抽象的GydF4y2Ba
潜在病毒感染涉及慢性阻塞性肺病(COPD)的病理生理学。已知Epstein-Barr病毒(EBV)在肺纤维化中是重要的。目前作者假设EBV与COPD的发病机制有关。GydF4y2Ba
在COPD的加重和稳定时,从患者中收集痰样品。一个没有气道阻塞的吸烟者的对照组也被检查了。使用实时核酸扩增测定来建立和定量EBV DNA的存在。GydF4y2Ba
在急性加重期间招募了136名患有COPD的患者,并且当稳定时总共68例。EBV在65例(48%)加剧病例中检测到31例(46%)稳定的患者。在16名非郊区吸烟者的比较组中,EBV仅以一(6%)案例进行了证明。EBV患者和吸烟者患者的COPD风险赋予了12.6的赔率比。GydF4y2Ba
与未受影响的吸烟者相比,在慢性阻塞性肺病患者的呼吸道中更常见的是Epstein-Barr病毒DNA。它在恶化期间和稳定时呈现,表明感染是持久的。没有发展慢性阻塞性肺病的吸烟者很少在它们的痰中具有Epstein-Barr病毒。该发现可能对慢性阻塞性肺病的发病机制具有重要性。GydF4y2Ba
慢性阻塞性肺疾病(COPD)的特点是通过气道中的中性粒细胞积聚的发炎气道GydF4y2Ba1GydF4y2Ba.气道粘膜用细胞毒性T淋巴细胞(CD8 +)渗透GydF4y2Ba2GydF4y2Ba.这导致了假设,即需要除吸烟以外的其他代理商来发展COPD。慢性病毒感染可以占CD8 + T细胞和有和没有COPD的吸烟者之间的差异。最近出现了急性呼吸病毒感染在COPD恶化中的作用GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba.分子诊断技术允许研究人员研究潜在病毒感染在COPD发病机制中的作用。一些研究表明,潜伏病毒在COPD的发病机制中是重要的GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba.GydF4y2Ba
Epstein-Barr病毒(EBV)是疱疹病毒家族的成员,这是普遍的,并且已经与各种疾病过程有关,包括腺体发热,Burkitt的淋巴瘤,鼻咽癌,淋巴瘤和移植后淋巴抑制性疾病GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba-GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba.Burkitt的淋巴瘤和鼻咽癌都与潜伏的EBV感染有关GydF4y2Ba10.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba11.GydF4y2Ba.患有EBV的患者患有EBV的患者在疾病的进展方面更有可能发展淋巴瘤。具有抗EBV活性的Acyclovir或类似药物的这种病毒减少了艾滋病患者非霍奇金淋巴瘤的发病率,这表明艾滋病相关淋巴瘤病毒发病机制中的因果作用GydF4y2Ba12.GydF4y2Ba.GydF4y2Ba
EBV已经在下呼吸道被识别出来,在脱落的上皮细胞中可见GydF4y2Ba原位GydF4y2Ba杂交GydF4y2Ba13.GydF4y2Ba.EBV也经常在肺纤维化中发现肺部GydF4y2Ba14.GydF4y2Ba.凯莉GydF4y2Ba等等。GydF4y2Ba14.GydF4y2Ba分析了特发性肺纤维化患者的肺活检和血液样本,并在〜60%的情况下发现EBV,但在肺部移植患者对照中没有。进一步调查使用免疫组织化学表明,病毒主要位于气道上皮细胞中GydF4y2Ba15.GydF4y2Ba.GydF4y2Ba
Sputum是一种丰富的气道上皮细胞来源;本作者对病毒进行了研究进行了研究。在加剧和缓解期间检查样品,以及在健康吸烟者的对照组中。假设EBV是COPD中可能存在持续性病毒感染的候选者。GydF4y2Ba
材料和方法GydF4y2Ba
研究科目GydF4y2Ba
