文摘
辅助(Th)在哮喘2细胞因子发挥核心作用。因此,双盲随机研究调查是否heat-killed分枝杆菌衰弱(SRL172)的有力downregulator Th2细胞因子,可以减少allergen-induced过敏性哮喘患者气道反应。
总共24男性哮喘病患者参与了这项研究。执行一个支气管过敏原的挑战(EAR)早期和后期哮喘反应(政治)前2周和3周后一个皮内注射SRL172或安慰剂。之前和之后的治疗,血清免疫球蛋白E水平和(Ig)在体外生产5白介素(IL)的外周血淋巴细胞进行了研究。
既不影响治疗耳朵。SRL172引起平均减少34%的曲线下的面积在一秒用力呼气量(FEV1在守护神)变化,未能达到与安慰剂相比传统的统计学意义。SRL172还导致平均降低25%最大FEV下降1在政治,但这不是明显不同于安慰剂。SRL172血清IgE和IL-5合成的减少造成的在体外3个星期后处理(p = 0.07)。
这项研究显示了一个意义heat-killed的影响的趋势分枝杆菌衰弱(SRL172) allergen-induced气道反应。进一步的临床试验,涉及多个剂量,是必要的。
支气管哮喘慢性气道炎症的特点是由激活辅助策划(Th) 2细胞产生白介素(IL) 4和5,促进气道嗜酸性粒细胞和免疫球蛋白E的合成(Ig)1。同时,在健康个体,Th2细胞通常与Th1细胞平衡,产生和干扰素(IFN) -γ- 2在过敏性哮喘患者气道内频率和活动增加2。
近年来哮喘发病率上升的原因尚不清楚。最近的流行病学研究表明,“卫生假说”,认为过敏性疾病发病率的增加,至少在某种程度上,由于减少了儿童早期接触和后续发展传染性病原体的免疫不足3- - - - - -6。许多细菌及其组件可以对免疫细胞起到调制作用,包括革兰氏阴性细菌的细胞壁组件(脂多糖),分枝杆菌7和脱氧核糖核酸(DNA)包含刺激序列(ISS CpG图案)8。分枝杆菌可能的一个代理可能有可能防止Th2疾病的发展7。分枝杆菌的反应已被证明是相关的特异反应性的风险较低9。由于生活方式的变化,改变杆菌卡介苗(BCG)疫苗接种规划在工业化国家中,暴露在分枝杆菌可能减少同时暴露于过敏原也增加了。这可能受损的自然免疫系统的成熟,从主要发生在童年Th2反应平衡Th1和Th2型免疫10,11,或者它可能受损的免疫调节的成熟7。
本研究测试的假设不致病的分枝杆菌的物种分枝杆菌衰弱可以减弱哮喘反应发生后过敏原的挑战。SRL172哮喘志愿者收到一个皮内注射,包含1×10的准备9heat-killed(1毫克)衰弱(SRL172)已经被使用在以前涉及肺结核患者的临床研究12,黑素瘤13前列腺癌14和肺癌15,16,目的是促进Th1 cytokine-dependent免疫防御。以下的观察,衰弱抑制了IL-5和IgE合成ovalbumin-sensitised老鼠17和唤起调控t细胞表达下调Th2反应18进一步提出,它可以减少Th2反应不仅在发展中过敏性疾病也在慢性成人哮喘。除了测试影响航空公司的大小反应,本研究进行了一项探索性调查的能力SRL172减少血清IgE水平和表达下调allergen-induced在体外合成的IL-5外周血单核细胞(PBMC)。
方法
主题
总共24男性过敏性哮喘患者(平均年龄34.8岁,范围20-53岁)有轻度到中度的疾病被招募(表1所示⇓)。所有受试者展示了早期(EAR)和末气道反应(政治)。受试者有轻度哮喘(n = 15),只需要吸入β2受体激动剂,或中度严重哮喘(n = 9),日常症状要求使用低剂量吸入糖皮质激素(< 600µg二丙酸倍氯米松或相当于每天)。吸烟史的人在过去的12个月,酒精或药物滥用,或严重不良反应药物被排除在外。没有所需的受试者报告了呼吸道感染或处方药物,除此之外,对哮喘、研究和前14天内没有受试者口服糖皮质激素前6个月内使用。
批准的这项研究是南安普顿大学(英国南安普顿)和医院伦理委员会和主题给了他们的书面知情同意。
研究设计
这是一项随机,安慰剂对照,与这些相应平行的组织阶段我研究。受试者参加了部门9次(图。1⇓)。
