文摘
调节细胞因子的表达代表一个潜在的有用的方法治疗特发性肺纤维化(IPF)。
识别潜在的目标这样的干预,半定量反向transcriptase-polymerase连锁反应是用于比较酸信使核糖核酸(mrna)编码的表达17细胞因子在肺组织获得IPF患者在诊断时和控制对象。一些细胞因子也研究通过免疫组织化学技术在蛋白质水平。
信使rna编码的所有细胞因子评估检测控制和肺纤维化的样本。只有转化生长因子(TGF)的β和白介素(IL) -10 mrna定量增加肺活检的IPF患者相比控制,结果证实了通过免疫组织化学方法在蛋白质水平。虽然mrna血小板源生长因子(PDGF) bb和角质细胞生长因子(KGF)表达了相似的IPF患者的肺部和控制,局部积累IPF的这两个因素也被观察到。增生性的肺泡上皮细胞是一个著名的来源的细胞因子,il - 10, PDGF-BB和KGF在大量增加,尽管增加积累成纤维细胞、平滑肌细胞和基质成分也观察到(PDGF-BB TGFβ应承担的)。
这些结果提供了新的见解产生的细胞因子在特发性肺纤维化肺和表明调制的生产转化生长因子β和白细胞介素- 10”可能代表一个可能有用的治疗策略禁用疾病。
特发性肺纤维化(IPF),也称为隐fibrosing肺泡炎,是一种进步的炎症和纤维化肺病的原因不明的特点是肺实质的体系结构的改造和胶原沉积1- - - - - -4。在病人的肺活检显示IPF的组织学特征模式,通常的间质性肺炎(摘要),这种疾病通常遵循一个不利导致大多数病人的死亡2,3。
肺纤维化通常源于对肺损伤的反应。在IPF,人们普遍认为一个未知的引发剂破坏肺泡上皮和内皮细胞,扰乱了肺泡基底膜。而不是治愈这个初始损伤,随后的炎症反应会导致进一步的破坏,这使得炎症反应,最终导致进行性肺纤维化,改造的肺部气体交换的体系结构和损伤3,5。研究在肺纤维化动物模型和人类与纤维化肺病已经表明,各种细胞因子在当地的这些过程,并认为这些细胞因子可能参与肺纤维化的发病机制的各个步骤3,5- - - - - -7。
几组评价细胞因子的生产在IPF患者的肺。虽然它已经表明,这些介质,特别是转化生长因子(TGF)高β在血小板源生长因子(PDGF)和肿瘤坏死因子(TNF)高α在这种疾病的发病机制可能是重要的3,5,7,这些细胞因子的确切作用还有待牢固确立。研究利用肺纤维化动物模型表明,许多其他介质可能参与肺纤维化反应5,6。这些结果,然而,无法轻易推断IPF患者,因为确定的细胞因子(s)是肺纤维化的关键是不同的在其他动物模型,因为这些动物模型产生一个模式在IPF的组织病理学异常相似6,8。
因为没有满意的治疗目前可供IPF,评价治疗效果的调制这种疾病代表一个潜在的重要的细胞因子的生产领域的调查9。在这方面,一个重要的第一步是精确、全面描述的形象在患者的肺实质细胞因子生产IPF诊断成立,以识别潜在的细胞因子为目标的新的治疗策略。在这项研究中,反向transcriptase-polymerase连锁反应(rt - pcr)已经被用来评估的表达信使核糖核酸(mRNA) 17个不同的细胞因子在肺组织获得IPF患者和对照组。的一些细胞因子被认为是至关重要的组织纤维化也研究通过免疫组织化学技术在蛋白质水平。
材料和方法
组织标本
特发性肺纤维化患者
开放肺活检获得从五个IPF患者的组织学证实诊断。所有的病人(三个男人,两个女人;平均年龄58±14岁;三个吸烟者,两个不吸烟者)临床症状和体征与IPF的诊断一致,包括在用力时出现呼吸困难、咳嗽的隐性发病,吸气上魔术罗音胸部检查。在所有情况下,肺部高分辨率计算机断层扫描显示的线性和网状的透明蜂窝主在肺胸膜下地区和基地2。肺功能测试如下:肺活量68±13%的预测,肺活量pred 74±20%, pred残余容积(RV) 68±14%,在一秒钟用力呼气量pred /用力肺活量88±16%,次呼吸扩散能力53 pred±11%。没有系统性疾病的患者症状,没有收到任何之前治疗肺纤维化肺活检。
对照组
肺组织获得五个病人(三个男人,两个女性;平均年龄55±9岁;三个吸烟者,两个不吸烟者)接受了局部胸外科原发性肺癌(n = 3),局部支气管扩张(n = 1)或孤立的类癌肿瘤(n = 1)被用作控制标本。在所有情况下,肺组织是在一个网站远离总值病理过程和病理检查是正常的。
对肺组织形态学评估
肺活检的碎片立即冷冻和储存在液氮中。相同的每个活检组织片段用于形态学评估、隔离的RNA和免疫组织化学技术。第二个组织片段固定在Bouin-Hollande解决方案,由常规处理技术和用于诊断目的。
低温恒温器部分在每一个片段的三个不同水平(两个四肢和样本的中心)与苏木精染色,曙红和红色染料光显微镜评估。组织病理学特征进行评估由两个病理学家(p .太阳系和m . Kambouchner)和异常的三个部分从给定活检被认为是类似的样品评估在这个研究。
