摘要
母亲在怀孕期间吸烟对胎儿发育有许多有害影响,其中之一是持久性肺动脉高压的发病率较高。最近对肺血管壁细胞上的烟碱乙酰胆碱受体(nAChR)的鉴定表明,母亲在怀孕期间吸烟可能导致胎儿肺血管的形态改变。
用尼古丁(1 mg·kg-1·天-1)从妊娠第26-134天(足月:165天)通过皮下渗透泵输送。134天胎猴的肺切片用于形态计量分析,原位杂交和免疫组化染色。
烟碱治疗后,气道相关血管的全壁和外膜厚度显著增加。尼古丁暴露显著增加了所有AAV患者的外膜I和III型胶原mRNA和蛋白,但中膜没有。相比之下,弹性蛋白水平显著下降。α7 nAChR在AAV成纤维细胞中表达胶原mRNA。在内皮细胞和成纤维细胞中也检测到乙酰胆碱乙酰转移酶,它是合成乙酰胆碱的酶,是α 7nachr的配体。
这些发现表明,在怀孕期间吸烟,尼古丁通过胎盘运输,并直接与肺血管中的尼古丁乙酰胆碱受体相互作用,改变结缔组织的表达,从而产生血管结构的改变。
这项研究得到了美国国立卫生研究院的资助。
尽管有丰富的证据表明孕妇在妊娠期间的母亲吸烟会对胎儿产生不利影响,所以通过增加早产输送的发病率,出生体重低,新生儿发病率和死亡率增加1-3.,12.5%的妇女在怀孕期间继续吸烟4.近年来,流行病学研究报告婴儿肺功能异常5.那6.谁在产前就暴露在烟草烟雾中,这种变化会一直持续到青春期7..这些发现表明,产前暴露于尼古丁或香烟烟雾会导致发育中的肺发生结构变化。这在动物研究中得到了证实,在动物研究中发现,产前尼古丁或香烟烟雾会改变出生时的肺结构8.-10.这反过来表明,产前尼古丁暴露也可能导致肺血管的改变。与此相符,布瓦等.11是否发现在怀孕期间吸烟的母亲所生的婴儿和被动吸烟母亲所生的婴儿中持久性肺动脉高压的发病率都更高
为提出产前尼古丁暴露和肺血管改变之间的联系提供了一个逻辑基础,目前的作者先前已经证明,在胎儿猴的肺中,特别是在气道中,α7尼古丁乙酰胆碱受体(nAChR)的丰富表达,也有报道称,产前尼古丁暴露显著上调了气道和血管周围成纤维细胞的α 7nachr8.那12.
鉴于肺血管和气道周围的成纤维细胞是合成细胞外基质蛋白的原代细胞,且成纤维细胞表达α7 nAChR,产前尼古丁暴露可能会改变发育中肺中的胶原表达。因此,本文报道的实验的主要重点是确定研究表明,母亲尼古丁暴露是否会改变胎儿肺血管壁的形态尺寸,并开始确定这些变化背后的机制。这些研究将表明产前尼古丁暴露是否会改变肺血管系统,并将提出一种机制,通过该机制,产前尼古丁暴露的影响可能会在出生后持续.
材料和方法
实验设计
如前所述8.,timedpregnant猴子被随机分配到烟碱治疗组或对照组(每组三只动物)。在妊娠第26天,Alzet 2ML4渗透微型泵(ALZA corp.,Palo Alto,CA,USA)注入溶解于生理盐水中的酒石酸尼古丁(Sigma,St.Louis,USA),以产生1 镁-1·千克·-1每天体重皮下浸泡在沿侧面的区域中,并每4周改变。母亲可免费获得食物和水,并经常称重。胎儿猴子在怀孕的第134天通过剖宫产分娩,并立即通过戊巴比妥安乐死。肺被加工用于形态格术,免疫组化和原位杂交如前所述8..关于产前尼古丁暴露对这些动物的其他方面的影响的描述此前已发表8.那12.所有动物手术均由俄勒冈健康和科学大学动物护理和使用委员会批准,并符合所有适用的法规。
免疫组织化学染色
如前所述,使用一级抗体对5微米切片进行免疫染色8.那12.此外,兔子多克隆碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和兔子转化生长因子(TGF‐β1)均来自Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)。
原位杂交
原位杂交和双免疫组化原位如前所述进行杂交8.那12.先前描述了I型胶原、III型胶原和弹性蛋白恒河猴探针的产生8..为了生成恒河鼠TGF - β1和bFGF的互补DNA (cDNA)探针,使用5 '和3 '引物atcgcgcccatctagttttc和CGGTCGCGGGTGCTGTTGTA, tgccagcattgcccgagat和agcagacattggaagaaagtat从胎猴肺中扩增cDNA。亚克隆适当大小的cDNA带并进行测序。序列已保存在Genbank中,并附有相应的登录号AF251269和AF251270.