第一次筛选访问,病史和体格检查,常规血液学的生化测试,验尿和皮进行测试。此外,基线组胺反应性测量。第一次有一个磨合过程后28天的疾病活动记录在日记卡为了确定哮喘稳定。第一个过敏原的挑战是在访问2使用一个incremental-dose挑战协议执行。第二天(3)访问对象进行了组胺挑战评估响应任何变化,次要过敏原的挑战。两周后(访问4)血液是第一个在一系列的三个PBMC文化和血清IgE测量。主题然后收到一个皮内注射0.1毫升(1毫克)SRL172或安慰剂的横向方面左臂上的三角肌区。3天之后他们回到当地的部门记录反应(5)访问。注射(访问6)18天后,血液学和血液生化学测试,验尿和血清IgE测量重复。在访问7(3周后注射),第二个血液样本被PBMC文化和过敏原的挑战是重复。其次是组胺挑战第二天(访问8)。受试者随访直到42天接受访问(9)进行全面体检时,第三个血液样本被血清IgE, PBMC文化、血液学、生化和尿液。
为了避免观察者偏见,南安普顿综合医院的药剂师准备研究药物和医生被注射研究管理。此外,注射部位出现的是隐藏于其他调查人员用绷带包扎。
吸入过敏原和组胺的挑战
过敏原的挑战是使用修改一个既定的协议执行19。如果受试者服用常规吸入倍氯米松他们停止治疗5天前过敏原挑战,使开发的守护神。过敏原产生最大的鞭痕反应。后五个呼吸的生理盐水,以确保没有非特异性气道易怒、主体浓度增加吸入过敏原的解决方案(Aquagen:碱性、Horsholm、丹麦)。从1开始标准化质量单位(平方)·毫升−1每隔15分钟和增加10倍到10000平方单位·毫升−1或者直到在一秒钟用力呼气量下降(FEV1从postsaline基线已经实现)≥25% (EAR)。FEV1测量记录在20、30、45到60分钟,此后,每小时8 h。一个守护神被定义为FEV下降1> 15% postsaline基线3至8小时postchallenge。然后经常给2.5毫克的nebulised舒喘灵,允许回家。他们第二天早上返回组胺挑战使用之前报道的协议19。第二次注射过敏原的挑战是执行3周后,使用一个相同的方案增加浓度和总剂量一样在第一次使用。
在体外interleukin-5对过敏原的反应
PBMC隔绝20毫升heparinised静脉血通过Ficoll-Hypaque梯度离心(Lymphoprep奈科明制药,奥斯陆,挪威)。细胞被洗两次,resuspended在2×106细胞·毫升−1Rosswell公园纪念研究所(RPMI) 1640中补充了1毫米丙酮酸钠,2毫米谷酰胺,100 U·毫升−1青霉素、µg·100毫升−1l链霉素,50µM 2-mercaptoethanoll(所有从GibcoBRL生活技术,佩斯利,英国),和5% heat-inactivated人类AB血清(σ有限公司,普尔,英国),和培养48小时37°C 5%二氧化碳(有限公司2)存在与否的屋尘螨过敏原提取物(Dermatophagoides pteronyssinus;alaska airlines) 5000平方单位·毫升的浓度−1。从试点实验剂量的过敏原被选造成IL-5数量增加最多的合成。文化上层清液被商业化验酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒IL-5水平(CytoScreenTM;BioSource国际有限公司贝南、钙、美国)与灵敏度4 pg·毫升−1。
血清免疫球蛋白E
总血清IgE区域免疫学实验室测量,南安普顿综合医院,通过ELISA,使用单克隆IgE抗体内部开发和商业化IgE抗体(Dako、威、英国)。
统计分析
主要结果变量如下:FEV最大比例下降1在第一次2 h后过敏原挑战(EAR)和3至8 h后过敏原挑战(政治)和组胺的变化响应24小时postallergen挑战。功率计算的主要结果是执行FEV下降最大1在守护神。研究主体间的变异性和再现性晚期的反应表明,为了证明政治减少了30%,有95%的权力和的概率< 5%的差异发生的偶然,12个科目是必要的20.。FEV的变化1也表示为区域曲线下(AUC)耳朵和守护神。AUC是计算使用梯形集成面积曲线和轴之间的和除以时间(第一次2 h的耳朵和3 - 8 h守护神)/ AUC计算。变化的比较最大FEV的比例下降1,AUC的耳朵和守护神,挑衅剂量导致FEV下降了20%1(电脑20.)由于SRL172或安慰剂进行治疗使用正式的方差分析模型(方差分析)。类内的变化同样是由配对t检验。变化过程中研究IL-5生产在体外和血清IgE水平相对于第一个测量被表示为AUC梯形三跨度为集成的百分比变化。这个测试是用来考虑IgE的动力学和IL-5在整个研究过程中,不依赖于个别跨度为孤独。两种治疗的AUC武器被Mann-Whitney然后比较紫外线测试,假设一个非正态分布。的IgE水平变化和IL-5合成两个治疗组相比也使用确切概率法。
