文摘gydF4y2Ba
作者展示了以前,肺气肿和肺减容手术(LVRS)导致了重大转变IIx / b型IIa纤维隔膜的仓鼠elastase-induced肺气肿。探索这个纤维切换机制导致,信使rna表达的肌原性的监管因素,DNA结合蛋白的抑制剂(Id-proteins)和胰岛素样生长因子检查。gydF4y2Ba
核糖核酸提取的隔膜控制、气肿、气肿和虚假的操作和LVRS仓鼠和接受逆转录酶聚合酶链反应。gydF4y2Ba
控制相比,比率MyoD myogenin拒绝与肺气肿,虚假的甚至更LVRS后,由于减少MyoD mRNA和myogenin mRNA的增加。同样,控制相比,符合蛋白mRNA水平显著降低在LVRS虚假的甚至更多。在所有组id 2蛋白mRNA水平降低,但在LVRS只有达到统计学意义,而控制。gydF4y2Ba
结论:1)减少MyoD / myogenin比可能的机制转变较慢的纤维类型,2)减少MyoD / myogenin比率在肺减容手术动物表明肺减容手术提高而不是降低负载放在隔膜和3)观察到抑制因子的下调可能促进隔膜适应过载。gydF4y2Ba
这项研究是由昏聩voor Wetenschappelijk Onderzoek-Vlaanderen格兰特# G.0175.99和Katholieke项目鲁汶研究基金会# OT98/27。g . Gayan-Ramirez是溺爱的博士后voor Wetenschappelijk Onderzoek-Vlaanderen。gydF4y2Ba
肺减容手术(LVRS)已经成为一种治疗终末期肺气肿患者的选择,因为它似乎改善肺功能、生活质量和呼吸肌肉功能gydF4y2Ba1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba2gydF4y2Ba。然而,LVRS的程度可能影响呼吸肌肉功能在分子水平上,仍有待确定。在最近的一项研究中,作者证明了LVRS没有改善横隔膜收缩性质或形态学在仓鼠elastase-induced肺气肿gydF4y2Ba3gydF4y2Ba。事实上,肺气肿和LVRS都关联到一个重大转变从IIx / b型IIa纤维gydF4y2Ba3gydF4y2Ba。肺气肿和LVRS在场之间没有差异。本研究纤维转变是类似于观察纤维隔膜的转变严重的慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者gydF4y2Ba4gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
肌原性的转录因子MyoD、myogenin MRF-4 myf-5,属于基本的家庭helix-loop-helix (bHLH)蛋白质和骨骼阳性,可以刺激和调节阳性基因的转录,从而能导致肌肉可塑性gydF4y2Ba5gydF4y2Ba,gydF4y2Ba6gydF4y2Ba。他们的角色在肌肉萎缩、肥大和纤维转变已经证明在老鼠和老鼠gydF4y2Ba7gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba9gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
相反,dna结合蛋白的抑制剂(Id-proteins;符合Id-4)是通过转录因子的一个亚科,缺乏基本的地区必不可少的DNA结合和转录的激活。这些蛋白表达在各种组织包括骨骼肌。他们作为主导bHLH转录因子的负调控因子,从而抑制基因转录gydF4y2Ba10gydF4y2Ba,gydF4y2Ba11gydF4y2Ba。的确,去神经引起的肌肉萎缩和纤维转变与一个重要的增长符合信使核糖核酸(mRNA)的老鼠gydF4y2Ba12gydF4y2Ba,gydF4y2Ba13gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