量化胶原蛋白沉积在活检患者和控制,I型和III胶原蛋白的量是决定使用Picro天狼星红染色法,如前所述10。冻结部分被光显微镜下观察到极端使用图像分析系统(维视;Histolab,埃夫里市,法国)。整个表面的每个组织切片(IPF: 7.6±2.6毫米2;控制:7.7±3毫米2)是红色的区域呈现彩色的(对应于胶原蛋白),允许的决心组织表面总面积的百分比被胶原蛋白(35.4±23.5%和6.7±2.4% IPF和控制标本,分别)。
rt - pcr过程
使用RNAzol总RNA分离从每个样本(Bioprobe系统,Montreuil苏木香,法国),量化的测量吸光度在260 nm和retrotranscribed互补脱氧核糖核酸(互补),如前所述11。允许在不同的细胞因子mrna的比较样本通过rt - pcr,是很重要的,等量的cDNA从每个标本用于放大反应。因此,总cDNA首次量化基于互补脱氧核糖核酸编码的数量丰富的核糖体蛋白S14系列,如前所述11。
整除的cDNA从每个样本含有等量的cDNA用于PCR扩增的细胞因子的互补。对于每一个细胞因子,所有样本被放大和并行处理,如前所述11。反应混合物(100年第四卷µL)包含:20 mM Tris-HCl (pH值8.4),50毫米氯化钾,MgCl2大多数细胞因子(1.75毫米,1.5毫米集落刺激因子(gm - csf)、白介素(IL)高6在胰岛素生长因子(IGF) 2和上皮生长因子(EGF)), 200µM每个核苷酸,10 pmol的寡核苷酸引物(表1所示⇓),2.5 U Taq(美国生命科技,马里兰州)和互补。循环参数如下:变性,95°C 1分钟;退火,60°C (gm - csf、IL 6应承担IGF高2在EGF)或55°C(所有其他细胞因子)1分钟;1分钟的扩展,72°C。以确保样品在指数阶段获得放大的反应分析,20µL整除从每个反应混合物被四次在放大,而thermocycler维持在72°C。反应被打断后,25日,30日,35和40个周期(TGFβ应承担的,角质细胞生长因子(KGF), IL 8和IGF量2)或30后,35岁,40岁和45个周期(所有其他细胞因子)。以确保只有特定放大产品形成并确定相应的周期数的指数阶段放大,一个整除的反应是最初在2%琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭染色后呈现在紫外线光照。
量化一个给定的细胞因子的表达在不同的样本,10µL整除的放大产品获得连续两次PCR反应的对数期应用于地理Hybond N尼龙膜(美国IL Amersham Corp .)、阿灵顿高地)点状的格式,如前面描述的那样11。对于每个细胞因子,然后点污点杂交与放射性标记寡核苷酸探针互补序列的扩增片段(表2所示⇓,图1⇓)。放射性绑定决心使用电子放射自显影法(即时成像;美国帕卡德,梅里登,CT)和结果表示为每分钟计数。整除的在两个不同的次的指数阶段放大反应分别进行了分析但是给了类似的结果。
免疫组织化学技术
单克隆抗体在这项研究中的应用是:anti-GM-CSF (Genzyme、剑桥、马、美国);圣地亚哥anti-IL-10 (JES3-12G8: Pharmingen CA,美国);反人类的地理TGFβ(Serotec,牛津大学,英国);anti-TGF量α(Serotec);anticytokeratin (Immunotech,马赛,法国)。免疫球蛋白(Ig) G1 (MOPC 21)和IgG2 (MOPC 141)控制抗体(σ,圣路易斯,密苏里州,美国)被用来评估非特异性结合。纯化多克隆抗体被用来探测人类KGF表达和PDGF-BB(研发,阿宾顿,英国)。
低温恒温器部分,4 - 6µm厚,被固定在丙酮和适当稀释的抗体反应。阳性细胞被发现使用Vectastain ABC-alkaline磷酸酶系统(美国向量,伯林盖姆,CA)和快速红底物。测试免疫染色的特异性抗体被忽略或被isotype-matched控制抗体所取代。在这种情况下,没有发现阳性细胞。免疫染色强度分级从-(缺席)+ + +(强阳性);完整协议得分之间获得了两个独立的观察者。此外,每个细胞因子的免疫染色被图像分析量化。每个组织切片的总表面积的百分比被染色的细胞。细胞角蛋白的表达强度的增生性肺泡pneumocytes IPF活检被图像分析评估。组织表面总面积的百分比被增生性pneumocytes IPF标本为14.2±4.3%。 Such cells were rare in control biopsies.
