不同人群死亡率的独立预测因素17那19.因此,血清和BAL中对其的测定可能是一个非常有用的参数,以评估IR的大小和不同的抗炎治疗的潜在作用。
在本研究中,我们选择MRSA作为病原体有几个原因。首先,革兰氏阳性病原体作为院内肺炎死亡原因的报道频率越来越高11.金黄色葡萄球菌是医院肺炎的最常见原因和死亡的主要原因20..自20世纪80年代MRSA菌株出现以来,这种微生物对β-内酰胺类抗生素产生了渐进耐药性21那22.从那时起,世界各地的许多机构都报告了由MRSA引起的院内肺炎暴发23那24.据估计,耐甲氧西林金黄色葡萄球菌发病的死亡风险比甲氧西林敏感发病的死亡风险高20倍金黄色葡萄球菌25那26.由于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)感染在通气患者中的患病率增加和相关的高死亡率,旨在更好地了解感染的发病机制和抗生素治疗的有效性的研究是至关重要的。
不同的作者已经证明,当仔猪通风长达96小时时,可能发生VAP2-10那14.在本研究中,我们已经表明,在接种MRSA后,组织病理学证实肺炎的第一次可能是显而易见的。缩短实验具有明显的潜在优势。首先,预期财务和人力资源的节省,因为实验的设置需要持续监测动物。因此,需要一大群ICU专业人士(医生和护士)。其次,其他微生物的肺污染的风险和外肺感染的潜在发育随着时间的推移而增加,使得到的结果的解释使得释放。第三,知道在微生物接种后,了解肺炎的迹象表现的确切时间表可以有助于我们在影响感染过程和相关的IR过程中确定抗生素的确切作用。考虑MRSA肺炎时,这一点特别相关。可用于治疗MRSA的严重感染的治疗选择是有限的27那28.万古霉素敏感性降低的MRSA菌株(SA-RVS)的出现进一步减少了治疗选择。此外,ICU患者的药代动力学曲线经常变化太大,无法确保使用标准抗生素剂量的最佳治疗结果29那30.. 不仅药代动力学,而且药效学特征也会影响抗生素的给药方案。感染部位的抗生素浓度与血浆中的抗生素浓度差别很大,因为药物的渗透性取决于药物、相关组织和感染。因此,在局部感染(如肺炎)中,了解游离药物的哪一部分能够穿过膜和屏障并到达感染部位是极其重要的。MRSA肺炎动物模型的可用性使其能够在血清和肺部进行准确的药代动力学和药效学研究,这为深入了解特定治疗反应的相关方面提供了独特的机会。对SA-RVS的日益认识将需要对新治疗药物的疗效进行对照研究;动物模型在这方面也可能非常有用。卢娜et al。31最近发表了与仔猪MRSA肺炎的糖肽相比潜在的潜在有利影响。用LINZOLID治疗的动物具有更好的存活率和更好地清除MRSA的趋势,而不仅仅是药代动力学和药效学效应。进一步研究这些新试剂对MRSA或SA-RV引起的感染的疗效。
本研究存在局限性。首先,在先前健康的动物中外源性给予高细菌接种并不一定反映人类肺炎发展的复杂性。其次,还必须考虑仔猪和人类肺部免疫的潜在物种差异。最后,这是一种相对“纯”的VAP模型,与机械通气的危重患者相反,在该模型中动物不存在共病。然而,这种动物模型也有明显的优势,可以评估特定治疗的特定作用,可以在血清和肺中进行药动学和药效学评估。
综上所述,本研究表明,在通气仔猪中,接种后12 h复制MRSA肺炎及其相关IR是可行的,具有缩短实验时间的潜在优势。
脚注
支持声明
该研究由Sociedad Española de Neumología y Cirugía Torácica (SEPAR) 2005, Societat Catalana de Pneumologia (SOCAP) 2006, CB, 2005 SGR 00822, IDIBAPS,心血管研究网络和心血管流行病学和遗传学研究小组(HERACLES) RD06/0009, Red reddinscor资助。Fondo de Investigaciones Sanitarias (FIS) FIS PI070419, Fundacion Lilly, 2009 SGR 911, Ciber de Enfermedades呼吸器(CIBERES CB 06/06/0028);CIBERES是ISCII的倡议。
感兴趣的语句
没有宣布。
- 收到了2009年11月6日。
- 公认2010年2月4日。
- ©2010人队