双α‐白果毒素结合和免疫组化
利用α - bungarotoxin (α bgt)定位能够结合配体的nAChR。将Bouin固定剂固定的5微米肺块切片脱链,并在三次缓冲生理盐水(TBS)中再水化20分钟。室温下结合缓冲液(TBS+0.2%牛血清白蛋白+2%非免疫马血清)孵育1 h后,切片与一抗在4℃孵育过夜。用TBS冲洗后,切片用单独的结合缓冲液或含有5 mM尼古丁的缓冲液在室温下处理1小时。切片用生物素化的抗鼠或抗兔抗血清在室温下孵育。冲洗后,切片与15 nM Texas Red conjugated αBGT (Molecular Probes, Eugene, OR, USA)和亲和素偶联抗鼠抗体(Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA, USA)的混合物在37℃下孵育3小时。
细胞动力学
采用增殖细胞核抗原(PCNA)免疫染色法分别测定内皮细胞和所有细胞在中膜和外膜的增殖指数。计数PCNA阳性细胞和阴性细胞,并以PCNA阳性细胞百分比计算各组标记指数。
形态测量和图像分析
图像分析如前所述8..在每次分析中,每只动物使用4到5个街区,从左肺的每个叶使用两个或更多的代表性街区。只包括在横断面上切割的血管,而切向断面的血管不包括在内。收集了来自所有动物(对照或尼古丁)所有血管的数据。在气道软骨相关血管(CAAV)中,在外膜和中膜均可见胶原mRNA和蛋白表达,分别测量每个腔室,两者之和表示总壁值。在膜性气道相关血管(MAAV)中,由于较小的气道相关血管中膜和外膜边界没有很好地分界,因此整个血管壁都包含胶原和弹性蛋白mRNA和蛋白的表达。原位杂交分析如前所述,通过计数颗粒并除以适当的面积,以单位内皮基底膜粒数或单位中膜或外膜粒数表示。
利用三色染色图像确定血管壁尺寸。总壁厚包括内膜、中层和外膜层。分别测量中膜和外膜的面积,并数字化相应的内皮基膜长度。血管壁面积表示为每单位长度的内皮细胞心肌基底膜(EMB)、苏木精和伊红染色切片用于测量右心室和左心室壁厚度。
统计分析
使用Number Crunching统计软件(Iowa, CA, USA)进行统计分析。除非另有说明,值用平均值±sem表示。组间正态分布方差相等检验后,采用非配对检验确定处理组与对照组的均数差异。如果组间方差不相等,则使用AspinWelch不相等方差ttest检验显著性。
结果
产前尼古丁暴露对母体体重增加或食物消耗没有显著影响。产前尼古丁暴露对这些动物胎儿身体和器官生长的影响此前已有报道8.那12.剖宫产时(妊娠134天)羊水尼古丁水平为15.5±3.8 ng·mL-1(95 nmol·L)-1),这相当于在怀孕期间观察到的重度吸烟者的水平(>每天1包)13.
