摘要
在轻/中度COPD小气道中检测到原发性和运动性纤毛发生的改变,这可能是上皮重构开始的起源http://bit.ly/3Tz3JDj
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慢性阻塞性肺病的特点是气道阻塞和肺气肿导致进行性和不可逆的气流限制[1].我们和其他研究人员发现COPD支气管上皮重构的特征是纤毛发生和纤毛功能的改变[2,3.],以及非运动性初级纤毛(PC)的调节异常[4].慢性阻塞性肺病的梗阻部位主要在小气道[5].考虑到慢性阻塞性肺病首先是一种小气道疾病[6- - - - - -8],我们研究了COPD细支气管上皮的分化,重点是运动性和原发性纤毛发生。
细支气管,定义和选择为小气道(最大直径约2毫米),无任何显微镜可观察到的软骨,来自于非copd的手术切除(n=7, 100%男性;平均(四分位差(IQR))年龄70.6(63-87)岁,FEV187%(71-105%))和轻/中度COPD (n=9, 88.9%男性;平均(IQR)年龄67.1(54-84)岁,FEV174%(68-82%))肺。细支气管上皮细胞从细支气管中酶解分离,翻转至内向外暴露,并使用改良的BEGM (Lonza, Walskerville, MD)培养基建立气液界面(ALI)培养[9].所有患者均为戒烟史(戒烟超过6个月)或当前吸烟者,各组间吸烟史无差异(非copd: 6/7戒烟者,平均IQR包年46 (35-60);COPD: 6/9的戒烟者,平均(IQR)包年43(20-65)。使用人体组织经患者书面同意(生物收集DC-2012-1583, IRB 00003888 Inserm 21-775)。在ALI日进行免疫荧光染色(D) 25个培养物(甲醇固定和福尔马林固定石蜡包埋培养物)和肺组织(非copd: n=8, 62.5%男性,平均(IQR)年龄72.9(62-83)岁;COPD: n=6, 83.3%男性,平均(IQR)年龄65.8(56-80)岁),抗arl13b抗体[4],抗-β-微管蛋白[9], anti-MUC-5AC [9], anti-CK13 [9]和anti-SCGB1A1 (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)。使用AxioImager Z1显微镜(Carl Zeiss, Oberkochen,德国)或VS120自动滑片扫描仪(Olympus, Rungis,法国)获取图像。使用TOX8试剂盒(Sigma, St Louis, MO, USA)评估细胞增殖。如前所述,通过RT-qPCR评估培养物中纤毛发生效应因子(ALI D0, D7, D15和D25)的表达[3.].特异性引物(Eurogentec, Seraing,比利时)P63(forward-5 -CGCCATGCCTGTCTACAA-3, reverse-5 -TGACTAGGAGGGGCAATCTG-3),E2F4(forward-5 -ATCAAGGCAGACCCCACA-3, reverse-5 -GGGCAAACACTTCTGAGGAC-3),GMNC(forward-5 -ACGGAGACTTGGGTCTCTTTC-3, reverse-5 -TCCGGAAGAGGAAAATTTGA-3),GRHL2(forward-5 -CTTTACCTGGGACGTGAATGA-3, reverse-5 -GGAAGTCCTTTCACCCCTTT-3),RFX3(forward-5 -ACCTCAACCGTGTCGACTTT-3, reverse-5 -GCTGCTGAAGCATCTTGAAGT-3),SCGB1A1,FOXJ1,MUC-5AC,HEATR2,MCIDAS而且RFX2,所有先前描述的[3.,10].结果归一化到管家基因GAPDH表达式[3.,10].相对表达量(ΔΔCt)表示为各组各基因相对于ALI D0值的倍数变化。结果以均数±表示扫描电镜.数据分析采用Mann-Whitney检验。p<0.05为差异有统计学意义。
