摘要
一种耐药菌株结核分枝杆菌定义为一种不同于未与有关药物接触的野生菌株的紧密分布。
灵敏度试验采用绝对浓度法、电阻比法或比例法。基于比例法的假设是接种量大小存在显著差异,因此在无药培养基上的比例和含药培养基上的比例之间应该存在关联。这一假设没有得到对乙硫胺耐药菌株研究的支持。这表明,在无药培养基上比例的变化是由于杆菌在接种物中的结块,而不是由于杆菌数量的差异。
因此,比例法在药敏试验中引入了误差。虽然该方法可以产生可靠的结果,但它比最小抑菌浓度测定更费时,不应作为标准方法采用。
系列《结核病的争议问题》
A.托雷斯和J.卡米内罗编辑
在意甲排名第三
耐药性是什么意思?
与许多细菌种类不同,不同菌株的易感性通常变化很小结核分枝杆菌用于一线治疗的药物1,2.因此,可以考虑从未接触过药物的“野生”菌株的最低抑制浓度(MIC)分布,并根据该分布确定一个截止MIC,以区分属于该分布的“敏感”菌株和具有较高MIC的“耐药”菌株,这样它们就有机会(例如,<1%)属于该分布。由于野生菌株在敏感性上是如此一致,耐药菌株只能在患者治疗期间出现,因此,能够在给予单一治疗药物的患者中生长。这一定义的普遍采用避免了思想上的一些陷阱,例如“实验室”耐药性和“临床”耐药性之间存在差异的可能性。虽然它仍然是定义很少使用的药物耐药的最佳方法,例如用于备用药物治疗的药物,但在治疗前菌株中发生初级耐药的菌株的比例相当可观,因此有必要采用鉴别统计技术,测量区分两组菌株的最佳MIC,一组可能是敏感的(PS),并在治疗前获得,另一种主要是耐药(PR),可能含有相当高比例的耐药菌株。这是定义耐药性的两种基本方法3..
灵敏度试验方法
在20世纪60年代,由于实验室之间的结果不一致,对药物敏感性试验(DSTs)中使用的方法进行了大量讨论。世界卫生组织召开了两次国际会议,讨论这些技术及其用途4,5.这些会议报告了执行DSTs的三种不同方法:绝对浓度法、电阻比法和比例法。比例法背后的原理,由巴黎巴斯德研究所描述5,是这样的。在Lowenstein-Jensen培养基上用玻璃珠摇动生长,然后将不透明度调整为标准,制备标准接种体。当菌落形成单位(cfu)计数通过通常的连续稀释法获得这些悬浮液,有很大的变化从菌株到菌株。这被认为是DST结果变化的原因,因为一些试验接种了大量的接种物,这些接种物可以在较高的药物浓度下生长,而另一些试验接种了少量的接种物,只能在较低的药物浓度下生长。
在最初的报告中,关于在无药物培养基上的比例与在含药物培养基上的生长之间存在强烈关联的假设受到了质疑,并且只在对乙硫酰胺的试验方法进行比较时进行了一次严格的审查6.准确的乙硫酰胺测试一直很难获得,部分原因是与耐药性相关的mic变化很小,部分原因是这种药物是可热的。因此,PS和PR菌株的分布没有很好地分开(图1)⇓).在本研究中,接种物的制备方法是将生长状况评估为4mg,用玻璃珠摇匀,得到标准接种物。然后通过接种悬浮液的连续稀释进行试验,以便计算mic、电阻比和比例。根据巴斯德研究所的假设5,在无药培养基上的cfu计数和10µg·mL的MIC之间应该有很强的相关性−1而无药cfu计数与比例之间不应存在关联。这与实际发现相反(图2)⇓).然而,这些发现与一种假设是一致的,即在无药物培养基上cfu计数的变化几乎完全是由于悬浮液中杆菌的结块量。查看一个分散良好和团块悬浮的测试结果的图表表示(图3)⇓),可以观察到,在无药培养基上两倍的计数差异并没有伴随在含药培养基上生长的耐药生物数量的任何变化,这表明无药计数与MIC之间没有关联,而在块状和分散接种体之间无药计数减少两倍的同时,在含药培养基上的比例增加两倍。这些发现清楚地表明,设计比例检验所依据的假设是错误的,使用比例实际上会带来误差。当两种方法进行比较时,结合比例定义电阻≥50%生长在10µg·mL上−1或20µg·mL≥10%−177种PR培养物中43%显示耐药性,而标准接种物MIC显示48%。通过这两种方法,140个PS培养物中只有一个被指定为耐药。
因此,如果有的话,比例定义的效率比MIC方法略低。电阻比的效率要低得多,因为它们是通过两次滴定计算的,一次是测试菌株,另一次是菌株H37Rv。结果受两种滴定方法误差的影响。
备选敏感性试验方法结论
