痰液细胞指数是有效的,可靠的和响应变化gydF4y2Ba1gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba7gydF4y2Ba。越来越多,大量的炎症介质被测量在痰液的流体相;包括细胞因子、趋化因子、粒细胞蛋白标记血管渗漏、二十烷类、蛋白酶等。许多这样的介质都包含在表1gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba,细节调查使用的方法来处理痰和衡量中介的水平。表也提供/中值平均水平测量在研究主题组给的这些介质在痰的预期水平。然而,再现性,这些测量的精度和有效性痰没有调查,因此,他们的效用作为研究和临床工具仍不确定,需要确认。gydF4y2Ba
以下问题是重要的介质的分析:1)测量fluidphase介质的选择方法;2)计划免疫测定时需要考虑的几点因素;和3)评价的测量可溶性中介在痰,gydF4y2Ba即。gydF4y2Ba测量方法的验证。gydF4y2Ba
方法测量fluidphase介质gydF4y2Ba
三种主要类型的方法用于测量痰fluidphase介质是生物分析,酶化验和分析。gydF4y2Ba
生物分析gydF4y2Ba
依赖于保持生物活性和生物产生可衡量的影响的能力,如细胞增殖、骨髓集落形成或趋化性gydF4y2Ba3gydF4y2Ba,gydF4y2Ba11gydF4y2Ba,gydF4y2Ba58gydF4y2Ba。痰液处理黏液溶解的,如二硫苏糖醇(DTT)或dithioerythritol,减少代理商实力强大,可能会减少细胞因子的生物活性,其中许多依靠二硫化物债券为生物活性提供一个稳定的结构。生物也不方便,缺点是耗时和缺乏特异性gydF4y2Ba59gydF4y2Ba。此外,常见的内源性细胞因子抑制剂的存在,尽管允许估计净活动,可能导致严重低估的细胞因子水平gydF4y2Ba58gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
酶化验gydF4y2Ba
炎症反应的介质中有许多酶,释放细胞的合成为一个环境充满了酶抑制剂。估计净活动是重要的组织反应在评估潜在的贡献。的蛋白酶嗜中性粒细胞弹性蛋白酶gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba22gydF4y2Ba,gydF4y2Ba60gydF4y2Ba,gydF4y2Ba61年gydF4y2Ba组织蛋白酶GgydF4y2Ba20.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba61年gydF4y2Ba和组织蛋白酶BgydF4y2Ba22gydF4y2Ba在痰化验使用特定的显色底物,而蛋白酶释放可以量化spectrophotometrically彩色产品。净蛋白酶活动使用纯化酶标准决定。活动形式的基质金属蛋白酶在痰识别通过底物凝胶zymography,和网络活动可以使用放射性标记底物被量化gydF4y2Ba62年gydF4y2Ba。其他蛋白酶,如chymase类胰蛋白酶,更健壮。他们的活动迅速减少冻结/解冻痰液样本,和分析检测的最佳手段(见下文)。gydF4y2Ba
酶的活动参与氧化剂和抗氧化的平衡、髓过氧化酶(MPO)gydF4y2Ba60gydF4y2Ba,gydF4y2Ba61年gydF4y2Ba,gydF4y2Ba63年gydF4y2Ba和过氧化氢酶gydF4y2Ba63年gydF4y2Ba同样,可以使用分光光度法以痰。硫酸化glycoconjugates和脱氧核糖核酸(DNA)在严重哮喘痰gydF4y2Ba64年gydF4y2Ba可能抑制MPO活性gydF4y2Ba63年gydF4y2Ba并行进行,分析可能也是必要的。然而,研究中,痰就被掺入了MPO取得了更好的复苏比免疫测定酶试验gydF4y2Ba21gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
免疫测定gydF4y2Ba