血管墙尺寸和细胞因子学
胎儿期尼古丁暴露后肺血管壁尺寸增加。尼古丁治疗后,胎儿CAAV每单位EBM的总壁面积(包括内膜、中膜和外膜)增加了30% (p<0.01)(图1a)⇓).尼古丁暴露后中膜无明显变化,但外膜厚度显著增加46% (p<0.001)。MAAV单位EBM的总壁面积增加了28% (p=0.005),终末支气管相关血管(TBV)增加了24% (p=0.011;图1⇓).单位EBM血管壁厚度和气道直径的线性回归分析也显示,尼古丁治疗组和对照组之间存在显著差异(图1b)⇓).尼古丁处理的胎儿内皮层和外膜细胞的标记指数显著升高(图1c)⇓).中间层细胞的标记指数没有显著变化。各组之间的心室壁厚度(右侧或左侧)没有显著变化(数据未显示)。
Ⅰ型胶原表达
原位杂交显示外膜细胞中ⅰ型胶原mRNA表达强烈,而平滑肌和内皮细胞中表达较少(图2a-d)⇓).类似地,通过免疫组织化学评估的胶原蛋白表达主要被限制在含有患有患者层(图2E,F.⇓).如图2所示⇓,在产前尼古丁暴露后,胶原蛋白I mRNA和蛋白表达明显增加。
在产前尼古丁暴露后,每单位EBM的I型胶原mRNA表达显著增加(64%),主要是在外膜(80%),而中膜没有变化(图3a)⇓)外膜单位壁面积的I型胶原mRNA表达也显著增加(图。 3b⇓).在非caav中,I型胶原mRNA每单位EBM增加111%,尼古丁处理组每单位面积增加75%(图3a, b)⇓).与mRNA表达类似,CAAV壁(外膜64%,中膜71%)单位EBM I型胶原免疫组化染色强度显著增加(66%);图3 c⇓).尼古丁治疗也显著增加了MAAV和终末气道相关血管中的I型胶原免疫染色强度(图3c, d)⇓).
ⅲ型胶原表达
在产前尼古丁暴露后,每单位EBM CAAV总壁中ⅲ型胶原mRNA的表达增加了50% (p=0.02)。尼古丁处理后,每单位EBM的外膜层减少67%,每单位壁面积增加50%(图4a, b⇓).在非caav中,单位EBM(74%)和单位面积(49%)的血管壁颗粒数也显著增加(图4a, b)⇓).免疫组化分析显示尼古丁暴露胎儿肺CAAV中ⅲ型胶原染色强度显著增加。在外膜中,单位EBM染色强度明显更高(37%)(图4c)⇓),但单位面积强度保持不变。与CAAV相比,MAAV和TBV壁的增加幅度较大。同样,在TBV中,产前接触尼古丁后,每单位EBM的ⅲ型胶原蛋白增加了85%,每单位面积增加了45%(图4c, d)⇓).
弹性蛋白
弹性蛋白mRNA标记主要表达于中膜(图5a-d)⇓).在CAAV中,产前尼古丁暴露增加了每单位EBM和每单位壁面积的弹性蛋白mRNA表达(分别为35%和30%)⇓6.⇓).尼古丁组外膜每单位EBM的弹性蛋白mRNA表达也显著升高(47%)(图6a, b)⇓).在非caav(膜性和末端气道)中,单位EBM和单位壁面积的银粒含量也显著增加(分别为73%和45%;图6 a, b⇓).
与尼古丁诱导的弹性蛋白mRNA,免疫组织化学染色的增加标记对比(图5E,F.⇑)尼古丁治疗后弹性蛋白沉积显著减少。在产前尼古丁暴露后,CAAV中膜单位壁面积的弹性蛋白免疫染色强度降低(分别为23%和32%;图。 6c,d⇑).在非caav中,弹性蛋白表达也显著降低(图6c, d)⇑).
胶原蛋白的共定位与α7烟碱乙酰胆碱受体的表达
如果尼古丁直接作用于成纤维细胞以刺激胶原蛋白的表达,那么在血管成纤维细胞中应该存在nAChR。如图7所示⇓,使用Texasred标记的αbgt的共聚焦显微镜,α7nachr的特定配体,在Tunica介质中邻近肌腱阳性平滑肌细胞邻近的Tunica Addrantia中的功能性α7nachr的强烈表达。用VimentIn的双标记,一种主要在去世内标记成纤维细胞的标记,表明表达α7的细胞最有可能成纤维细胞(数据未显示)。在平滑肌层中也可以看出痕量的αBGT结合(图7A⇓).免疫组化双染色检测α 7nachr和原位在外膜中,胶原mRNA与胶原表达细胞共定位的α 7nachr表达相似(图7b)⇓).
