摘要
吸烟通过未知的机制产生肺动脉高压(PHT)。在动物模型中,急性烟雾暴露可诱导毗邻肺泡管的小动脉细胞增殖,而慢性暴露可导致这些血管的肌肉化,其变化与PHT的发展有关。研究表明丝氨酸弹性蛋白酶抑制剂可预防实验性野百合碱诱导的PHT。这项研究检验了它们是否也可以预防吸烟引起的肺血管疾病。
豚鼠暴露在香烟烟雾或空气中6个月。一些动物也接受了ZD0892,一种口服活性,合成,选择性丝氨酸弹性蛋白酶抑制剂。通过组织学切片的形态计量学分析和增殖细胞核抗原染色的血管细胞增殖来确定肌肉化的小肺动脉的百分比。
暴露在烟雾中的动物的血管细胞增殖显著增加,完全肌肉化的小血管的百分比增加了4倍。细胞增殖指数与肌肉化指数相关。在用ZD0892处理的动物中,完全肌肉化的血管数量减少了50%,细胞增殖减少了61%。
这些数据表明,吸烟诱导的细胞增殖导致肺动脉肌肉化。丝氨酸弹性蛋白酶抑制剂似乎能够减少细胞增殖和血管重塑。
这项研究得到了阿斯利康(瑞典隆德)研发部门的支持,并获得了加拿大卫生研究院MOP42539的资助。
肺动脉高压(PHT)常见于慢性阻塞性肺病(COPD)患者。1这是一个不祥的发现,因为它已被证明是死亡率的一个重要预测指标2.吸烟者体内PHT的机制基础尚不清楚。尽管常说PHT是肺气肿性肺破坏继发血管床丧失的结果,但临床-病理-流行病学研究,包括作者实验室的工作3.,表明这并不一定是真的。同样地,尽管低氧性血管收缩导致慢性阻塞性肺病PHT的观点构成了两项临床试验的基础,但对这些患者肺部的分析显示一致的血管异常,这不能解释对运动的不同生理反应,也不能解释发现的血管对氧气的反应4.最近在国家肺气肿治疗试验中对患者进行的一项研究得出结论,PHT可能与缺氧以外的因素有关5.
作者已经建立了一个豚鼠模型,在慢性暴露于香烟烟雾后,在肺气肿发生之前,发生肺动脉压升高和血管重塑6.使用这个模型,作者已经证明PHT不能直接归因于缺氧或肺气肿性肺破坏3.,6,但肺血管和气道似乎都有动态改变,导致PHT和气流阻塞都是独立的过程7.在这个模型中,急性暴露于香烟烟雾会引起气道和肺血管的增殖反应。在所有尺寸的容器中,这个过程是不一样的;与位于气道附近的肌肉血管相比,毗邻肺泡导管的小动脉/小动脉在内皮细胞和血管壁间室中都有更大的反应6.这种急性反应似乎涉及或由氧化剂引起,氧化剂也被认为在培养中刺激平滑肌有丝分裂8,9因为抗氧化剂可以部分阻断,但不能完全阻断10.然而,其他介质,如内皮素,也似乎在增殖反应中发挥重要作用11.
当豚鼠长期暴露于香烟烟雾≥4个月时,血管细胞增殖在整个期间持续进行12,这些动物在毗邻肺泡管的动脉和小动脉上出现了明显的肌肉化,这些血管中可以识别出双重弹性层(肌肉化的标志)的比例是这些血管的三倍多。这些结构变化伴随着PHT的生理证据6.
考恩和同事13,14丝氨酸弹性蛋白酶或基质金属蛋白酶抑制剂可以预防或逆转野百合碱诱导的大鼠肺血管病理生理学的进展。这些研究人员使用了ZD0892,一种口服活性,选择性丝氨酸弹性蛋白酶抑制剂,它对中性粒细胞弹性蛋白酶有一定的特异性,尽管它抑制其他丝氨酸蛋白酶,如猪胰腺弹性蛋白酶,在较小程度上15.ZD0892似乎也能抑制在野百合碱诱导的高血压中表达的内源性血管弹性蛋白酶13.作者先前已经证明,ZD0892部分改善了豚鼠吸烟引起的肺气肿16.本研究探讨了ZD0892是否也会影响香烟烟雾诱导的肺小腺泡血管的肌肉化和细胞增殖。
方法
烟雾暴露方案
研究人员使用了之前报道的一项研究的档案组织,该研究检查了弹性蛋白酶抑制剂ZD0892对吸烟后肺气肿发展的影响16.这里简要介绍的研究方案是由英属哥伦比亚大学批准的。harley -strain豚鼠,最初重约350克,分别来自Charles River (Montreal, Canada)和AstraZeneca (Lund, Sweden)。烟雾暴露是通过仅鼻腔暴露系统进行的。这种接触足以维持5-10%的羧血红蛋白,这一值与人类慢性吸烟者的值相似。研究香烟(2R1)来自美国肯塔基大学。每组6只豚鼠,每日(每周5天)进行如下治疗:1)假烟6个月;2)吸烟6个月;3)吸烟加ZD0892 6个月(这里标识为ZD6);4)只吸烟4个月,然后吸烟加ZD2个月(确定为ZD2)。 One animal in the ZD2 group died a nonrespiratory death; all other groups consisted of six animals at the time of sacrifice.