测量分析的方法选择痰fluidphase介质由于其方便,重现性和特异性。他们的敏感性提高,现在的生物分析方法。一个完整的描述的理论基础免疫测定是超出了本报告的范围;然而,使用最广泛的竞争放射免疫检定法(ria),用放射性标记抗原,和immunometric化验如enzymelinked免疫吸附测定(elisa),使用enzymelabelled抗体。gydF4y2Ba
分析间接方法,测量分析物的浓度对一个参数与它的浓度有关,使用每分钟计数(放射性)或产品的光密度的antibodylinked酶在一定的波长gydF4y2Ba65年gydF4y2Ba。在竞争激烈的化验,中介出现在样品的浓度成反比的放射性(RIA),然而,在immunometric化验,中介浓度成正比的光学密度产品形成的共轭酶(ELISA)。中介的浓度计算,参照标准曲线由串行稀释标准的中介准备。自标准通常是一个重组蛋白,其结构和糖基化、酰胺化度取决于它是如何产生的gydF4y2Ba58gydF4y2Ba。因此,常常有不同的亲和力抗体用于标准与内生中介。标准化不同有效的分析比较,因此,问题gydF4y2Ba66年gydF4y2Ba。为了应对这一情况,世界卫生组织咨询组织细胞因子是国际标准或参考试剂分配gydF4y2Ba67年gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba69年gydF4y2Ba对于每一个已知的细胞因子,它的目的是用于校准二级和工作标准。这最终将允许有效interassay比较。类似的标准也要求其他可溶性介质的分析gydF4y2Ba70年gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
计划免疫测定时需要考虑的几点因素gydF4y2Ba
免疫分析法是最常见的测量介质的水平。因此,它的使用被认为是在细节,尽管一些以下几点可以应用于生物分析和酶化验。当务之急是影响因素分析的有效性得到认可和控制,包括特定于:1)试验本身;2)可溶性介质测量;3)痰的独特性质和方法处理它。gydF4y2Ba
因素具体分析gydF4y2Ba
易于生产单克隆抗体的重组抗原已经允许许多商业的发展和laboratoryspecific(自身的)免疫测定,尤其是elisa。免疫测定操作符应该被训练的应用分析,并能够解决gydF4y2Ba71年gydF4y2Ba。可变性之间生产很多应该是最小的,运营商应该满足实验室或公司提供包是可靠的。信息有效性,敏感性,特异性,crossreactivity,预测值和精密的分析应该是可用的gydF4y2Ba21gydF4y2Ba,gydF4y2Ba71年gydF4y2Ba,但额外的质量控制和优化往往需要执行的操作。的敏感性分析是指最低浓度,可以可靠地检测到高于背景,,因此,其检出限。它通常表示为每毫升进行检测分析物的量。然而,一些制造商把这个数字每口井的分析物的量,这是一个小得多的图,需要意识到这一点。制造商建议的最低标准通常是测定的检出限,尽管运营商可以测试这个。试剂的稳定性等试验中使用的标准应该保证存储在正确的温度。如果有必要,标准应该存储冻结在整除,所以它不是不断受到冻融。实验室内部控制应该经常使用在每一个试验,以确定内部和interassay可变性在用户的手中。gydF4y2Ba
特定于可溶性的中介因素gydF4y2Ba
细胞因子通常绑定到各种分子在生物体液(如可溶性受体αgydF4y2Ba2gydF4y2Ba巨球蛋白和自身抗体),这些通常是出现在过剩gydF4y2Ba72年gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba78年gydF4y2Ba。细胞因子可能不认可的捕获抗体试验如果隐藏当细胞因子相关抗原决定基绑定在一个复杂。多克隆抗体捕捉识别多个抗原表位,因此可能更有效地检测复杂的细胞因子。竞争分析使用单克隆抗体可能更精确复杂的细胞因子的存在但并不普及。趋化因子,如白介素(IL)高8小高度基本蛋白质,具有亲和力的酸性带负电荷的分子,如肝素存在于唾液样本gydF4y2Ba79年gydF4y2Ba。肝素抑制可溶性IL 8应承担的趋化作用gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba80年gydF4y2Ba绑定,虽然并不一定意味着影响函数。