此外,胰岛素样生长因子(IGF)我是众所周知的刺激骨骼肌卫星细胞的分化和融合邻近细胞gydF4y2Ba14gydF4y2Ba,gydF4y2Ba15gydF4y2Ba。IGF-I不仅是肝脏中产生,而且在一系列肝外组织从骨骼肌成肌细胞和细胞等。Upregulation当地IGF-I已被证明是参与骨骼肌肥大gydF4y2Ba16gydF4y2Ba,gydF4y2Ba17gydF4y2Ba和肌肉fibre-type转换gydF4y2Ba14gydF4y2Ba据报道,而下调与肌肉萎缩有关gydF4y2Ba18gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
本研究旨在尝试获得洞察肺气肿的机制和LVRS导致前面提到fibre-type转变。为此,肌原性的监管的mRNA水平因素,Id-proteins和IGF-I检查半定量逆转录酶聚合酶链反应(rt - pcr)在一个仓鼠模型。gydF4y2Ba
方法gydF4y2Ba
诱导肺气肿gydF4y2Ba
共41岁,10周大,男叙利亚仓鼠进行经口插管16-gauge导管(Insythe-W导管;正欲,马德里,西班牙)与戊巴比妥钠麻醉后(戊巴比妥钠;赛诺菲安万特桑特Animale比荷卢经济联盟,布鲁塞尔,比利时;45 mg·公斤体重gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba(bw)gydF4y2Bai.p。gydF4y2Ba)。仓鼠是灌输一个随机的基础上用猪胰弹性蛋白酶(σ40 U弹性蛋白酶··bw 100克gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba体积的0.4毫升氯化钠0.9%·100 g·bwgydF4y2Ba−1gydF4y2Ba,n = 30)或0.4毫升氯化钠0.9%·100 g·bwgydF4y2Ba−1gydF4y2Ba(控制动物:C)。动物被关在笼子里,提供标准实验室根据需要食物和水。的医学院动物实验委员会Katholieke项目鲁汶研究批准。gydF4y2Ba
外科手术gydF4y2Ba
四个月后气管内的弹性蛋白酶滴剂,肺气肿的动物被随机分为三组:1)肺气肿的仓鼠(n = 7), 2)气性和虚假的仓鼠(n = 7)和3)气性LVRS仓鼠(n = 16)。LVRS仓鼠了胸骨切开术,右侧胸膜切入,胸廓。一个线性的两臂刀(ETS-Flex 35毫米;Ethicon Endo-Surgery公司,辛辛那提,哦,美国)含有薄主食用于人类血管手术(Endopath TR35W;Ethicon Endo-Surgery公司,辛辛那提,哦,美国)滑在订书机刀前的肺被激活。左肺执行同样的步骤。玛珊德的过程已经详细描述gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
切除,估计视觉,旨在消除肺容量的25 - 30%。假的动物组接受相同的程序除了肺切除术。gydF4y2Ba
六个仓鼠LVRS组和一个虚假的动物手术结束后不久死亡。三个LVRS集团的其他动物死在手术后的几天。尸检显示胸膜腔的重要部位的血在所有情况下。最后,虚假和LVRS组包含6和7个动物,分别。saline-instilled仓鼠作为控制仓鼠,没有受到任何外科手术(n = 11)。gydF4y2Ba
肺气肿:评价功能余气量测量gydF4y2Ba
手术后9周(和在同等年龄控制动物),功能余气量(FRC)测量被古使用设置执行修改gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba19gydF4y2Ba。而不是使用体积恒定体积描记器,流体积描记器使用。因此,pneumotachograph(汉斯·鲁道夫8420 b;汉斯·鲁道夫Inc .,堪萨斯城,密苏里州,美国)连接到一个压差传感器(MP45;Validyne,北桥、钙、美国;范围±2而言不啻gydF4y2Ba2gydF4y2BaO)就放置在身体的墙盒和体积变化的计算是通过集成流的信号。所有体积测量进行至少一式三份。这些都是平均的统计分析。gydF4y2Ba
rt - pcr过程的测量IGF-I,肌原性的因素和Id-protein mRNA水平gydF4y2Ba
RNA提取gydF4y2Ba