统计方法
所有结果平均数±标准差。测量细胞因子的互补,所有步骤过程并行进行的所有10个样本。比较患者和对照组用Mann-Whitney U量测试。一个p值< 0.05被认为是显著的。
结果
细胞因子mrna的表达从IPF患者肺组织和控制
组织学上正常的肺组织标本不吸烟的控制;活检从吸烟者pigment-laden巨噬细胞的积累,与温和的病灶纤维化改变。所有IPF患者肺活检显示组织学异常典型的摘要,石蜡包埋标本和冻结部分来自样品用于评价细胞因子表达,除了因为他们的规模较小,后者包含显然非常有限的地区正常的肺组织标本。一些变异强度活检组织病理学观察异常的不同个体,但所有患者持续活跃的炎症和纤维化反应的证据。
检测PCR产物的琼脂糖凝胶表示,信使rna编码所有17个细胞因子评估在这些研究中存在于从控制和IPF患者肺组织。事实上,当大量的细胞因子mRNA进行比较,只有mRNA编码TGFβ和il - 10在IPF更丰富的比控制肺组织标本(图2所示⇓;两种细胞因子p < 0.05)。信使rna编码这两种细胞因子的水平从IPF患者肺组织彼此相关。然而,没有观察到的相关性之间的信使rna编码这些细胞因子和纤维化的程度,所评估的胶原蛋白沉积或肺泡上皮增生的强度评估使用anticytokeratin疣状。
引人注目的是,信使rna编码对于所有其他细胞因子评估(IL 1β,应承担IL 6,应承担IL 8,应承担IL-15, gm - csf,干扰素(IFN)高γ在肿瘤坏死因子α,应承担PDGF-BB, PDGF-AA, IGF高2纤维母细胞生长因子(FGF), bFGF, TGF高α在EGF和KGF表达在等量肺纤维化和控制组织(表3⇓)。没有证据的相互依存的mrna表达这些不同的细胞因子被发现。
在IPF TGFβ1和il - 10的表达和控制肺组织
评价TGFβ和il - 10的表达在冻结部分IPF患者使用免疫组织化学技术和控制证实细胞因子都存在于更大的数量在纤维化肺组织,评估通过半定量的评价(表4⇓)或图像分析(il - 10: IPF 11.2±8.3%,控制0.6±0.6%;TGFβ应承担:IPF 15±3.6%,控制3.9±0.8%;两种细胞因子p < 0.05)。肺组织中il - 10的表达明显增加IPF患者是由于强烈的表达的细胞因子由增生的肺泡上皮细胞(图3⇓)。在这些标本,il - 10的表达的分布可以叠加的上皮细胞角蛋白免疫染色,表明il - 10被增生的肺泡上皮细胞几乎完全表达。正常的肺泡上皮细胞仅略呈阳性细胞因子(图3 b⇓)。在两种控制和纤维化肺组织,细支气管上皮细胞,当礼物,是中度阳性il - 10,但细支气管上皮细胞的染色强度是两组相似(表4所示⇓)。值得注意的是大多数肺巨噬细胞为阴性表达il - 10在肺组织标本。
il - 10表达相比,各种各样的肺细胞表达TGFβ应承担(表4所示⇑)。这些细胞类型的几个IPF肺组织表达TGFβ应承担的高度超过了相应的人口控制标本。值得注意的是,结缔组织中的纤维母细胞识别IPF患者的肺部阳性细胞因子。同样,内皮细胞和血管周的平滑肌明显染色更强烈的TGFβ应承担的肺的IPF患者比控制。此外,一个强大的斑片状染色TGFβ应承担指出在IPF患者活检的细胞外基质,而结缔组织只是隐约积极控制肺标本(无花果3 c和d⇑)。其他细胞群似乎表达了类似的的TGFβ控制和纤维化肺组织。这是对肺泡巨噬细胞,其中大多数是明显阳性TGFβ。同样,正常和增生的上皮细胞活检IPF患者和控制染色弱的TGFβ。细支气管上皮细胞在所有标本也表达了这种细胞因子,虽然相同的细支气管内的疣状通常是不连续的。
表达的细胞因子mrna在场在肺纤维化和控制组织类似的数量