结果
治疗是由所有主题和血液学的耐受性良好,整个研究生物化学测试或验尿都是正常的。
基线气道反应
在基线,所有受试者发达EAR和守护神。均值(范围)最大落在耳朵33%(20.6 - -50.6)和33% (20.6 - -42.7)SRL172和安慰剂组,分别。在守护神,FEV均值(范围)最大百分比1下降了35.8%(16.5 - -66.7)的受试者接受SRL172和29.5%(16.9 -39.4%)受试者接受安慰剂(图。2⇓)。
基线几何平均数(范围)的电脑20.组胺,虽然低受试者接受SRL172·毫升(1.17毫克−1(0.65 - -2.69毫克·毫升−1)相比,那些接受安慰剂(1.82 mg·毫升−1(0.35 - -13.49毫克·毫升−1),没有明显不同(p = 0.23)。
治疗气道对过敏原的挑战的反应的影响
治疗与安慰剂或SRL172没有显著的影响在耳朵上的最大FEV的比例下降1或AUC。然而,治疗SRL172引起显著减少(p = 0.005) FEV下降最大1在政治的意思(范围)(16.5 - -66.7)治疗前的35.8%降至26.7% (3.6 - -60.6)SRL172注入后,平均相对减少25.4%(图3所示⇓)。
同样,FEV的AUC比例下降1从19.4%降低明显(p = 0.02)(5.8 - -41.4)到12.8%(0.4 - -39.1),平均相对减少34%。相反,在受试者接受安慰剂没有显著改变FEV的最大单日跌幅1或AUC的守护神。当比较的大小变化组受试者接受SRL172和那些接受安慰剂通过方差分析,AUC在政治上的效果未能达到传统的5%显著性水平(p = 0.06),以及影响FEV的最大单日跌幅1不显著。
治疗气道反应性的影响
两组受试者不不同的基线PC20.组胺。过敏原挑战之前执行任何治疗引起的变化显著(p = 0.007)电脑20.从几何平均数(范围)的1.17 mg·毫升−1(0.64——2.72 mg·毫升−10.55 mg·毫升−1(0.1 - -1.68毫克·毫升−1)对象,随后收到SRL172和显著改变(p = 0.02)从1.81 mg·毫升−1(0.35 - -13.63毫克·毫升−10.78 mg·毫升−1(0.16 - -8.84毫克·毫升−1在受试者接受安慰剂。电脑的变化20.两治疗组之间没有显著差异(p = 0.98)。比较电脑postallergen几何方法的挑战20.记录之前和之后的治疗与安慰剂或SRL172使用方差分析显示没有区别两种治疗手臂,与平均值变化从0.55 mg·毫升−10.76 mg·毫升−1在积极治疗对象,从0.77到1.41 mg·毫升−1在受试者接受安慰剂。
治疗效果IL-5合成在体外和血清IgE水平
文化PBMC进行三次19个学科(10接受SRL172和九个受试者接受安慰剂)。受试者随机接受积极治疗倾向于表现出更高的IL-5对过敏原的反应在体外,但这些没有显著不同于受试者接受安慰剂(图。4⇓)。
七的科目处理SRL172 IL-5合成有逐渐下降的研究。相比之下,有一个减少IL-5只有两个学科接受安慰剂。在后者,有增加倾向一个短暂的访问7,即。就在第二个过敏原的挑战,这是紧随其后的是一个恢复到基线水平的研究。比较由Mann-Whitney u测验的AUC IL-5变化发生在访问4和随后的访问显示倾向显著差异(p = 0.07, AUC访问4和7和0.08之间的差异对整个时间进程,即。访问4至9)。比较IL-5和IgE浓度变化的SRL172组与安慰剂组之间发生访问4和7使用确切概率法还显示趋势显著差异(p = 0.07)。类似的趋势被认为对血清总IgE水平相比安慰剂和SRL172治疗组(p = 0.07当比较访问4和7 Fisher精确检验;图4⇑)。AUC的比较显示,两治疗组之间没有差异。
讨论
这项研究已经表明,皮内注射一SRL172在过敏性哮喘患者有小影响allergen-induced守护神,这与倾向于IL-5合成减少了t细胞与过敏原刺激在体外。虽然积极治疗和安慰剂之间的差异没有达到传统意义接受95%的水平(假定值为0.06),这些发现表明,SRL172可能有可能调节气道反应特定过敏原和相关upregulation th2型细胞因子,是典型的过敏性哮喘。
是公认的比较对气道反应的影响与安慰剂SRL172未能达到意义的水平通常寻求在临床试验中。然而,高的意义比较FEV最大的下降1和组内的守护神的AUC的主题SRL172表明对待衰弱影响,值得进一步研究。