肺容积测量完成后,这些动物被小心翼翼地机械通风和隔膜gydF4y2Ba全体gydF4y2Ba剖腹手术后。隔膜被玷污,称重,在液态氮冷冻和储存在−80°C。总核糖核酸(RNA)孤立使用修改后的guanidium isothiocyanate-cesium氯的方法gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba。大约0.15克的组织转移到一个解决方案包含50%(重量/体积)硫氰酸guanidium 25毫米乙二胺四乙酸(EDTA), 0.5%十二烷基肌氨酸和0.1 2-mercaptoethanol和均质Ultra-Turrax均质器(德国Janke & Kunkel)。匀浆是分层的解决方案包含5.7中海,25毫米醋酸钠(pH值5.0)和10毫米EDTA。超速离心法后20°C SW41转子100000×(贝克曼,德国)gydF4y2BaggydF4y2Ba∼16 h,上层清液被除去,RNA颗粒溶解在水中。RNA被添加十分之一体积的乙酸钠沉淀(3 M、pH = 5.2)和2.5卷绝对乙醇。样本储存在夜里−20°C。第二天,RNA与70%乙醇清洗,真空干燥和重新溶解在水里。RNA的数量是由光密度(OD)在260 nm和280 nm。gydF4y2Ba
逆转录酶反应gydF4y2Ba
总RNA(2.5µg)受到低聚糖(脱氧胸苷)启动第一链互补脱氧核糖核酸(互补)合成在一个卷20 GibcoBRL-kit (THERMOSCRIPTµL遵循指令gydF4y2BaTMgydF4y2Bart - pcr体系,生活技术喷嘴速度、Merelbeke、比利时)。gydF4y2Ba
聚合酶链反应gydF4y2Ba
所有应用引物都使用向量NTI软件设计,并由GibcoBRL (GibcoBRL定制的引物,生活技术,苏格兰,英国。第一链cDNA 2-µL部分样本用于50µL聚合酶链反应(PCR)反应(GeneAmp®PCR核心试剂设备;珀金埃尔默,Lennik,比利时)按照表1中规定的条件gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba。PCR循环的数量被调整以避免饱和放大系统。也最优MgClgydF4y2Ba2gydF4y2Ba每个引物浓度和退火温度成立。PCR产品被确定大小。放大产品丙烯酰胺凝胶电泳,分析了6% (w / v)。凝胶是沾Vistra绿色(Amersham生命科学,白金汉郡,英国)和乐队的荧光强度量化通过PhosphorImager模型425(美国分子动力学,桑尼维尔CA)和ImageQuant软件。扩增片段的乐队强度归一化到相应L32(辅助基因)放大信号。每个引物PCR过程重复进行,至少。gydF4y2Ba
统计分析gydF4y2Ba
组间比较用单向方差分析进行。差异意味着使用邓肯进行评估gydF4y2Ba因果gydF4y2Ba测试所有成对比较。数据表示为±sd方法。gydF4y2Ba
结果gydF4y2Ba
和隔膜体重gydF4y2Ba
组间体重相当的时候滴剂(集中值:130±7 g)。然而,手术的时候,体重显著低于LVRS仓鼠相比,虚假的动物(p < 0.01)(表2gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。手术的时间相比,体重LVRS仓鼠解剖当时显著降低(p < 0.05)。gydF4y2Ba
解剖的时候,意味着隔膜重量为0.26±0.02,0.23±0.03,0.23±0.02,0.21±0.03 g控制、气肿,分别骗局和LVRS仓鼠。为体重标准化时,隔膜重量相等的四组(表2所示gydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
功能余气量测量gydF4y2Ba
控制(1.05±0.17毫升)相比,FRC为2.05±0.69 (p < 0.01), 1.84±0.46 (p < 0.05)和1.58±0.60毫升(ns)气性,虚假和LVRS动物,分别为(图1所示gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。FRC在肺气肿,因此增加了94%,75%,虚假的50% LVRS动物相比,控制。所以,LVRS气性仓鼠的FRC值减少了23%。gydF4y2Ba
PCR实验gydF4y2Ba
所有数据相关报道在这一节中获得的结果与获得的数据归一化后与L32(图2所示gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