ZD0892 (10 mg·kg−1)每天灌胃两次。之所以选择这个剂量,是因为作者先前的一项研究表明,它能够消除豚鼠支气管肺泡灌洗液中香烟烟雾引起的急性肺部炎症16.
6个月后,使用过量的氨基甲酸乙酯麻醉处死豚鼠,然后放血。取肺,肺叶用10%中性缓冲福尔马林在恒压25cmh下充气24小时2O.在此之后,在矢状面对每个肺进行连续切片,并根据情况随机切片进行石蜡包埋、切片和染色。所有幻灯片都进行了编码以防止偏见。
肌肉化血管的测定
为了确定肺泡管附近肌肉化血管的百分比,组织学切片用单克隆小鼠抗人α‐平滑肌动蛋白(代码M0851;DAKO,密西沙加,加拿大),稀释1:200。石蜡载玻片首先在60°C下烘烤30分钟,然后放入水中,用磷酸盐缓冲盐水(PBS)漂洗,然后胰蛋白酶化12分钟,在水中洗涤,并用95%酒精漂洗。然后将载玻片置于95%酒精和双氧水的混合物中20分钟,用PBS冲洗,并用封闭试剂处理20分钟。然后将载玻片排干,在4°C下用一抗处理过夜。用PBS冲洗后,涂抹二抗(马抗鼠)60分钟,再用PBS冲洗载玻片,涂抹小鼠检测器复合物60分钟。PBS冲洗后,氨基乙基咔唑底物敷20分钟,载玻片用水冲洗,用苏木精轻微反染色。以一抗遗漏作为阴性对照。这种免疫组化方法比评价血管双弹性层更敏感,更容易解释。检查所有与肺泡管相邻的小血管(直径50-150µm)。 Those vessels that had a distinct muscle band extending entirely around the vessel circumference (as determined by smooth muscle actin staining) were considered muscularised, while those vessels with only a partial band were considered nonmuscularised.
细胞增殖的测定
以上免疫组化方法与多克隆抗体(1:100稀释;DAKO, Mississauga,加拿大)对抗增殖细胞核抗原(PCNA)。总共25个随机放大200倍的场(每个场0.64 mm2包括肺泡管和相关小血管的区域)。每条血管1000倍放大,计数染色核数,阳性核数表示为占总核数的百分比。图1⇓演示选择字段和代表性容器。
中性粒细胞浸润测定
尽管作者先前的一项研究表明,灌洗多形核白细胞(PMN)的数量因ZD0892的管理而减少16,作者希望确定是否有任何PMN可以在外膜或小血管壁识别。作者未能找到一种与豚鼠髓过氧化物酶交叉反应的抗体。因此,我们采用非特异性染色的方法,即在石蜡切片烘烤后直接涂上二氨基联苯胺cedure,其中所有能够氧化底物的细胞染色为阳性。阳性染色和核形态学结合鉴定PMN。
统计数据
肌肉化血管的百分比呈正态分布,使用方差分析(ANOVA),对使用Bonferroni方法进行多次比较进行适当的校正,用于比较各组。使用非参数Kolmogorov-Smirnov检验来确定各组间增殖细胞的分布是否不同,因为细胞增殖数据明显倾斜。在首次通过影响试验确定没有单一动物影响数据后,构建累积分布曲线以使数据可视化。由于PCNA数据的中值呈正态分布,因此使用Pearson相关系数来寻找肌肉化血管百分比与每只动物每只血管增殖细胞核百分比的中值之间的相关性。
结果
肌层血管
每组动物平均检查82±10根血管。每只动物肌肉化血管的计算平均值如图2所示⇓.6个月的烟雾暴露使肌肉化血管的比例增加了大约4倍(p<0.001)。与只接触烟雾的动物相比,ZD6组动物的肌肉血管减少了50% (p=0.003),但与对照组相比仍有增加的百分比(p<0.05)。ZD2组的动物与只接触烟雾的组没有区别。