因为之间的差异观察细胞因子mRNA和蛋白的表达水平,一些细胞因子的表达出现在等量的mRNA水平IPF患者的肺活组织检查和控制也被评估。与rt - pcr结果一致,小疣状的强度和分布的差异gm - csf和TGFα观察当比较IPF和控制肺组织(表4所示⇑)。这些结果证实了使用图像分析定量评价(gm - csf: IPF 1.7±1%,控制1.6±1.1%;TGF量α:IPF 3.4±3.2%,控制2.5±0.7%;对细胞因子p > 0.2)。
如上所示,PDGF-BB的信使rna表达水平和KGF类似当比较IPF患者活检和控制。这两种细胞因子、细胞因子表达的分布在两组相似,但一些细胞类型表示这些细胞因子更强烈的IPF患者活检比相应的人口控制肺组织,证明了图像分析(PDGF-BB: IPF 12.5±2.4%,控制2.6±2.4%;KGF: IPF 7.2±2.4%,控制1.6±1%;两种细胞因子p < 0.05)。因此,增生的肺泡细胞(没有在控制肺组织),内皮细胞和小血管的血管周围结缔组织更集中在IPF PDGF-BB阳性标本(无花果3 e和f⇑),而细支气管上皮细胞(强烈的染色),淋巴细胞(弱表达)和肺泡巨噬细胞(弱表达)证明了等价表达式从IPF患者肺组织和控制(表4所示⇑)。增生性的肺泡上皮细胞标本IPF患者也强烈彩色KGF(图3 g⇑),而支气管上皮细胞、肺泡上皮细胞控制活检证明只有weak-to-moderate染色(图3 h⇑)。肺泡巨噬细胞、内皮细胞和淋巴细胞略呈阳性,这两种类型的肺组织中细胞因子(表4所示⇑)。
讨论
在目前的研究中,评价IPF患者的肺部细胞因子的概要文件和控制发现以下。1)mrna编码细胞因子研究都可检测控制的肺部组织。2)17中细胞因子研究,只有信使rna编码TGFβ和il - 10显然是更丰富的IPF患者的活检在肺组织的控制。3)免疫组织化学技术证实了这两种细胞因子表达的增加在IPF的蛋白质水平,但也显示大量PDGF-BB和KGF增加。这些细胞因子是由特定的细胞群,其丰度变量在不同的活组织检查,因为纤维化反应的异质性的活检。4)增生的肺泡上皮细胞,一个丰富的细胞群IPF的肺活检,似乎是一个重要的细胞因子调节纤维化反应的能力。
尽管一些研究表明,细胞因子参与IPF发病机理,信使rna编码的数量相比,这些介质很少被定量IPF患者和对照组的活检12- - - - - -14。目前的数据显示,所有的细胞因子评估可以发现在控制肺组织和大量的信使rna编码的这些细胞因子不显著增加肺的IPF患者。然而,由于研究样本的数量很小,可能不同IPF和控制标本可能已经错过了与变量mRNA表达细胞因子(如。KGF、转化生长因子α)不能排除。此外,需要注意的是,这些结果反映了只有一个时刻在疾病的发展,不排除这种可能性,信使rna编码的积累一些这些因素可以增加在其他阶段的过程。例如,在博来霉素诱导的肺纤维化动物模型,肿瘤坏死因子α,应承担IL 6和gm - csf增加在最初的炎症阶段反应但当fibroproliferative恢复正常流程和胶原沉积占优势15- - - - - -18。然而,当前的作者认为,从临床的角度获得的结果是重要的,自从标本评估被代表的人口IPF患者当时开放肺活检进行建立诊断。
在这种情况下,增加大量的信使rna编码的观察TGFβ和il - 10在IPF特别感兴趣。TGFβ应承担的增加表达蛋白mRNA水平IPF患者的肺已经被报道19,研究结果充分证实了在这个研究。在肺纤维化细胞因子的重要作用已经被研究了使用动物模型,证明了抑制细胞因子的行动防止或减少胶原的沉积在肺部20.。
引人注目的是,细胞因子il - 10是唯一的其他标识的信使rna被发现比这更丰富的IPF患者的肺组织的控制。潜在作用的细胞因子在IPF受到更少的注意力比TGFβ。il - 10 mRNA的生产增加肺泡巨噬细胞从支气管肺泡灌洗(BAL) IPF患者被报道,但在BAL游离液il - 10的蛋白质被发现更低21或略有增加22在这些患者相比,BAL流体从健康控制。此外,这个由纤维化肺组织细胞因子的生产还没有评估。目前的研究结果表明,增生的上皮细胞是目前最重要的来源增加il - 10表达IPF患者的肺。这发现是兼容以前的观察,正常肺上皮细胞还生产少量的细胞因子23而在体外激活其他上皮细胞(如。角化细胞)会导致大量的il - 10的生产24。