为了破解COPD患者SAD和气道重塑的细胞机制,我们研究了ALI培养中的细支气管上皮分化。在完全分化的COPD上皮细胞中,计算机辅助定量(每次培养10张图像,覆盖总表面的80%)显示β-小管蛋白阳性多嵴细胞(mcs)的数量减少了两倍(1306±282 mcs / mm)2与634±57 mcs / mm2慢性阻塞性肺病,与non-COPD) (图1一个).尽管在COPD培养中检测到ck13阳性的基底细胞、mucc - 5ac阳性的杯状细胞和共表达mucc - 5ac和SCGB1A1的细胞数量略有增加,SCGB1A1阳性的俱乐部细胞数量略有减少,但这些值在非COPD和COPD培养中没有显著差异,如先前报道的对患有和不患有COPD的前/当前吸烟者的比较[11].细胞增殖在各组间无差异(未显示)。
慢性阻塞性肺病细支气管上皮的运动性和原发性纤毛发生发生改变。a)在非COPD (n=7)和COPD (n=9)人细支气管培养物中β-小管蛋白阳性(红色)多髂细胞(mcs)的免疫检测和定量(D)第25天(ALI)。细胞核用DAPI染色(蓝色)。结果以均数±表示扫描电镜.b)非COPD (n=7)和COPD (n=9)培养中纤毛发生效应因子GMNC、MCIDAS、E2F4、FOXJ1、RFX2、RFX3、GRHL2和HEATR2经gapdh归一化表达后,ALI D7、D15和D25(与ALI第0天相比)折叠变化的RT-qPCR评估直方图。结果以均数±表示扫描电镜.c)来自非COPD和COPD ALI D25培养切片的代表性荧光显示存在运动纤毛和初生纤毛(PC),使用针对Arl13b的抗体染色(红色)。细胞核用DAPI染色(蓝色)。框内区域显示为PC的放大倍数(箭头)。直方图表示PC细胞的定量(占总细胞的%)。结果以均数±表示扫描电镜.n=7个非COPD培养物,n=9个COPD培养物。d)在小气道组织的非COPD (n=8)和COPD (n=6)切片上,使用针对Arl13b的抗体(红色)染色,显示运动纤毛和PC的代表性显微照片。细胞核用DAPI染色(蓝色)。框内区域显示为PC的放大倍数(箭头)。直方图表示每毫米上皮细胞PC的定量。结果以均数±表示扫描电镜.*: p < 0.05;* * *: p < 0.001。
因此,我们进一步探索纤毛发生调控因子的表达[12],在ALI D0时,非COPD培养物与COPD培养物之间无显著差异(图1 b).在GMNC的控制下,mcs从基底细胞中分化,GMNC是纤毛细胞命运的主要调节因子,其表达在COPD中低于ALI D25的非COPD分化培养中(5.6±2.7与ALI D0值变化24.1±13.4倍)。GMNC激活MCIDAS,形成含有E2F4的复合物EDM,激活中心粒生物发生所需的基因。有趣的是,我们发现MCIDAS表达较低(93.2±59.1)与226.3±152)和E2F4(1.5±0.1与(2.2±0.3))。EDM还激活了多髂发生后期的转录因子,这些转录因子是基底体与根尖表面对接和活动纤毛形成所必需的。其中FOXJ1、RFX2和RFX3在ALI D25 COPD培养中被下调(2545±664与7800±1956,12.8±2.8与42.7±14.3,7.3±1.2与30.7±6.2,慢性阻塞性肺病与分别为non-COPD)。此外,已知可调节MCIDAS和RFX2的GRHL2在COPD中表达量比非COPD分化培养物在ALI D25中低两倍(3.6±0.7)与7.5±2.2)和HEATR2参与了动力蛋白复合物组装的起始(1.3±0.1)与2.8±0.4)。重要的是,这些纤毛发生的调控因子,即GMNC、E2F4、FOXJ1、RFX2、RFX3和HEATR2,在COPD培养中表达在ALI D15后趋于稳定,而在非COPD培养中表达则有所不同。mcc起源于原代纤毛细胞[10,13],我们之前报道了COPD支气管上皮中PC的异常调节[3.,4].因此,我们分析了细支气管上皮的初生纤毛发生。与支气管一样,PC在培养中定位于分化上皮基底部的未分化细胞(图1 c)和纸巾(图1 d).双盲手动计数(每次培养3 - 6个随机字段)显示,与非COPD培养相比,COPD的PCC数量减少(5.5±0.7%)与11±0.5%的总细胞),反映了组织中的观察结果(10.7±1.6 .与17.7±2.9 PC / mm上皮)。