细胞增殖
细胞增殖数据如图3所示⇓由单个数据点形成的累积分布图。6个月的烟雾暴露使对照动物计算的累积分布曲线明显向右移动(p<0.001),表明动脉壁细胞增殖增加。ZD6组的分布介于对照组和吸烟暴露组之间,与两者有显著差异(p<0.001)。因此,使用ZD0892治疗整个吸烟暴露期提供了一定程度的保护。ZD2组的细胞增殖分布曲线与仅吸烟组没有显著差异,这一发现表明,在吸烟暴露过程中较晚开始治疗是没有保护作用的。作为进一步的检验,使用方差分析(ANOVA)对每个病例(作为一个组正态分布)的中值进行检验,并在总数据集上确认上述分析;不吸烟者与吸烟组和ZD2组(p<0.001)有显著差异(p<0.001),但与ZD6组无显著差异。烟雾暴露组与ZD6组差异有统计学意义(p<0.01),但与ZD2组差异无统计学意义。
百分比阳性核的中位数的平均值(即。对照组的增殖细胞数为1.8±1.1,而吸烟组为15.0±6.1,ZD6组为5.8±4.8,ZD2组为19.5±7.8(图4)⇓).肌肉化血管的百分比与每条血管增殖细胞百分比的中位数呈正相关(r=0.58, p=0.003)。
动脉壁的多形核白细胞
在小血管壁上没有发现PMN,尽管它们可以在管腔中发现,显然不附着在内皮上,是血液的正常成分。在肺泡间隔和气道壁上容易发现PMN。
讨论
本研究报告了丝氨酸弹性蛋白酶抑制剂ZD0892的新发现,它可以减少肺小动脉和肺泡导管附近的小动脉中吸烟诱导的细胞增殖和肌肉化。此外,细胞增殖和肌肉化测量之间的相关性表明,肌肉化很可能是烟雾驱动的细胞分裂的直接结果,这一过程在暴露于烟雾后急剧开始17并在长期暴露中持续存在12.
为了理解这些发现与人类疾病的相关性,重要的是要注意动物和人类发现之间的异同。一般来说,豚鼠模型与人类情况有明显的相似之处,长期接触的羧血红蛋白水平与人类吸烟者相似,长期接触产生的肺气肿性肺破坏与人类小叶中心肺气肿相似18.在人类中,可测量的PHT通常在患者出现明显症状之前无法确定。然而,在没有PHT的吸烟者中,至少在休息时,可以发现血管功能障碍的生理证据,并且在这些个体中也可以发现血管形态异常19,20..然而,在豚鼠中,肌肉化与PHT的存在同时出现6,14.这些数据表明,动脉肌肉化是由吸烟引起的细胞增殖所驱动的,因此进一步支持了这样一种观点,即吸烟者体内的PHT是吸烟对血管的直接影响,而不是肺气肿继发的缺氧或血管丧失的晚期后果。因此,在人类和动物中,很明显,早在PHT或肺气肿的证据出现之前,烟雾就对脉管系统产生了影响。
烟致血管细胞增殖的机制尚不清楚。由于ZD0892是一种丝氨酸弹性蛋白酶抑制剂,有可能烟雾导致血管中丝氨酸弹性蛋白酶的表达,而ZD0892阻断了这种弹性蛋白酶的作用。在单野花碱模型中,血管细胞增殖和PHT与动脉壁中丝氨酸弹性蛋白酶(称为内源性血管弹性蛋白酶)的诱导有关14.在该模型中,弹性蛋白酶活性似乎不直接调节基质重组,而是通过激活其他介质,抑制弹性蛋白酶通过诱导细胞凋亡减少肌肉增殖。考恩et al。13表明ZD0892对丝氨酸弹性蛋白酶的抑制降低了平滑肌细胞中腱素- C的表达,而通过反义结构对腱素- C的选择性抑制与血管肌肉化的抑制有关。Tenascin‐C的表达似乎是继发于内源性血管弹性蛋白酶诱导金属蛋白酶活性。也有证据表明,内源性弹性蛋白酶可能通过释放碱性成纤维细胞生长因子介导肌细胞增殖21.事实上,最近发现,COPD患者的肺小血管成纤维细胞生长因子‐2的表达增加22,因此,弹性蛋白酶抑制剂可能与血管细胞外基质有复杂的关系,诱导细胞凋亡,减少细胞增殖和血管重塑。