使用凝胶过滤色谱分析地理IL 8的痰样本,非常highmolecularweight形式gydF4y2Ba81年gydF4y2Ba不再绑定到肝素被发现,其中包括IL 8绑定到αgydF4y2Ba2gydF4y2Ba量巨球蛋白gydF4y2Ba80年gydF4y2Ba,gydF4y2Ba81年gydF4y2Ba免疫球蛋白,gydF4y2Ba82年gydF4y2Ba、DNAgydF4y2Ba83年gydF4y2Ba和肌动蛋白gydF4y2Ba83年gydF4y2Ba。这些highmolecularweight分子不仅可能掩盖检测IL 8在免疫测定gydF4y2Ba83年gydF4y2Ba但也影响这个趋化因子的功能。DNA存在于相对高浓度严重哮喘患者的痰gydF4y2Ba64年gydF4y2Ba慢性阻塞性肺疾病gydF4y2Ba85年gydF4y2Ba和囊性纤维化gydF4y2Ba64年gydF4y2Ba,gydF4y2Ba85年gydF4y2Ba;这可能抑制IL 8在痰应承担的功能gydF4y2Ba85年gydF4y2Ba。这些因素时应该承认结果的解释。gydF4y2Ba
因素具体痰的独特性质和方法用于诱导和处理它gydF4y2Ba
痰的独特性质gydF4y2Ba
许多分析用来测量可溶性中介水平痰已经发展为血清或文化上层清液。然而,在被粘液的混合物,细胞降解产物,DNA,气道细胞中分泌的物质(包括蛋白酶、可溶性受体自身抗体,绑定和载体蛋白),炎症,上皮细胞,痰不能认为是相当于这两种。痰,像所有的生物体液,可能产生基体效应在化验pH、离子强度的改变。自发咯血痰从患者感染性支气管炎、支气管扩张或囊性纤维化更复杂由于高水平的半流体的DNA和肌动蛋白释放坏死炎症细胞除了高浓度的蛋白酶gydF4y2Ba57gydF4y2Ba。正如前面提到的,gydF4y2Ba特定于可溶性的中介因素gydF4y2Ba节中,αgydF4y2Ba2gydF4y2Ba存在于痰量巨球蛋白,结合某些细胞因子(plateletderived生长因子,IL 2,应承担IL 1β,应承担IL 6、应承担的肿瘤坏死因子α应承担(肿瘤坏死因子α应承担)、干扰素γ和IL 8),并可能会干扰细胞因子的识别的抗原表位分析gydF4y2Ba86年gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
该方法用于获得痰gydF4y2Ba
诱导gydF4y2Ba与gydF4y2Ba自发的痰gydF4y2Ba
纤维蛋白原水平被发现在自发的增加比诱导痰咳出痰样本gydF4y2Ba87年gydF4y2Ba。有一个趋势增加嗜酸性粒细胞阳离子蛋白(ECP)水平在自发地咳出痰痰。gydF4y2Ba
诱导痰中影响检测的因素gydF4y2Ba
βgydF4y2Ba2gydF4y2Ba量受体激动剂预处理gydF4y2Ba
组胺水平略有下降后舒喘灵预处理(可能会考虑到桅杆cellstabilising舒喘灵)的性质,但ECP水平不受影响gydF4y2Ba88年gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
盐溶液的浓度gydF4y2Ba
一项研究观察的影响等渗或高渗盐水诱导ECP和组胺水平,发现没有影响gydF4y2Ba89年gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
持续吸入gydF4y2Ba
因为它已被证明,痰液的成分变化随着诱导时间增加(粒细胞减少的比例和巨噬细胞和淋巴细胞增加),可以预见,介质的浓度也可能改变。在20分钟感应4分钟应承担的部分痰检查和ECP mucinlike糖蛋白水平发现减少,蛋白质与表面活性剂在感应水平增加gydF4y2Ba90年gydF4y2Ba。这表明,如果近端支气管分泌物是客观的研究,最好是分析样品收集在诱导的早期。在另一项研究也获得了类似的结果,归纳持续了30分钟;ECP的浓度减少痰收集顺序每10分钟gydF4y2Ba91年gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
醋甲胆碱的挑战gydF4y2Ba