肌原性的mRNA水平变化的因素gydF4y2Ba
MyoD和myogeningydF4y2Ba
引物设计放大221个基点和688个基点的片段MyoD myogenin,分别。控制相比,MyoD mRNA水平减少骗局(−28% ns)和LVRS动物更是如此(−58%,p < 0.05),而没有观察到变化气性仓鼠(图3所示gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。还在观察MyoD mRNA表达明显降低LVRS相比肺气肿(−59%,p < 0.05)。相反,myogenin后会增加无意义的肺气肿(+ 62%),虚假的(+ 34%)和LVRS(+ 33%),而控制(图。4gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。因此,控制相比,比率MyoD myogenin减少气性动物(−29% ns)和明显虚假的(−45%,p < 0.05), LVRS仓鼠(−68%,p < 0.01)(图5所示gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。这一比率从肺气肿骗局和LVRS逐渐减少。gydF4y2Ba
myf-5gydF4y2Ba
441个基点片段myf-5 mRNA的rt - pcr使用后获得特定的引物。没有明显的变化myf-5表达式被认为在四组之间。gydF4y2Ba
MRF4gydF4y2Ba
272个基点的片段是MRF4放大。至于myf-5相似,无显著变化MRF4 mRNA水平观察任何条件。gydF4y2Ba
Id-proteins mRNA水平变化gydF4y2Ba
Id-protein 1gydF4y2Ba
控制相比,符合mRNA水平(475个基点片段)倾向于逐步减少在肺气肿(−23% ns),虚假的(−34%,p < 0.05)和LVRS动物(−48%,p < 0.01)(图6gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
Id-protein 2gydF4y2Ba
相应地,控制相比,id 2表达水平(316 bp片段)减少类似肺气肿后(−32%)和虚假的(−33%)和在LVRS达到统计学意义(−37%,p < 0.05)(图6 bgydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
Id-protein 3gydF4y2Ba
id 3, 387个基点放大片段的表达水平在所有团体保持不变。gydF4y2Ba
Id-protein 4gydF4y2Ba
Id-4表达水平低于检出限的技术。gydF4y2Ba
IGF-I mRNA水平变化gydF4y2Ba
控制相比,IGF-I表达水平(151个基点片段)倾向于减少44%,74%和59%在气性,虚假和LVRS动物,分别,没有达到统计学意义。gydF4y2Ba
讨论gydF4y2Ba
目前的研究表明:1)MyoD / myogenin比率下降肺气肿和虚假的LVRS后更是如此,由于减少MyoD mRNA水平和增加myogenin mRNA和2)肺气肿和虚假的诱导减少隔膜的符合和id 2 mRNA水平;这种减少LVRS后更加明显。gydF4y2Ba
然而,应该注意这个模型有很大的局限性。作者表现LVRS知名肺气肿模型gydF4y2Ba21gydF4y2Ba。气管内的弹性蛋白酶是诱发肺气肿的散射类型与α密切相关的小叶性肺气肿模仿gydF4y2Ba1gydF4y2Ba抗胰蛋白酶缺乏症gydF4y2Ba21gydF4y2Ba。因此,它不同于特征吸烟引起的小叶中心的肺气肿,在上部叶优先发展。尽管elastase-induced肺气肿仓鼠并不增加电阻的呼吸gydF4y2Ba22gydF4y2Ba,戏剧性的变化在几何的吸气肌肉明显增加了这些肌肉负荷脸上的肌肉纤维的水平。因此,elastase-induced肺气肿的模型适用于解决不同的问题相关的改变发生在呼吸道的生理基础力学和LVRS后呼吸肌肉功能。gydF4y2Ba
sham-operated仓鼠的体重并没有改变手术后,虽然体重LVRS仓鼠下降了9%。这个减肥可能表明LVRS分解反应诱导一些仓鼠,这可以解释观察到的差异在mRNA表达虚假的和LVRS动物。后观察到的mRNA下调sham-operation LVRS后更为明显,这可能部分源于仓鼠的异化的状态。gydF4y2Ba