il - 10在IPF的确切作用还有待建立。一般而言,这被认为是一种抗炎因子和细胞因子,因此,它可以推测,il - 10的生产在IPF用来表达下调与这种疾病相关的炎症反应25。il - 10可能产生其他nonmutually排斥效应。因此,这种细胞因子抑制胶原合成在体外使用不同的成纤维细胞的细胞类型26,27。然而,il - 10在组织纤维化的影响在活的有机体内变量和似乎取决于使用的实验模型。例如,il - 10抑制bleomycin-induced肺损伤时评估小鼠的整个肺的羟脯氨酸含量27,而肺胶原蛋白沉积被发现减少silica-induced后il - 10基因敲除小鼠肺纤维化28和当地生产的持久性il - 10在野生型小鼠的肺是促进肺纤维化的发展建议28。最后,il - 10是促进免疫反应的发展产生一个T辅助细胞因子2,IPF被观察到29日。因此,进一步的研究需要精确确定的影响il - 10在纤维化的过程中,自调制生产细胞因子可能感兴趣的IPF患者的治疗。
对于大多数细胞因子评估(即。地理TGFβ,il - 10, gm - csf和TGFα),评价细胞因子mRNA和蛋白表达水平给了整合的结果。然而,免疫组织化学结果PDGF-BB和KGF指出的重要性评价细胞因子mRNA和蛋白表达水平。因此,尽管信使rna编码PDGF-BB和KGF表达在IPF相似的数量和控制组织,依据局部积累的因素在IPF通过免疫组织化学技术观察。转录后调控或翻译后的稳定性增强这些细胞因子在IPF可以解释这些差异。例如,PDGF信使rna可以包含一个内部核糖体进入部分能够提高翻译的因素和PDGF对矩阵的绑定组件可能延长其组织半衰期30.。此外,这些细胞因子被证明是由许多细胞类型在正常的肺,而增加产量在IPF只是局限于一些人群。在这种情况下,增加了少数细胞类型的转录可能仍未被发现在评估信使rna提取肺总。
PDGF-BB的显性效应来刺激纤维母细胞增殖和迁移,先前的研究已经表明这个因素的存在在IPF患者的肺5,7,12。与本的结果一致et al。31日,这是在这项研究中发现,PDGF-BB表达的增加在增生的上皮和IPF尤为重要,在较小的程度上,成纤维细胞和平滑肌细胞。
KGF是一个重要的生长因子对肺泡上皮细胞和肺损伤的修复中扮演着重要的角色32,33。尽管正常大鼠肺既定KGF表达32当前作者的知识的表达这个因素并没有报道之前在正常的人类肺。这是证明KGF信使rna可以检测到正常的肺,正常的肺泡巨噬细胞积极沾抗体针对这个因素。此外,尽管KGF没有明显的mRNA表达不同肺纤维化和控制组织,增生性的肺泡上皮细胞在肺实质中介IPF患者是非常积极的。自从KGF增殖和分化是一个重要的因素为II型pneumocytes和诱导肺泡增生32,目前的结果表明,这种细胞因子,当地生产由上皮细胞可能参与肺泡修复通过自分泌或旁分泌的影响。
综上所述,本文提供的信息提供了各种各样的新的见解产生的细胞因子在特发性肺纤维化肺和强调的潜在重要性转化生长因子β和白细胞介素- 10”在这种疾病的发病机制。未来的研究是应用程序的一个重要目标信息的发展新的治疗策略。在这种背景下,有人建议,干扰素γ应承担的管理可能会导致功能改善特发性肺纤维化患者34。有趣的是要注意,干扰素γ应承担的反应被证明与降低转化生长因子β应承担的信使核糖核酸的肺癌患者,干扰素γ应承担的是已知的与T列车辅助2细胞因子的生产在体外。因此,其他策略旨在调节这些细胞因子的生产提供了新的治疗途径非常致残的疾病。
确认
作者想感谢Millot第一优秀的技术援助。
- 收到了2002年2月21日。
- 接受2003年2月16日。
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