一项研究发现没有醋甲胆碱对ECP的影响或白蛋白水平痰诱导前当挑战进行1 hgydF4y2Ba92年gydF4y2Ba。另一项研究发现,醋甲胆碱挑战的结果在一个小,但意义重大,增加测量αgydF4y2Ba2gydF4y2Ba量巨球蛋白水平gydF4y2Ba32gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
重复的感应gydF4y2Ba
一项研究表明,ECP浓度随着中性粒细胞数量增加gydF4y2Ba93年gydF4y2Ba当痰诱导24小时后重复。俩之间的30分钟内被发现影响IL 8的测量gydF4y2Ba94年gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
方法用于痰处理gydF4y2Ba
延迟在处理之前gydF4y2Ba
这没有系统地调查,但建议痰尽快处理,同时保持在4°C。gydF4y2Ba
选择痰gydF4y2Ba与gydF4y2Ba整个咯血gydF4y2Ba
如上所述本文题为“痰的方法处理细胞,免疫细胞化学gydF4y2Ba原位gydF4y2Ba杂交”gydF4y2Ba95年gydF4y2Ba,两个主要用于痰液的处理方法:选择半流体的部分,为了减少污染的唾液,并处理整个咯血,其中包含变量的大量唾液。通常是单独减少吐出唾液唾液污染在感应。唾液通常包含的ECP水平要低得多,类胰蛋白酶,mucinlike糖蛋白、乳铁蛋白、DNA、弹性蛋白酶、αgydF4y2Ba1gydF4y2Ba比没有痰量抗胰蛋白酶、纤维蛋白原和白蛋白gydF4y2Ba17gydF4y2Ba,gydF4y2Ba26gydF4y2Ba,gydF4y2Ba57gydF4y2Ba,但组胺和内皮素1水平被发现在没有痰唾液中要比不发生变异的病人高gydF4y2Ba26gydF4y2Ba,gydF4y2Ba44gydF4y2Ba。ECP水平被发现是在选定的部分诱导痰高于整个咯血gydF4y2Ba96年gydF4y2Ba,gydF4y2Ba97年gydF4y2Ba。重复性(反复痰样本相同的主题)测量的白蛋白,纤维蛋白原,IL 8和ECP被发现在没有选择好/整个从哮喘患者咯血gydF4y2Ba3gydF4y2Ba。选择痰的重复性测量项目,主要碱性蛋白,白蛋白、纤维蛋白原也不错(组内相关系数(ICC) > 0.8)但对IL 5 0.69 (ICC)和类胰蛋白酶(ICC 0.6)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba。进一步的研究,比较中介的重复性测量由两种方法处理样品,需要进行。gydF4y2Ba
传播方法gydF4y2Ba
因为它的半流体的性质、痰需要分散为了允许提取介质流体相。此外,溶液化的粘液使细胞更完整的去除和碎片,如果留在上层清液,继续释放介质。分散结果不足暂停盐搅拌和摇摆的痰痰gydF4y2Ba9gydF4y2Ba,导致较低的细胞数量和项目gydF4y2Ba98年gydF4y2Ba,IL 8gydF4y2Ba83年gydF4y2Ba和MPO (j·舒特,未发表的数据)的水平。这表明绑定这些介质带负电荷的黏蛋白的巯基减少试剂如德勤。虽然德勤达到好的传播最口水,它可能会减少二硫化物键存在于几个介质gydF4y2Ba99年gydF4y2Ba,如地理IL 1、7、10和12,应承担的趋化因子(蛋白质和eotaxin单核细胞的趋化作用),granulocytemacrophage colonystimulating因子、转化生长因子β应承担(TGFβ)应承担的干扰素家族肿瘤坏死因子α,应承担的血管细胞粘附分子1,应承担selectin家族和αgydF4y2Ba2gydF4y2Ba量巨球蛋白gydF4y2BaOne hundred.gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba104年gydF4y2Ba。理论上,德勤也可能干扰二硫化物债券目前的捕获抗体免疫测定,干扰他们,导致检测灵敏度下降。Dithioerythritol是德勤的光学异构体和展品类似的行动。gydF4y2Ba