招募具有COPD的受试者在2年期间招募。COPD使用全局慢性阻塞性肺病(金)标准来定义GydF4y2Ba16.GydF4y2Ba.在发表的24小时内,在出席医院时招募了一种恶化的小组。也招募了稳定的COPD患者(未增加呼吸道症状或前8周的治疗),也是一个吸烟的对照组,但没有任何气道阻塞的证据。肺炎(Microolab 3300肺测定仪; Micro Medical Ltd,Gillingham,UK)预先生和后支气管扩张剂治疗(2.5毫克Salbutamol Jilbulised;英国伦敦艾伦&Hanbury)。在支气管扩张剂疗法(≥200ml或+ 15%)之后具有显着改善的患者被排除在外。那些患有支气管扩张病史,肿瘤过程或其他严重伴随疾病的患者被排除在外。本研究由英国贝尔法斯特大学贝尔法斯特研究伦理委员会批准。GydF4y2Ba
学习规划GydF4y2Ba
本研究采用急性呼吸道感染的已知患病率设计GydF4y2Ba16.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba17.GydF4y2Ba.COPD加重期和稳定期的检出率分别为30%和10%,使用0.8的幂次和0.05的显著性,作者计算出COPD加重期需要128名患者,稳定期需要64名患者。使用疾病组中50%的流行率GydF4y2Ba18.GydF4y2Ba在不清的组中,EBV检测为4%GydF4y2Ba19.GydF4y2Ba,计算使用4:1的对照组将需要64例稳定的COPD患者和16名非偏心吸烟者。GydF4y2Ba
方法GydF4y2Ba
痰样品GydF4y2Ba
通过通过空气驱动的雾化器(MicroMist®小容量Nebuliser; Hudson呼吸护理Inc.,英国Ashby-de-La-Zouch,UK)雾化通过空气驱动的高渗(3%)盐水(3%)盐水诱导痰.强迫呼气量一秒钟(FEVGydF4y2Ba1GydF4y2Ba每5分钟重复一次。如果FEV有20%的情况下,该程序被停止了GydF4y2Ba1GydF4y2Ba.痰液诱导不用于COPD的急性加剧。GydF4y2Ba
痰样品从唾液中取出塞子。将标本与四个体积0.1%的二硫代噻唑(Sigma,Poole,UK)混合在轨道培养箱(Gallenkamp,Loughborough,UK),在37°C下摇动15分钟,然后加入四个量的PBS并进一步摇动5. min. The resulting suspension was then filtered through a 50-μm nylon gauze (Lockertex, Warrington, UK) and spun down at 1,000×GGydF4y2Ba10分钟。除去上清液后,将细胞沉淀重悬于裂解缓冲液中(QiapAMP DNA血液迷你套件; Qiagen,Crawley,UK)。在悬浮在裂解缓冲液中悬浮的200μl痰液样品中进行总核酸萃取。在PBS中重新悬浮一个单独的样品,使用如前所述的玻璃盖滑动方法进行总和上皮细胞计数GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba.GydF4y2Ba
PCR:GAPDH.GydF4y2Ba
使用甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)作为参考管家基因。使用了发表的底漆和探针组,结合了使用底漆设计软件设计的一组外部引物(PrimerSelect 5.00,1993-2001; Dnastar Inc.,Konstanz,德国)GydF4y2Ba21.GydF4y2Ba.在核酸萃取(QIAGEN QIAAMP DNA血液迷你试剂盒)中,将2μl的每个样品与8μLAPDHMENTERMIX合并。GydF4y2Ba
然后在热循环仪(MJ研究; Peltier热循环仪,San Francisco,Ca,USA)和0.2μl的第一圆产物中进行第一轮PCR,然后与9.8μL含有引物和Taqman®组合使用0.2μl的第一圆形产物。探针(用6-羧基荧光素和6-羧基甲基甲基吡啶胺染料标记为第一圆形引物。实时PCR(30次循环)在轻质链条(Roche Diagnostics Corporation,Mannheim,Germany)上进行了克隆靶序列的Log稀释,用于定量样本拷贝数的校准器。GydF4y2Ba