FRC测量显示,肺气肿的程度得到了在目前的研究有点低于先前的研究的作者gydF4y2Ba3gydF4y2Ba。然而,即使LVRS 9周后,在mRNA水平的显著变化的一些转录因子描述仍然可以观察到的早些时候,尽管温和的样本容量和较低水平的肺气肿。作者所知,这是第一个研究的表情肌原性的监管因素和测量Id-proteins隔膜在肺气肿动物模型。此外,样品不能在不同的时间点由于实验条件。gydF4y2Ba
作者之前的研究表明IIx / b型转向IIa纤维隔膜的气性和atp酶染色LVRS-treated仓鼠gydF4y2Ba3gydF4y2Ba。类似的结果中斜角肌的气性仓鼠,MHCIIa的相对数量的增加和IIa纤维和减少MHCIIx和类型IIx纤维被报道gydF4y2Ba23gydF4y2Ba。此外,纤维转向较慢的概要文件在这个研究可以与莱文观察到的转变gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba,他发现增加的比例含量缓慢I型纤维和IIb IIa的比例较低,纤维隔膜的严重慢性阻塞性肺病患者。同时,负的线性相关性在一秒用力呼气量(FEVgydF4y2Ba1gydF4y2Ba)和缓慢的隔膜肌凝蛋白的比例是在慢性阻塞性肺病患者gydF4y2Ba24gydF4y2Ba。由于慢性阻塞性肺病导致慢性呼吸道肌肉负载和能量消耗增加,增加抵抗疲劳预计为作者的早期研究讨论gydF4y2Ba3gydF4y2Ba。事实上,没有隔膜LVRS后纤维成分数据的病人。在目前的研究中,隔膜纤维成分实际上并不是衡量但是作者之前的研究中观察到的数据是指gydF4y2Ba3gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
肺气肿后MyoD / myogenin比率逐渐下降,虚假的甚至更后LVRS在目前的研究中,由于减少MyoD mRNA水平和增加myogenin mRNA水平。这些数据表明,开胸有影响的mRNA表达肌原性的监管因素,符合和id 2蛋白质。肺气肿后轻微的mRNA水平变化观察到假后更加明显。肺气肿有或没有虚假的操作之间的差异作为一个整体,然而,微妙。操作本身可能影响骨胸腔配置,进而可能会影响呼吸道肌肉功能和几何。虽然MyoD / myogenin比率的下降在虚假的动物更强调LVRS之后,这个比例在两组之间没有显著差异。毫不奇怪,在纤维转变级别差异没有检测到gydF4y2Ba3gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
减少MyoD / myogenin比率符合克劳斯和Pette的结果gydF4y2Ba25gydF4y2Ba谁证明减少MyoD mRNA水平和增加myogenin表达水平在老鼠的肌肉受到甲状腺功能减退和低频刺激,gydF4y2Ba即。gydF4y2Ba治疗已知的诱导速度减缓纤维过渡gydF4y2Ba26gydF4y2Ba。此外,MyoD是主要表现在增大肌肉,而在slow-twitch myogenin是普遍的肌肉gydF4y2Ba7gydF4y2Ba,gydF4y2Ba27gydF4y2Ba,gydF4y2Ba28gydF4y2Ba。有越来越多的证据的假设MyoD / myogenin比率的变化可能是纤维转变背后的驱动力之一gydF4y2Ba7gydF4y2Ba,gydF4y2Ba8gydF4y2Ba,gydF4y2Ba28gydF4y2Ba。事实上,据报道,蚀变的快/慢fibre-type分布由甲状腺激素治疗或cross-reinnervation总是伴随着相应的变更在MyoD / myogenin mRNA表达模式在大鼠后肢肌肉gydF4y2Ba28gydF4y2Ba。此外,Mozdziak的研究gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba显示比例MyoD / myogenin可能是重要的肌肉纤维的表型转换后大鼠后肢。最后,苏厄德的研究gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba9gydF4y2Ba报道,相关MyoD表达式和myofibre表型之间的关系似乎是诱发的小鼠骨骼肌隔膜和其他一些。gydF4y2Ba