在实验中使用超声破碎法驱散痰紧随其后加入德勤(最终浓度5毫米)整除的痰,德勤已经发现没有影响项目或嗜酸性粒细胞蛋白质X (EPX)但嗜酸性粒细胞减少复苏过氧化物酶和MPO水平gydF4y2Ba105年gydF4y2Ba。在飙升的研究中,德勤,当为痰添加处理,不干扰测量项目,EPX, IL 8,应承担的类胰蛋白酶或免疫球蛋白gydF4y2Ba2gydF4y2Ba,gydF4y2Ba9gydF4y2Ba。然而,新鲜德勤添加到该项目标准干扰等,建议德勤的活动减少后分散的痰,被冻结和解冻。在强化实验中,德勤已经没有影响测量显示IL 5gydF4y2Ba2gydF4y2Ba,gydF4y2Ba106年gydF4y2Ba,gydF4y2Ba107年gydF4y2Ba。0.93良好的再现性(ICC)的肿瘤坏死因子α浓度超过一个2星期里被发现与德勤样品分散。相反,国际刑事法院只有0.69当痰从同一个主题只超离心机(诉基廷,未发表的数据)。离心器的水平检测样本与德勤∼10%的加工。gydF4y2Ba
其他类型的化学分散使用的酶gydF4y2Ba108年gydF4y2Ba尚未完全评估,酶对可溶性介质水平的影响是未知的。gydF4y2Ba
物理方法分散使用超速离心法gydF4y2Ba8gydF4y2Ba、玻璃均化gydF4y2Ba33gydF4y2Ba或声波降解法gydF4y2Ba105年gydF4y2Ba可以使用。超速离心法分离成溶胶和凝胶阶段,可能排除介质保持绑定到凝胶阶段gydF4y2Ba109年gydF4y2Ba,介质可能粘附在玻璃珠子。这些方法有缺点的细胞破坏释放细胞内的介质;样品处理以这种方式不适合细胞指数的估计。gydF4y2Ba
在处理过程中温度gydF4y2Ba
处理温度随4°C(冰)室温和37°C。对介质的影响尚未全面调查,但它似乎并不影响ECP, EPX,嗜酸性粒细胞过氧化物酶或MPO水平gydF4y2Ba9gydF4y2Ba,gydF4y2Ba105年gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
渗透性gydF4y2Ba
增加处理液体的渗透性增加痰上层清液的ECP水平gydF4y2Ba110年gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
损失的介质过滤器和管道非特异性结合位点gydF4y2Ba
把分散的细胞悬液通常是过滤去除丛生的粘液和碎片,和一个比例的可溶性介质可能会丢失非特异性结合过滤器或管的两侧。这被发现在15%的整体秩序的IL 5当选择痰飙升与放射性标记IL 5gydF4y2Ba111年gydF4y2Ba。高稀释的样品处理过程中可能会增加这个损失。此外,如果有可怜的传播,这可能加剧了过滤,剩下中介nonfiltered粘液。过滤器和管道应由材料,不会把蛋白质、聚丙烯管被在这方面优越的聚碳酸酯或玻璃的。对高阳离子蛋白等项目,建议稀释缓冲存储和评估之前的示例包含阳离子清洁剂cetyltrimethylammonium溴铵(CTAB);0.2%)(见附件)。gydF4y2Ba
离心分离gydF4y2Ba
高离心力可能导致细胞的激活和释放介质;400×的离心力gydF4y2BaggydF4y2Ba建议。gydF4y2Ba
存储时间和温度gydF4y2Ba
上层清液应存放在密封的管−70°C。项目已被证明是稳定在4°C或6 h 72 h 25°CgydF4y2Ba105年gydF4y2Ba,是最稳定的如果0.4% CTAB添加(见附录)。此外,应避免重复冻结/解冻周期。因此,如果几个介质测量,上层清液应该冻结在整除。gydF4y2Ba
试剂的使用最大化特定介质的水平gydF4y2Ba
对于某些介质,特殊待遇已被证明导致更好的恢复。例如,TGFβ存在潜在的形式和要求为量化的总酸激活TGFβ。CTAB的痰样本处理过程中提取胞内蛋白,gydF4y2Ba如。gydF4y2Ba项目和MPO和提供了一个估计的样本的总含量(见附录)gydF4y2Ba112年gydF4y2Ba,gydF4y2Ba113年gydF4y2Ba。存储后上层清液的测量项目和MPO优化添加0.4% CTAB上层清液。(不推荐添加CTAB如果其他介质测量。)处理痰后添加蛋白酶抑制剂已经被证明能够提高测量IL 5(见附录)gydF4y2Ba114年gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