这项研究的设计方面的一个难题是缺乏足够的知识SRL172的治疗剂量和时间进程的行动。SRL172被选为最大剂量的剂量用于人类,给Th1分枝杆菌抗原反应的模式,没有造成不可接受的炎症。挑战的时机与注入SRL172基于衰减效应的SRL172鼠ovalbumin-sensitised老鼠见过3周后管理衰弱17。然而,最近的证据显示,3周太很快寻求最大的效果21。也有可能的免疫调节能力SRL172温和之间高度过敏的人。因此,更大程度的信心生物学效应可能是目前的研究中发现如果更多的科目包括考虑这种可变性。最后,也有可能更大的效应可能与多个注射被观察到。
虽然可以接受不同的研究设计可以显示一个更好的抑制作用,这仍然是一个事实,即明确的功效衰弱在动物模型中尚未复制人类哮喘。在ovalbumin-sensitised老鼠模型中,衰弱可以显著降低血清IgE和IL-5释放脾脏17以及血液和肺嗜酸性粒细胞和支气管高反应性18,22,23。至关重要的是,这些抑制性效应可以传递到nonimmunised动物使用被动转移的调控t细胞18。更大的功效在动物模型中可以有几种解释。这可能是因为衰弱更有效的防止敏化作用,从而解释动物模型的疗效或抑制炎症变化由间歇过敏原引起的。后者的解释在最近的一项研究表明,皮内发现支持SRL172管理可以减少支气管扩张剂的需求温和pollen-induced季节性哮喘24。进一步的解释可能是,SRL172更有效的强烈依赖特异反应性的条件。符合这一发现SRL172儿童特应性皮炎的强度明显下降25。最合理的解释,在当前的研究中相对较小的影响可能是高和/或更频繁的剂量必须被给予更大的功效。一项由Shirtcliffeet al。21,使用一半的剂量应用于当前的研究和不同的菌株衰弱(写明ATCC 15483),未能达到统计学意义关于哮喘的临床结果的数量。
后从动物研究显示显著的影响衰弱在细胞因子的反应17,18,22,23开展了探索性研究,寻求证据对IL-5和IgE Th2细胞因子的影响。在这部分的研究是不执行,目的是提供一个明确的答案,一个重要的趋势的影响一个注入SRL172减少过敏的人外周血t细胞的能力来生成IL-5针对具体的过敏原是见过。与瞬态上升allergen-induced IL-5合成在体外在受试者接受安慰剂,可以看到有一个稳步下降IL-5合成七SRL172对待的话题。这个建议对过敏原的保护作用。在缺乏PBMC文化研究的开始,即。第一个过敏原挑战之前,没有明确解释IL-5合成的时间进程,因此,这是猜测,安慰剂组受试者的瞬态增长的结果是第一个过敏原的挑战,与潜在的IL-5代回到基线的研究。通过对嗜酸性粒细胞的成熟骨骨髓来源的影响前体及其激活和长期生存在受影响的器官,IL-5是过敏性疾病的关键细胞因子之一。然而,它变得明显,IL-5不是唯一的细胞因子参与。事实上,最近的一次临床试验使用人性化anti-IL-5抗体表明政治没有显著减少26。因此,重要的是欣赏,与代理目标单一的介质,衰弱有更广泛的影响通过其能力降低il - 4和IL-517和IL-13 (l . Rosa深色SR制药,伦敦,英国。个人通信)和诱导调控t细胞表达下调Th2通过一种机制涉及il - 10和t细胞生长因子(TGF) -β18。
这项研究的结果也印证了这卫生假说。强烈的负面延迟超敏反应之间的联系结核分枝杆菌日本儿童和过敏性疾病9和IgE水平的增加在南非成功治疗肺结核27建议对分枝杆菌的免疫反应是抑制过敏反应的一个重要手段。但是,它应该感激衰弱的独特之处在于其调节免疫反应的能力。其Th1辅助属性不受杀害,而其他分枝杆菌卡介苗等小Th1佐剂效应时死了28。衰弱也会使已有的Th2反应的方式似乎是独立于其增强Th1反应的能力17。这种影响已被归因于CD4 + CD45RB的感应低调控t细胞,可以抑制过敏性气道炎症和代答当转移到过敏者18。最近承认监管人类外周血t细胞的表型29日表明,监管功能的进一步的研究衰弱应该在人类疾病。
总之,这项研究的结果提供了一些证据分枝杆菌衰弱(SRL172)可以调节的方式航空和免疫系统反应过敏刺激。这是承认,这项研究的结果并不明确,但作者认为他们证明需要进一步的临床试验涉及多个剂量研究的潜力SRL172作为治疗慢性哮喘。
- 收到了2002年5月22日。
- 接受2002年9月22日。
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