PCR:EBVGydF4y2Ba
使用实时PCR筛选所有标本用于拷贝eBV BNRF 1基因的数量。使用的EBV引物和探针之前已发表,其中的第二组引物在这些内部设计为“在House”(H.J.O'neill)中设计,以制作嵌套的测定GydF4y2Ba22.GydF4y2Ba.所有引物和探针都列于补充表Si中,所有MasterMixes都列于补充表SII,所有循环条件都列于表SIII中。所针对的所有EBV拷贝编号已调整GAPDH副本编号。使用的归一化程序是EBV和GAPDH拷贝数之间的比率。所有标本还使用凝胶的巢式PCR测定法测试EBV,其质量控制并用于国家卫生服务(英国)临床标本的常规筛查。GydF4y2Ba
定量GydF4y2Ba
使用PCR 2.1-Topo®质粒载体(Invitrogen,Paisley,UK)制备每个测定靶标的克隆样品。通过测序来确认靶序列同一性(AlfExpress II DNA分析仪; Amersham Biosciences,Amersham,UK)并进行爆炸搜索,由此产生的GAPDH和EBV基因序列的结果> 99%同源性。GAPDH和EBV轻循环分析(图1GydF4y2Ba⇓GydF4y2Ba)每次反应的检测限为5和六份。GydF4y2Ba
分析GydF4y2Ba
通常分布式数据显示为平均值±GydF4y2BaSD.GydF4y2Ba.非参数数据被表示为中位数和胎面的范围。通常通过未配对的T比较分布的连续变量GydF4y2Ba-GydF4y2Ba测试;否则,曼 - 惠特尼U-Test评估了差异。对于离散变量,使用CHI平方测试进行报告和组的频率和百分比。使用Spearman的等级相关进行相关性。选择了5%的显着性水平。在多重比较的情况下,进行后勤回归。GydF4y2Ba
结果GydF4y2Ba
共有136名患者在COPD的急性加重期间招募了136名患者。此外,68名COPD患者在稳定时招募;在加剧和缓解期间,这些都在其中33种。此外,还研究了16名受到气流阻塞的受试者(表1)。组之间的雄性/母比分布没有显着差异(p = 0.24)。GAPDH存在于所有提取的样本中,证实痰样品在每种情况下含有细胞材料。通过定量检测EBV的所有病例被证实为使用巢式凝胶的PCR测定法为EBV阳性。GydF4y2Ba
eBV在患有COPD历史的患者中更频繁地看到(65(48%)阳性患者; P <0.05),而稳定(31(46%)阳性患者; P <0.05)比非偏心吸烟者,其中(6%)患者是阳性的(表2GydF4y2Ba⇓GydF4y2Ba)。ebv患者的COPD风险,吸烟者赋予了12.6的赔率比。GydF4y2Ba
EBV拷贝数分别测量为4.08和4.71在恶化和稳定状态下的每次反应(LOG)拷贝。此外,在被审查的患者组中,EBV拷贝数分别在恶化和稳定状态下测量为4.01和4.74拷贝(LOG)。GydF4y2Ba
eBV和吸烟历史检测(包装/吸烟状态)或肺功能(FEV)之间没有关系(FEVGydF4y2Ba1GydF4y2Ba%预测)在三组中的任何一个内。同样,没有看到EBV拷贝数和吸烟历史或肺功能之间的相关性。还检查了吸入的类固醇(在各个组中的总体和整体术语),并且所有基团的组合),但没有看到与EBV检测的关联。患者的肺功能在治疗加剧后显着改善,平均fevGydF4y2Ba1GydF4y2Ba从0.84-1.00 L增加,在通过金标准和eBV的检测中确定的气道疾病严重程度之间没有关联。EBV拷贝数与COPD样品中看到的上皮细胞数有显着相关(P <0.005)。正/负EBV检测率没有差异与EBV拷贝数相关。与来自非偏离吸烟者的吸烟者相比,来自COPD患者的痰液样品中有类似数量的上皮细胞。EBV拷贝数和总或差异白细胞计数之间没有看到相关的相关性。有证据表明有病毒持久性对后续测试(表3GydF4y2Ba⇓GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba⇓GydF4y2Ba)。在19例EBV阳性病例中,15名(占33例患者的58%的加剧COPD患者)对重复测试保持阳性。从测试EBV阳性到负数,4例也从测试EBV负数到积极的案例。在痰中的年龄和正EBV检测/拷贝数之间没有看到显着的相关性。GydF4y2Ba