评估测量可溶性中介的痰gydF4y2Ba
牢记以上因素考虑,讨论现在的重点是评估特定的测量可溶性中介在痰和应该问的问题(图1所示gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
痰的测量有效吗?gydF4y2Ba
测量的有效性最好建立一个黄金标准相比,但没有可供大多数介质。因此,应该检查有效性的一系列“飙升”实验gydF4y2Ba107年gydF4y2Ba。这涉及到未加工的痰液,添加一个已知数量的中介处理痰像往常一样,然后测量恢复免疫测定。重要的是,中介的商业来源用于飙升一样,作为免疫测定的标准。未加料的痰是同时处理和化验,以便恢复可以计算百分比。任何因素操作减少峰值检测的数量也减少内生中介的复苏,掩蔽在某种程度上低峰值的复苏。然而,掩蔽效应通常是轻微的,可怜的复苏应该很容易发现。中介的数量添加到痰应该这样,最后集中在上层清液,如果大多数是恢复,躺在标准曲线的直线部分,中间/范围的上限的检测分析。一个有用的控制实验由飙升phosphatebuffered盐水(PBS)含1%(重量/体积)牛血清白蛋白(BSA)当痰飙升。然后冷冻的同时痰上层清液,同时解冻和化验。这控制错误由于移液技术和冻融的任何影响。 The sputum should be spiked over a range of concentrations. It is not known whether recovery differs between individuals due to differences in factors in sputum which interfere with detection. Therefore, sputum from a range of subjects with different clinical conditions and degrees of severity should be used in spiking experiments. Dilution studies should be performed as a complement to or in combination with spiking. If the mediator is present in high concentration, the supernatant can be directly diluted and the mediator assayed. If not, exogenous mediator can be added to the supernatant after dilution and then assayed. The dilution buffer composition should be the same as for the standard. The concentration of mediator measured should not change significantly after correcting for dilution. If the measurement increases with dilution, this suggests the presence of interfering substances, such as soluble receptors of the mediator. In addition, parallelline studies may be performed, whereby mediator is added to supernatant which is then diluted. The mediator concentration can then be plotted against absorbance, and the gradient line should be parallel to that of the standard curve if no interfering factors are present.