作者模型中的血管细胞增殖也可能受到一种或多种由香烟烟雾引起或包含的急性介质的刺激,包括内皮素、肿瘤坏死因子(TNF)‐α和活性氧(ROS)。使用显微解剖技术,作者已经能够证明急性香烟烟雾暴露后,内皮素基因在肺动脉和肌性肺动脉中的表达迅速上调23.在先前的研究中,细胞增殖和内皮素产生之间存在已知的联系11作者证明,急性吸烟引起的血管细胞增殖可以通过BQ-610,内皮素α受体拮抗剂。内皮素似乎还增加了中性粒细胞金属蛋白酶明胶酶B的释放,而明胶酶B又以正反馈回路的方式增加了内皮素的生成24.最近研究表明,内皮素引起中性粒细胞粘附增加(随后释放ROS),这一过程是通过内皮素α受体介导的24.吸烟者体内循环的内皮素水平升高25这支持了这些机制可能与人类疾病相关的观点。
ROS已知能诱导细胞增殖,而香烟烟雾中含有大量的氧化剂,可能会扩散到脉管系统并诱导细胞有丝分裂26.研究发现,内皮素本身通过诱导ROS刺激肺动脉平滑肌细胞增殖,从而可能放大香烟烟雾中氧化剂诱导的增殖27.
ZD0892似乎具有抗炎活性。ZD0892可抑制豚鼠支气管肺泡灌洗对香烟烟雾的炎症反应16.在小鼠心肌炎模型28ZD0892可减轻脑心肌炎病毒感染后的炎症和纤维化。一般来说,TNF‐α是急性炎症反应的关键中介物,除了对内皮素产生的上调作用外,已被证明在血管平滑肌迁移和小动脉反应性中发挥作用29.在作者之前的一项研究中,研究了ZD0892对肺气肿的影响,发现烟雾会增加血浆TNF-α,而ZD0892会降低TNF-α水平,尽管没有达到控制水平16.由于TNF‐α已被证明在血管细胞外基质的修饰中很重要30.,其持续产生可能直接或间接地通过其对内皮素的影响而对香烟烟雾对血管细胞增殖和基质变化的刺激作用负责。
在本研究中,不同于Cowan报道的单野百合碱诱导的变化et al。14,给豚鼠服用ZD0892并没有完全将增加的肌肉化降低到基线水平,也没有在最后2个月给药(ZD2方案)对血管肌肉化有任何明显的影响。后一项发现表明,干预的时间是至关重要的,因为在暴露于烟雾中的豚鼠中,小动脉的肌肉化出现得相对较早,早于形态测量学确定的肺气肿气腔扩大6.有可能在肌肉化开始后进行干预是无效的。对这些数据的一种解释是,暴露于烟雾4个月后,增殖反应已成为自我维持和/或由不同于最初重要的介质驱动。与此相反的是Cowan的数据et al。14,在注射野百合碱21天后给予ZD0892,成功改善血管改变。
尽管两种模型之间的差异可能反映了单一野百合碱和香烟烟雾影响的不同机制,但它们也可能只是反映了剂量效应。考恩et al。14使用了非常高的剂量,240毫克·千克−1·天−1,而剂量为20 mg·kg−1·天−1用于本研究。作者先前已经证明,该剂量的ZD0892可将豚鼠急性或慢性烟雾吸入引起的灌洗中性粒细胞减少到基线水平16.作者无法在小血管壁中识别PMN,而仍有一定程度的血管肌肉化这一事实意味着吸烟诱导的炎症细胞浸润可能对血管细胞增殖不是至关重要的。
总之,这项研究表明,小动脉肌肉化最有可能是吸烟诱导细胞增殖的直接影响。丝氨酸弹性蛋白酶抑制剂似乎可以减少烟雾诱导的细胞增殖和血管重塑。因此,这项研究表明丝氨酸弹性蛋白酶抑制剂可能在预防香烟烟雾中导致肺动脉高压的解剖变化方面有价值。低剂量弹性蛋白酶抑制剂在逆转由香烟烟雾引起的既定血管重塑方面的有用性没有得到本研究的支持。然而,大剂量的抑制剂可能对吸烟引起的肺动脉高压有价值。
- 收到了2002年10月21日。
- 接受2003年3月11日。
- ©ERS期刊有限公司