在实践中,比例法似乎在有经验的人手中产生了相当准确的结果。然而,有两个原因,为什么它永远不应该被采纳为一个标准程序,如下所示。1)比例测试所花费的时间远远大于MIC测试,因为必须建立连续稀释和计数菌落。2)耐药性标准是根据巴黎巴斯德研究所多年前开展的工作(从未详细介绍)确定的,并且没有检查这些定义是否适用于实验室,通常是在使用该测试的发展中国家。虽然对许多药物的测试相当稳定,但对其他药物,特别是链霉素和其他氨基糖苷类药物,则受到培养过程中氧气获取和浓缩方法等因素的影响。这意味着这些测试大大增加了发展中国家实验室经常发现的积压工作,并产生可靠性不确定的结果。目前的作者认为,现在是时候考虑是否应该继续将比例测试视为世卫组织的标准测试,以及是否可以用至少同样准确的更简单的测试来取代它们。
药物敏感性试验的建议
建议使用Lowenstein-Jensen培养基进行测试的实验室采用以下由英国医学研究委员会基于效率和安全考虑而标准化的程序81)使用螺旋盖28ml瓶进行培养和敏感性试验,主要原因是其掉在地上时会弹跳,而玻璃试管会破裂,产生重大危害;2)使用设计良好的浓缩器,能够在85°C下均匀加热瓶(或管)60分钟。热风炉应避免通过支撑介质管的金属棒,而不是通过空气,不均匀地散发热量。MIC DSTs应与产生~ 1×10的接种物一起建立5每个斜坡加一个循环的Cfu,培养4周后读试验。考虑到这些条件,对每个斜坡使用单一含药斜坡的试验可以获得可靠的结果,尽管建议对几乎同时或重复获得的两个菌株进行试验。筛选试验的临界浓度为0.2µg·mL−1异烟肼,32µg·mL−1利福平,16µg·mL−1链霉素和2.8µg·mL−1乙胺丁醇。如果>20菌落在这些浓度下生长,则认为该菌株具有耐药性。然而,通过滴定预处理菌株的小样本来检查链霉素的临界浓度是明智的,记住双氢链霉素更稳定,但也更难获得。在液体或固体介质中滴定MIC的快速测试可能与这种标准测试一样准确。事实上,即使是对低活性的储备药物进行试验,它们似乎也和比例试验一样有效9.
1%比例定义的局限性
其他类型的测试声称使用比例方法10但是,将耐药性定义为,例如,1%的菌株在特定药物浓度下生长的能力,实际上相当于用小接种量进行MIC测试。除了吡嗪酰胺试验外,没有证据表明接种量的减少会增加试验区分敏感菌株和耐药菌株的能力,吡嗪酰胺试验与DSTs对其他药物的表现完全不同11.对比例法提出的批评并不适用于BacTec法,因为它不太可能受到结块的影响,但是,同样,在试验中将接种物稀释100倍的方法似乎没有什么合理性。如果比例测试的目的是找出在异质菌株中有多少比例的微生物具有耐药性,而有多少比例的微生物仍然敏感,那么最好只在含有临界药物浓度的斜坡上建立一个稀释范围,而不是根据在无药物培养基上的稀释计算一个不准确的比例。
药物敏感性试验的预后价值
药物敏感性试验结果的预后价值取决于药物在治疗期间对患者使用的药物方案的杀菌作用。在8个月的方案中,在继续阶段使用噻嗪酮或乙胺丁醇与异烟肼,异烟肼是继续阶段的主要消毒药物。因此,最初耐药患者的反应明显低于敏感生物患者的反应(表1)⇓).相比之下,当继续阶段是利福平和异烟肼时,利福平在这一阶段完成了所有的实际杀伤。因此,对异烟肼的初始抗性不影响疗效(表2)⇓).在任何一种情况下,异烟肼在前2天内可使痰中活菌数量减少10倍12,但在利福平和吡嗪酰胺导致死亡的初始阶段没有进一步的作用13.最初2天内的杀灭不足以影响对治疗的最终反应。在标准方案中,没有关于吡嗪酰胺耐药的预后影响的信息,因为在临床试验中很少进行吡嗪酰胺的药敏试验。仅对利福平耐药的情况很少见,但异烟肼仍然可用,而且反应通常很好。当对利福平和异烟肼同时耐药时(多重耐药疾病),反应基本较差,尽管可能会发生一些反应,这可能是因为吡嗪酰胺和乙胺丁醇在初始阶段是活跃的。尚无关于乙胺丁醇耐药对预后影响的资料。因为乙胺丁醇可能会干扰该方案中其他药物的杀菌活性12,13在美国,对它的耐药性可能会略微改善反应。
脚注
本系列以前的文章:第1篇:Cardona P-J, Ruiz-Manzano j结核分枝杆菌潜在的细菌。呼吸呼吸J2004;24: 1044 - 1051。2号:感染的年风险结核分枝杆菌.呼吸呼吸J2005;25日:181 - 185。
- 收到了2004年6月23日。
- 接受2004年7月13日。
- ©ERS期刊有限公司