如果有良好的复苏(> 80%)的峰值,可以接受,分析是合理有效的,并且,如果没有检测到内生中介,可以认为没有足够的中介向被检测出来。如果复苏很穷,下一步将取决于是否中介很容易测量。gydF4y2Ba
要做什么如果有效性很差gydF4y2Ba
如果中介的水平是很容易测量的,至少在某些临床设置,并能够提供有用的信息,它可能是适当的继续使用试验,接受一定比例的中介被丢失。然而,它不能被假定相同比例是迷失在所有科目和中介的浓度,除非这是由飙升。gydF4y2Ba
如果中介不容易检测,它不能被认为中介的水平低于检出限的测定。需要采取以下步骤,以确定导致糟糕的复苏和试图将损失降至最低。gydF4y2Ba
二硫苏糖醇的作用是什么?gydF4y2Ba
德勤在中介本身的作用和免疫测定抗体应该调查。已知浓度的溶液中介含有1% BSA (PBS)与德勤“加工”(至于痰)像往常一样和存储。后来解冻和化验,允许德勤在中介的影响研究(没有痰)。德勤可能影响免疫测定本身;因此德勤添加到试验标准(痰)相同的最终浓度和稀释的标准相比,通常与分析缓冲区。此外,如果使用一个ELISA,对捕获抗体的影响可以通过添加德勤检查井涂以捕获抗体和孵化洗之前额外的15 - 30分钟gydF4y2Ba107年gydF4y2Ba。如果德勤不影响中介的测量标准,应该考虑其它原因造成的贫困复苏/损失。gydF4y2Ba
是中介处理期间身体失去了?gydF4y2Ba
中介可能身体失去了在处理过程中1)绑定到特异性的网站在容器和过滤器,或2)剩余nonfiltered粘液颗粒。调查的有效手段是飙升痰与放射性标记(gydF4y2Ba如。gydF4y2Baiodine125)中介和测量复苏的放射性物质。钠十二烷基硫酸放射性标记中介或分析的聚丙烯酰胺凝胶电泳色谱法(与德勤,孵化和处理痰)可能以确定是否执行中介发生退化gydF4y2Ba111年gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
屏蔽或抗原表位发生改变?gydF4y2Ba
如果中介不是身体失去了在处理过程中,屏蔽或变更其抗原表位的抗体用于分析可能发生。如果复苏的放射性标记中介比检测到免疫测定,可以假定,后者是由于测量低水平差免疫抗体的识别。稀释Parallelline分析(研究)可以用来检查是否检测抗体的免疫测定能够检测内生中介同样标准gydF4y2Ba65年gydF4y2Ba。直的部分产生的标准曲线进行比较,分析连续稀释本土上层清液或上层清液添加外源性中介。如果线是平行的,它表明,试验是对活性成分类似的准备。如果线不平行,一种物质的存在,干扰识别中介抗原表位的免疫测定和dilutable建议。这可能是由于屏蔽自身抗体的抗原表位gydF4y2Ba78年gydF4y2Ba,gydF4y2Ba115年gydF4y2Ba、可溶性受体gydF4y2Ba72年gydF4y2Ba,gydF4y2Ba73年gydF4y2Ba,gydF4y2Ba116年gydF4y2Ba,gydF4y2Ba117年gydF4y2Ba或其他绑定蛋白质如白蛋白和αgydF4y2Ba2gydF4y2Ba量巨球蛋白gydF4y2Ba78年gydF4y2Ba,gydF4y2Ba86年gydF4y2Ba。具体分析可用于只有某些细胞因子的可溶性受体,gydF4y2Ba如。gydF4y2BaIL 2和IL 4。从理论上讲,使用多克隆抗体捕获(更多的抗原表位认可)或竞争分析(与抗原决定基的干扰物质)会导致更敏感测量是否涉嫌干扰物质。添加2%渐变20等非离子去污剂可能会降低非特异性蛋白质相互作用。gydF4y2Ba
假设德勤不干扰,痰蛋白酶也可能负责中介退化和改变其抗原表位或干扰抗体的测定。蛋白酶在痰可能达到高水平,与哮喘的临床严重程度成正比gydF4y2Ba64年gydF4y2Ba。有证据表明,他们可能被德勤激活,从而打乱蛋白聚糖债券和释放蛋白酶/ antiprotease复合物gydF4y2Ba118年gydF4y2Ba。Stockley和贝利gydF4y2Ba21gydF4y2Ba发现添加弹性蛋白酶痰导致分泌白细胞蛋白酶抑制剂和MPO水平降低了免疫测定。添加蛋白酶抑制剂痰前处理导致增加的检测率和水平的IL 5,表明蛋白酶在某些情况下干扰物质gydF4y2Ba114年gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