尽管小气道在COPD发病机制中起着至关重要的作用[6],对细支气管上皮生物学的研究仍然很少,因为非先前扩增的原代细胞的分离和培养非常复杂。我们通过对小气道进行显微解剖来避免这一困难。这使我们能够收获数百万个上皮细胞,从而避免了ALI培养前的预先扩增,从而导致细胞的主要特征丧失,特别是在MCC分化能力方面[9].因此,我们能够首次强调COPD中细支气管MCC分化的内在损伤。我们的在体外模型无炎症,且所有患者都是前吸烟者或当前吸烟者,吸烟史无差异,我们证明了轻/中度COPD患者小气道多髂发生的环境和烟草无关改变。这种MCC缺陷伴随着在纤毛构建过程中起作用的关键多髂发生调控因子的下调和PCCs数量的减少。COPD小气道上皮中PCCs数量的减少与mcs数量的减少有一定的相关性。事实上,此前有报道称,去除气道未分化细胞的PC会导致多髂发生受损[10]而鼠气管mcs起源于PCCs [13].然而,在COPD支气管上皮中,PCCs的数量显著增加,特别是在上皮重构区域,这表明PC参与了COPD上皮修复/再生过程的改变[4].可以假设,小气道上皮比大气道上皮更不容易受到环境相关的损伤,因此不易再生。因此,PC在调节小气道重塑中的作用仍有待阐明。基于我们的结果,我们可以提出PC在调节细胞命运的复杂分子机制中所起的不同作用,这取决于上皮的位置和环境刺激。
我们研究的一些局限性是,在这一现象中没有考虑到COPD治疗的潜在影响,并且细支气管上皮细胞起源处的患者数量较少。然而,这最后一个缺点也代表了一个优点。事实上,COPD的原发性细支气管和运动性纤毛发育缺陷在一个小规模队列中得到了令人信服的证明,这表明了报道现象的稳健性。
总之,我们已经证明了轻/中度COPD患者小气道中运动性和原发性纤毛发生受损。这些改变可能会影响粘液纤毛清除,并可能参与气道上皮重构机制的启动和/或肺气肿的发展[14].未来可能需要关于严重COPD的数据和纵向数据,以提供证据,证明纤毛发生改变是一些有发展为COPD风险的吸烟者的一种内在异常,或在早期疾病中看到的一种特征和/或与严重程度相关。这种上皮分化失调的决定因素和潜在机制也必须确定,以为开发COPD患者的新治疗策略铺平道路。
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脚注
作者贡献:研究概念:C. Coraux;研究设计:E. Luczka-Majérus和C. Coraux;数据采集:E. Luczka-Majérus, A. Bonnomet, A. Germain, N. Lalun, C. Kileztky, J-M。Pérotin, G. Deslée, G. Delepine, V. Dormoy和C. Coraux;分析和数据解读:E. Luczka-Majérus, V. Dormoy和C. Coraux;手稿修订:M. Polette, V. Dormoy, E. Luczka-Majérus和C. Coraux;稿件撰写:E. Luczka-Majérus和C. Coraux。
利益冲突:所有作者都报告了来自法国国家健康和医学研究所,兰斯香槟-阿登大学对本手稿的资助。G. Deslée报道基耶西和阿斯利康的荣誉讲座;在法国呼吸疾病学会COPD小组担任领导职务;在提交的作品之外。V. Dormoy报告基耶西和阿斯利康的荣誉讲座;在提交的作品之外。没有其他利益冲突需要披露。
支持声明:这项工作得到了兰斯香槟-阿登大学(URCA)、Région香槟-阿登大学和法国国家健康与医学研究所(Inserm)的支持。
- 收到了2022年4月14日。
- 接受2022年11月7日。
- 版权所有©作者2022。
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