胆碱乙酰转移酶在血管非神经细胞中的表达
血管外膜中丰富的nAChR表达提出了关于乙酰胆碱来源的问题,乙酰胆碱是nAChR的配体。为了确定这一点,我们对制造乙酰胆碱的酶ChAT进行了免疫组织化学。ChAT的双重荧光免疫染色和内皮细胞标记物因子VIII证明了内皮细胞中的ChAT表达上皮细胞(图。 7c⇑)ChAT免疫染色也出现在外膜细胞中(图。 7d⇑).
肿瘤生长因子β1和碱性成纤维细胞生长因子mRNA的表达
经过原位杂交分析发现,在对照组和尼古丁处理的胎儿之间,气道相关血管壁TGF‐β1和bFGF的mRNA表达没有明显差异(数据未显示)。通过免疫组化,尼古丁治疗后,TGF‐β1蛋白表达减少或不变,而bFGF在外膜中表达不变(图8)⇓).
讨论
本研究的目的是开始确定怀孕期间孕产妇吸烟可能导致婴儿的肺血管动力学改变的机制11那14那15.在本研究中,分娩时羊水中尼古丁的平均水平与重度人类吸烟者羊水中观察到的尼古丁水平大致相当13.研究对象出生在妊娠134天(165天),也就是人类妊娠32周。这是肺发育的关键阶段,主要血管和气道已经发育,终末气隙和终末血管开始发育。
目前的作者此前曾报道,产前尼古丁暴露会抑制胎儿猴的肺生长8.那12.尽管对肺长的整体抑制了肺部增长,所以现在的作者报告说,在尼古丁暴露胎儿中,通气通道相关血管壁的厚度显着增加。在软骨通气道相关的船舶中,在Tunica Adventia和Media可以清楚地划定的情况下,外膜厚度却没有显着增加,但不是Tunica Media。在暴露于卷烟烟雾的成人大鼠中,据报道了类似的观察结果2或3个月,其中Adventitia和Intima面积增加肺部血管>450μm,但没有相关的媒体变化16.大鼠外膜成纤维细胞体积比例增加,中膜平滑肌细胞体积比例减少。类似地,目前的作者发现,由增殖标记物确定的标记指数在外膜细胞中显著增加,但在中间层细胞中略有下降。Heeschen等17同样表明尼古丁刺激内皮细胞增殖。显然,这表明尼古丁是吸烟对血管结缔组织影响的关键中介。肺血管壁增厚也与Elliot的发现一致等18因母亲在怀孕期间吸烟而死于猝死综合征的婴儿气道壁厚度增加。没有测量到的右心室肥厚表明尼古丁暴露组的肺动脉压没有变化。
产前尼古丁暴露在尼古丁暴露后的每单位长度和每单位面积的单位长度和每单位面积的血管通相关血管中增加胶原蛋白I和III mRNA表达。虽然每单位长度的内皮胶原的增加可以反映增加的容器壁面积,但是每单位面积的增加明显表明mRNA和蛋白质的增加。如图7所示⇑通过免疫组织化学,原位杂交,配体结合技术;成纤维细胞,胶原蛋白在外膜中的主要来源,表达丰富的α7nachr。因此,尼古丁,α7nachr对成纤维细胞的含有明显的路径,并在去世中增加胶原蛋白。在平滑肌中看到α7nACHR的弱表达,与在Tunica媒体中缺乏缺乏影响的缺乏症状。
在胶原mRNA水平升高的同时,血管壁I型和III型胶原蛋白含量也明显升高。单位内皮基底膜和单位面积的I型胶原蛋白染色均增加,表明妊娠期间暴露于尼古丁的胎儿中膜和外膜均有I型胶原蛋白的显著积累。尼古丁的作用不仅局限于大血管,在烟碱处理组中,与膜和终末气道相关的血管中I型和III型胶原的数量也显著增加。Melkonian等19研究发现,在治疗4天后,主流和侧流香烟烟雾溶液都改变了鸡绒毛膜的血管形态,并增加了I型和III型胶原蛋白和纤维连接蛋白(仅侧流)的数量。GilAcosta等20.在尼古丁处理的小鼠成纤维细胞中,也观察到I型胶原和III型胶原显著增加。外膜胶原的增加也可能导致血管顺应性降低。
持票人等11和Muraskas等15有报道称,母亲在怀孕期间吸烟或被动接触香烟烟雾的婴儿中,持续性肺动脉高压的发生率更高,这表明母亲吸烟是新生儿持续性肺动脉高压的一个重要危险因素。I型和III型胶原的增加这里观察到的尼古丁沉积同样发生在烟雾暴露的婴儿身上,与持续性肺动脉高压有关的问题也有待确定。由于怀孕期间吸烟是低出生体重婴儿的主要原因,因此也可能是细胞壁胶原表达和细胞数的改变导致正如巴克所提出的,产前尼古丁暴露也可能是低出生体重婴儿心血管疾病发病率较高的原因之一21.