自观察纤维转移可能与负荷放在隔膜,似乎逻辑MyoD / myogenin比例也与负载有关。目前的研究表明一个线性下降的这个比例控制,肺气肿的骗局和LVRS动物(图5所示gydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba)。因此,在分子水平上,LVRS似乎并不气性仓鼠的隔膜起到有益的作用。这个观察是按照作者之前的研究的结果,在LVRS没有改善隔膜收缩特性gydF4y2Ba3gydF4y2Ba。如果LVRS有利于气性仓鼠的隔膜,MyoD / myogenin比率的增加和逆转气性纤维改变观察的仓鼠会被预期。这显然不是这样。gydF4y2Ba
无论是气性仓鼠的隔膜,还是LVRS的动物显示改变的mRNA水平myf-5和MRF4在这项研究中,这表明,这两个因素都扮演着一个重要的角色在隔膜fibre-type转变,观察到在这个模型。然而,表情肌原性的监管因素和Id-proteins似乎与时间有关gydF4y2Ba7gydF4y2Ba,gydF4y2Ba12gydF4y2Ba。因此,这可以解释为什么MRF4和myf-5 mRNA隔膜的变化,在样本收集,没有观察到。gydF4y2Ba
符合隔膜和id 2 mRNA水平下降后肺气肿,虚假的和gydF4y2Ba更不必说了gydF4y2Ba在LVRS这仓鼠的研究。Id-proteins之间的关系和肌肉fibre-shift尚未彻底研究和文学在这个主题是稀缺的。克劳斯和PettegydF4y2Ba25gydF4y2Ba没有观察到的变化符合mRNA在大鼠骨骼肌受到甲状腺功能减退和低频刺激,gydF4y2Ba即。gydF4y2Bafast-to-slow纤维过渡的模型。目前,这是知之甚少Id-proteins和肌肉可塑性之间的关系,主要集中在周边的肌肉。甘德森和MerliegydF4y2Ba29日gydF4y2Ba发现符合mRNA水平的三倍增加大鼠后肢肌肉去神经后4天。亚当斯也得到类似的结果gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba12gydF4y2Ba报告符合mRNA水平峰值去神经大鼠后肢肌肉后2个月。此外,肌肉类型,以及模型对肌肉的可塑性和调查的时机是关键决定因素的规定Id mRNA水平,这可能是负责不同的研究之间有争议的数据。这些抑制因子的观测下调本研究可能促进隔膜适应过载。gydF4y2Ba
不幸的是,作者并没有能够执行分析在蛋白质水平。因为仓鼠不属于经常使用实验室动物,如老鼠和老鼠,只有少数hamster-specific产品开发的生物分子。因此,没有hamster-specific抗体可用于Id-proteins和肌原性的监管因素。gydF4y2Ba
在目前的研究中,IGF-I mRNA水平倾向于减少隔膜肺气肿(−44%)后,假(−74%)和LVRS(−59%),但未达到统计学意义。这可能是由于:1)个人间变异性高,2)每组样本量相对较小。只有少数数据存在关于IGF-I和肌肉纤维表型的变化之间的关系。杨gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba14gydF4y2Ba报道,被动的兔后肢肌肉诱导增加IGF-I mRNA在单独的肌肉纤维,它是伴随着增加纤维表达慢肌凝蛋白。至于肌原性的监管因素和Id-proteins,肌肉纤维类型和模式切换IGF-I动力学的重要决定因素。gydF4y2Ba
结论:1)肺气肿后MyoD / myogenin比率下降,虚假和肺减容手术可能导致纤维隔膜的转变,2)减少MyoD / myogenin比率在肺减容手术动物表明肺减容手术提高而不是降低负载放在隔膜和3)观察到抑制因子的下调可能促进隔膜适应过载。gydF4y2Ba
- 收到了gydF4y2Ba2001年11月22日。gydF4y2Ba
- 接受gydF4y2Ba2002年1月18日。gydF4y2Ba
- ©人期刊有限公司gydF4y2Ba
引用gydF4y2Ba
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