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严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2 (SARS-CoV-2)正在导致当前的冠状病毒病(COVID-19)大流行[1]。在过去的几个月里,已经发表了一种新的新型研究文章,处理了疾病的多个方面和表现。增加证据表明,SARS-COV-2感染中内皮细胞(ECS)的核心作用[2-5.]。早期的研究已经表明在Covid-19肺组织中的血管和炎症因子(如VCAM-1,IL-8或MCP-1)的表达增加了[2]。内皮功能障碍和改变的内皮细胞完整性的标记是SARS-COV-2感染差的重要预测因子[6.),并与肺水肿、血管内血栓形成和急性呼吸窘迫综合征(ARDS)有关。肺内皮对调节血管张力、炎症反应、凝血/纤溶、维持血管稳态和通透性至关重要。这些严格调控过程的干扰可能直接导致发病率和死亡率。然而,导致COVID-19肺血管病变的确切机制尚不清楚。在这里,我们提供了几个涉及炎症反应的重要血管标记物(e -选择素,细胞间细胞粘附分子(ICAM-1),血管细胞粘附分子(VCAM1)),微血管完整性的维持(CD31, VEGFR-2),血小板活化和凝血(p -选择素,COVID-19患者肺组织和血浆样本中血管性血友病因子(vWF)的含量。
肺组织样品从19名危重Covid-19患者和11名和性匹配的尸检控制后收集鼠后验尸,没有肺部病理学。Covid-19和75年的中位年龄为各自的尸检控制(图1一个)。研究议定书和组织使用由格拉茨医科大学的伦理委员会批准(EK-Number:32-362 ex 19/20)。从均化肺组织中分离RNA,并如前所述进行CDNA合成和定量实时PCR(QPCR)[7.]。使用vWF (1:100, #M0616, Agilent, Santa Clara, CA)和CD45 (1:500, # 10558, Abcam, UK)以及Alexa Fluor 555或Alexa Fluor 488 (1:500, Abcam, UK)标记的二抗,对对应的COVID-19患者和尸检对照的福尔林固定石蜡包埋肺组织进行免疫荧光染色。分别是Thermofisher Scientific, Waltham, MA)。来自德国汉诺威医学院和德国吉森尤斯图-李比希大学临床免疫学和输血医学系的21名COVID-19重症患者和22名健康对照者的血浆样本。COVID-19患者年龄中位数为59岁,对照组为61岁。90%的患者和89%的对照组是男性。COVID-19患者均病情严重,需要使用血管加压药和机械通气(图1 b)。调查得到了当地伦理委员会的批准(汉诺威样本:SEPSIS/ARDS Registry 8146_BO_K_2018,吉森样本:伦理投票号。: 05/00),并获得所有参与者或其近亲的书面知情同意。通过LEGENDplex™Assay测定血浆e -选择素、p -选择素、ICAM-1、VCAM-1和CD31的水平。使用Sandwich高灵敏度ELISA试剂盒定量vWF (#EHVWF, Thermofisher Scientific)和IL-6、IL-8、TNFα和MCP-1 (Biolegend, San Diego, CA)血浆水平。R(版本号4,www.r-project.org.)。数据表示为具有Boxplot叠加层的单个数据点,指示中位数和间隔率范围。使用Wilcoxon Mann-Whitney U-Test进行比较不同的群体。使用Spearman的等级相关进行相关性。
基因表达分析显示,与对照组相比,COVID-19肺组织中ICAM-1、vWF和VEGFR2 (KDR)表达上调(图1 c)。炎症细胞标志物CD45和vWF的免疫荧光染色显示炎症细胞外渗增加,vWF信号更明显、更弥漫性(图1 d)在Covid-19与对照肺相比。后者可能反映高VWF脱落,这是循环循环升高的循环级别的假设(图1 e)。在VWF旁边,我们发现在Covid-19等离子体中的VCAM-1,E-SELECTIN和CD31水平显着增加(图1 e),表明COVID-19中内皮细胞激活/失调。此外,COVID-19血浆中炎性细胞因子IL-6、IL-8、MCP-1和TNFα水平显著升高(图1 f)。详细的相关分析显示,一些内皮来源的标志物之间有很强的相关性,但与年龄或一般炎症参数(如c反应蛋白(CRP))之间只有微弱的相关性。图1克)。D-二聚体水平与可溶性VWF强烈相关,同时增加PTT与表面标志物ICAM1,E-SELETIN和CD31的脱落相关(图1克,H)。纤维蛋白原水平与p-selectin的增加相关(图1 h)。此外,IL-8的血浆水平与循环VWF水平强烈相关(图1 h)。总之,局部以及全身性循环炎症标志物与各种标志物相吻合,揭示了Covid-19患者的内皮活化和损伤。