讨论GydF4y2Ba
在本研究中,COPD患者鉴定了eBV的显着增加的发病率。EBV还发现稳定COPD的高拷贝数,但与加剧患者的比较没有显着差异。在加剧期间,当粘液和白细胞招募增加到气道时GydF4y2Ba23.GydF4y2Ba,EBV的副本减少了每次反应4.71至4.08份(LOG),但这在统计学上没有统计学意义(P = 0.09)。然而,这确实表明,EBV不像在恶化期间出现的潜在病毒,最终从气道清除,但它仍然存在。在两个时间点进行采样的那些在那些在那些在两次进行采样的患者中的EBV检测的变化表明病毒复制有一定程度的变化。GydF4y2Ba
EBV拷贝数与肺功能之间的相关性,由金标准或总/差异白细胞评估的疾病严重程度可能是研究规模的反映。本研究试图确定EBV气道感染和COPD的存在之间的关联。已经确定了一个关联,它是与上述变量分析潜在关联的单独问题。如前所述在先前的COPD人口研究中,需要非常大的样品编号,以便在与变量的差异相关的假设,例如肺功能。GydF4y2Ba
本研究的发现基于PCR测定结果;PCR直接检测病毒DNA,并基于假设如果可检测到病毒,则它代表主动产生的病毒。在临床环境中,EBV检测通常仅与相关疾病过程及其表现相关联GydF4y2Ba24.GydF4y2Ba.由于难以培养EBV,作为备用方法的文化是不可行的。本文所述的定量分子扩增现在被认为是用于检测复制病毒的金标准GydF4y2Ba25.GydF4y2Ba.EBV可以感染受试者导致急性,持续和潜在的病毒感染GydF4y2Ba26.GydF4y2Ba.EBV BCRF-1蛋白与人白细胞介素-10非常相似,具有抗炎作用。该特征可能导致病毒清除和病毒持久性降低GydF4y2Ba27.GydF4y2Ba.GydF4y2Ba
EBV也可能在COPD患者中具有病毒感染。该机制涉及增强病毒存活和受损的干扰素-γ宿主反应。EBV潜伏膜蛋白(LMP)1停止激活鼻咽癌(NPC)中的CD8 + T细胞,并与Fas配体和Caspase-3表达相关。显示LMP1以增强NPC中的存活和增殖相关信号GydF4y2Ba28.GydF4y2Ba.EBV特异性CD8(+)T细胞,其主要表达记忆表型,并不表达CXC趋化因子受体1GydF4y2Ba29.GydF4y2Ba.免疫球蛋白样转录物-2在健康患者的40-55%的EBV特异性CD8 T细胞中表达,其表达在慢性感染中的抗病毒CD8细胞上增加,抑制干扰素-γ的产生;在这样做时,这可能会干扰保护性CD8 T细胞功能GydF4y2Ba30.GydF4y2Ba.因此,慢性EBV感染可能导致干扰素-γ的产生受损,并且反过来,通过复发性病毒和细菌感染的特征在于降低的先天免疫应答。发现EBV拷贝数和上皮细胞计数之间的相关性支持eBV被气道上皮细胞脱落的假设,而不是用炎症细胞浸润进入气道。GydF4y2Ba
总之,在慢性阻塞性肺病患者的患者中经常检测到Epstein-Barr病毒,同时在具有正常肺活量测定的吸烟患者中罕见。这些研究结果表明,Epstein-Barr病毒可能与慢性阻塞性肺病的发育有关。GydF4y2Ba
兴趣表GydF4y2Ba
可以找到对这项研究的兴趣表GydF4y2Bawww.www.qdcxjkg.com/misc/statements.shtml.GydF4y2Ba
致谢GydF4y2Ba
作者承认英国贝尔法斯特贝尔法斯特员工和患者员工和患者的协助。GydF4y2Ba
脚注GydF4y2Ba
本文可以使用补充材料GydF4y2Bawww.www.qdcxjkg.com.GydF4y2Ba
- 已收到GydF4y2Ba2007年8月15日。GydF4y2Ba
- 公认GydF4y2Ba2008年2月7日。GydF4y2Ba
- ©ERS期刊有限公司GydF4y2Ba
参考文献GydF4y2Ba
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