完整的报告的结果gydF4y2Ba
报告结果时,应提供用于验证的方法。程序用于计算的敏感性分析应该说,下面估计(非零)标准浓度最低的使用并不是有效的。再现性应该评估,描述内部和interassay变异。gydF4y2Ba
化验前可溶性介质可用于临床情况,每个实验室都需要建立正常范围,中介以及预期水平特别是临床设置。gydF4y2Ba
要点gydF4y2Ba
1)生产、准备和分散的痰都能影响痰的可溶性介质的水平,并且每个中介应该单独评估。2)不同来源的抗体在免疫分析用于可溶性介质可以产生不同的结果。3)如果发现可溶性中介低于检测水平的具体分析,它不能被假定的真实水平,中介很低/零除非飙升中介研究显示良好的恢复。如果研究表明戏剧性的飙升添加中介,它应该使用,分析认为这是无法计量的。4)测量的介质在痰已经被证明是一个有用的调查工具气道炎症,只要小心注意使用适当的实验室方法和适当的解释结果。5)表示,飙升的实验应该执行验证的结果。6)痰可溶性介质测量报告的研究未能遵循一个严格的方法进行解释时应特别谨慎。gydF4y2Ba
突出的问题gydF4y2Ba
以下研究问题仍然需要解决:1)水平的差异之间的介质(ECP)以外的选择并没有痰;2)测量的重现性的介质(除了ECP,主要碱性蛋白,白蛋白、纤维蛋白原和IL 8);3)的有效性测量的介质选择和没有痰(除了ECP, IL 5,应承担的组胺,IL 8和总类胰蛋白酶在选定的痰和白蛋白、纤维蛋白原,IL 8和ECP没有痰里);4)德勤的影响在许多介质(除了ECP, IL 5,应承担的组胺,IL 8和总类胰蛋白酶);5)延迟处理痰的效果;6)温度(室温的影响gydF4y2Ba与gydF4y2Ba37°CgydF4y2Ba与gydF4y2Ba4°C)在处理(除了ECP, IL 8,应承担的组胺和类胰蛋白酶(室温gydF4y2Ba与gydF4y2Ba37°C));7)稀释的影响,过滤和离心的痰样本在加工;8)可溶性受体的影响,自身抗体和其他结合蛋白检测的介质(除了地理IL 8);9)蛋白酶在大多数介质的影响;10)痰诱导时间的影响在介质(除ECP和mucinlike糖蛋白)和诱导的最佳时期;11)之间的时间诱变的影响;和12)免费的比例gydF4y2Ba与gydF4y2Ba中介在每个试验中发现。gydF4y2Ba
附录:笔记最优测量特定的介质gydF4y2Ba
嗜酸性粒细胞阳离子蛋白gydF4y2Ba
如果总(细胞内和发布)项目的测量是必需的,痰液样本应处理添加0.4%(重量/体积)CTAB在PBS (0.05 M磷酸钠,0.9%氯化钠,叠氮化钠0.05%,0.01米的乙二胺四乙酸二钠(EDTA), 0.1% BSA;pH7.4±0.05)分散后一步。如果需要单独发布项目,同等体积的0.4% CTAB之前应该被添加到痰上层清液储存在−70°C。进一步稀释,如果需要,应由0.2%(重量/体积)CTAB在PBS。所有PBS和PBScontaining解决方案都应该透过0.22µm网。gydF4y2Ba
髓过氧物酶gydF4y2Ba
用于项目应遵循一样的过程。MPO影响冻结/解冻周期的数量,所以这些应该最小化。gydF4y2Ba
白介素8应承担的gydF4y2Ba
处理痰与德勤收益率更高浓度的一些基本的蛋白质,如IL 8在可溶性阶段应承担比痰PBS处理;因此比较样本之间只能用同样的方式对待。gydF4y2Ba
白介素5应承担的gydF4y2Ba
添加蛋白酶抑制剂的组合来痰在处理之前已经被证明能够提高水平的IL 5检测到酶免疫分析法。使用的试剂,他们的最终浓度4(2公/氨乙基)benzensulphonyl氟化物(2毫米),抑肽素(1.4µM),亮抑酶肽(1.0µM)和EDTA;1.3毫米)。蛋白酶抑制剂的影响在其他介质没有检查。gydF4y2Ba
- 收到了gydF4y2Ba2002年4月4日。gydF4y2Ba
- 接受gydF4y2Ba2002年4月16日。gydF4y2Ba
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引用gydF4y2Ba
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