肺内皮是紧密调节的器官,包括在生理和病理条件下的各种功能。对肺部的炎症细胞募集是通过在内皮细胞表面表达的选择汀(E-SELIEN,P-SELECTIN)和细胞粘附分子(ICAM-1,VCAM-1)介导的。这些分子要么储存,要么释放(p-selectin)或出现德诺维合成(ICAM-1, VCAM-1, e -选择素)响应特定的细胞因子环境[8.]。过量生产的促炎细胞因子,一种所谓的“细胞因子风暴”,已经在严重的Covid-19中报告了[9.-11]并在这里确认。细胞因子风暴有助于从保护性对炎症EC表型的开关,与血管泄漏,组织损伤和免疫血栓形成相关。粘附分子的脱落表示高度活性的内皮,而升高水平的血浆CD31还与EC细胞凋亡相连[8.]。考虑到黏附分子(e -选择素、VCAM-1、ICAM-1)和CD31循环水平的增加,我们的数据表明,在严重的COVID-19中,内皮高度炎症,部分受损。vWF mRNA和蛋白水平的局部改变以及其在COVID-19肺中的斑片状和弥漫性分布证实了这一观点。我们的数据显示,vWF和IL-8的相关性意味着这些蛋白同时从Weibel-Palade体内释放,确保了对炎症细胞损伤和招募的快速反应,进一步突出了COVID-19危重患者的内皮压力和激活。同时上调VEGFR-2表达可能会表现出代偿性血管生成,这在不同病情严重程度的COVID-19患者中已被观察到[2]。值得注意的是,由于流感的血流量相比,肺组织中VCAM-1,IL-8和MCP-1的表达增加了对Covid -19的表达特异性[2]。总体而言,我们的数据显示本地德诺维内皮激活和损伤标志物的合成表明,肺有助于血浆中这些蛋白质的池。然而,肺对其他器官的贡献的大小和比率有待于未来的研究。
一般来说,静静的肺内皮酸支持纤维蛋白溶解的维持[9.]。然而,促炎介质的存在驱动促凝固状态,最终导致凝血和血栓形成的过度激活,如Covid-19患者所见。我们发现,不仅循环水平的VWF,而且其在肺中的表达在严重的Covid-19患者中强烈升高。VWF储存在EC损伤时从Weibel-Palade机构中储存并迅速释放。局部促进血小板粘附和血栓形成[8.]。最近的一些出版物表明VWF在Covid-19血管病变中的重要作用[12那13]和急性肺栓塞后的残余肺梗阻[14]。重要的是,据报道,升高的VWF水平与感染SARS-COV2感染的患者的疾病严重程度和死亡率有关[12]。循环VWF和D-二聚体之间的良好正相关,凝血活化和严重Covid-19中预后差的标志物,使得促抗凝过程与内皮功能障碍直接相关的亲和抗凝过程之间的不平衡。最近的一项研究还强调了使用IL-8来区分Covid-19患者的高死亡率[11]。最近的研究结果表明,与非COVID-19急性呼吸窘迫综合征相比,COVID-19急性呼吸窘迫综合征患者的循环细胞因子水平较低,而重症COVID-19患者的局部血栓前状态增加,并伴有纤溶功能减退[15]。在一起,累积评估EC激活/损伤和炎症的几个标志物可能是评估免疫形成的疗效,从而抑制住院治疗患者的栓塞血管闭塞的有价值的工具。
本研究受到缺乏非Covid-19疾病对照的限制,然而,我们的数据有利于肺内内皮在全身免疫病理学下面的Covid-19中的重要作用。符合其他报告,我们的作品在严重的Covid-19患者中看到内皮功能障碍和肺凝血病之间的联系。虽然需要进一步的研究来充分了解疾病的发病,进展和解决的内皮变化,但我们的数据解开了几个参与炎症细胞招募的EC标记,患者患有危险的Covid-19患者的患者的舒适和凝血。虽然,将这些标记集成到临床实践中可能允许更好地预测Covid-19结果,因此需要使用较大群组的进一步前瞻性研究。
确认
我们要感谢Simone Tischler和Thomas Fuchs,以实现优秀的技术援助。作者感谢临床免疫学和输血医学研究所,Giessen和Marburg肺中心(UGMLC)的大学进行获取和提供对照等离子体样品。博士候选人ElisabethFließer由奥地利研究促进机构(FFG,项目编号:34926649)资助,并在GRAZ医学大学的博士学位分子医学框架内培训。M.W.认识到德国研究基金会的资助(DFG,SFB-TR84,Project A2)。
脚注
利益冲突:Birnhuber博士没有披露。
利益冲突:Fließer博士没有披露。
利益冲突:Gorkiewicz博士无需披露。
利益冲突:Zacharias博士没有披露。
利益冲突:西格尔博士没有什么可透露的。
利益冲突:Dr. David报告赠款来自德国研究基金会,赠款来自Cytosorbents,从null,在提交的工作之外;。
利益冲突:Welte博士在研究过程中获得了德国研究和教育部的资助;来自罗氏、诺华、GSK、阿斯利康、勃林格、提交作品之外的个人费用;。
利益冲突:施密特博士没有什么可透露的。
利益冲突:Olschewski博士从MSD,个人费用和非财政支助的拜耳,赠款,个人费用和非财政支助的拜耳,赠款,个人费用和非财政支持的个人费用和非财政支持从辉瑞,个人费用和个人费用Novartis的非财政支持,Zehringer的赠款,诸如Chiesi的个人费用,Menarini的个人费用,MENARINI的个人费用,来自ASTRA ZENECA的个人费用,GSK的个人费用,GSK的个人费用来自算法的补助金科学,在提交的工作之外;Horst Olschewski是Ludwig Boltzmann肺血管研究研究所的联合主任,奥地利格拉茨。
利益冲突:Wygrecka博士无需披露。
利益冲突:Kwapiszewska博士没有什么可透露的。
- 收到了2020年11月27日。
- 公认4月26日,2021年4月。
- 版权所有©作者2021。
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