Elastin mRNA表达每单位长度的内皮和每单位面积的长度显着增加,但令人惊讶的是免疫染色强度显着降低。这种缺乏含有尼古丁暴露后培养基厚度的变化一致的缺乏。增加的弹性蛋白mRNA表达和降低的肺部血管壁中的弹性蛋白蛋白表达之间的视差表明,尼古丁或其代谢物可以调节前剖析活动,如mRNA降解,交联抑制或增加的降解。在出生后生命的第7-21天暴露于尼古丁的大鼠中也显示出弹性组织纤维的降低22在成年人中,吸烟也会增加弹性蛋白酶的产生23那24以及它的活性,但这种增加是否会扰乱胎儿发育期间的弹性蛋白平衡仍有待探索。
如果尼古丁是通过与胶原蛋白产生细胞上的烟碱受体相互作用产生作用的,那么烟碱受体的内源性配体乙酰胆碱的来源是什么?传统上乙酰胆碱被认为完全来自神经元,但尽管平滑肌有丰富的神经支配,但adven的神经支配却很少血管周围的软骨层25那26.如图7所示⇑然而,在内皮细胞和外膜成纤维细胞中均有明显的乙酰胆碱合成酶ChAT的表达。这表明,在发育中的肺中,乙酰胆碱是由非神经元元件局部合成的,作为旁分泌激素。和这个一致,威斯勒等.27Harberberg已经描述了非神经元乙酰胆碱在整个肺部的广泛表达等28已观察到猪肺动脉内皮细胞和川岛的ChAT等29研究人员测量了培养的牛动脉内皮细胞释放的乙酰胆碱。这表明,产前尼古丁暴露对肺血管胶原表达的影响来自于局部旁分泌胆碱能信号通路的调节。
进一步支持尼古丁对成纤维细胞的直接作用,没有观察到TGF‐β1或bFGF的变化。这与牛主动脉内皮细胞中尼古丁或香烟提取物治疗后TGF‐β分泌减少或不变的研究一致30.,气道上皮细胞31.有趣的是,这与卡蒂的结果不同等32他发现尼古丁增加了人体血管平滑肌细胞中的bFGF。然而,这些细胞是从死后尸体的动脉中提取的,因此可能反映了尼古丁对成人影响的差异对胎儿。
总之,尼古丁很容易通过胎盘运输,达到足以与肺血管壁非神经元细胞上表达的尼古丁受体直接相互作用的水平。尼古丁与成纤维细胞上的尼古丁受体相互作用导致胶原蛋白基因表达增加,并改变结缔组织蛋白平衡。这种结缔组织蛋白通路调控的变化可能导致怀孕期间吸烟的母亲的胎儿肺血管力学特性的改变。这些发现进一步支持了在怀孕期间进行积极咨询和积极禁烟运动的必要性。
致谢
作者要感谢俄勒冈国家灵长类动物研究中心动物资源部门的J. Fanton, D. Jacob和R. Simons在动物手术和定时怀孕方面提供的帮助。作者还想感谢ONPRC分子生物学核心的Y. Jia在准备互补DNA探针方面的帮助,以及宾夕法尼亚大学的J. Lindstrom慷慨捐赠的烟碱受体抗体。
- 收到了2003年6月18日。
- 公认2004年1月26日。
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