文摘
背景特发性肺纤维化(IPF)是一种致命的肺部疾病没有治疗方案。穷人的成功发展anti-IPF策略促使研究人员重新考虑的重要性动物模型和评估方法的选择。目前,它仍然没有解决是否bleomycin-induced肺纤维化小鼠模型最后回到决议。
方法本研究旨在遵循动态bleomycin-treated小鼠肺纤维化的特性在较长时间通过结合最新的技术(微型电脑断层扫描成像和组织学检测降解胶原蛋白)和传统的方法。此外,我们还应用免疫组织化学探索所有hydroxyproline-containing分子的分布。
结果由古典生化方法,肺总羟脯氨酸含量达到了顶峰,博来霉素受伤后4周和维护一个稳定的高水平之后,直到实验结束(16周)。这个结果似乎部分矛盾与其他纤维化评估参数的变化,这表明逐步降解胶原蛋白和复苏后的肺通气纤维化高峰。这种不一致很好协调我们的数据从疣状对羟脯氨酸和荧光染色对降解胶原蛋白肽,一起展示大量hydroxyproline-rich降解胶原蛋白片段拘留和丰富的胞内区域10或16周内而不是在博来霉素治疗后4周。
结论我们目前的数据不仅呼吸研究人员提供一个新的视角对小鼠肺纤维化的解析性质,但也提醒他们一定要谨慎使用羟脯氨酸含量测定时对纤维化的严重程度进行评估。
文摘
的self-resolving性质采取的方式却与普遍接受的肺纤维化模型是反映在几种改进方法但未能被古典羟脯氨酸测定监控,强调需要使用评估方法适合疾病窗口https://bit.ly/3AsJzSL
介绍
特发性肺纤维化(IPF)的特点是扭曲的肺结构和细胞外基质(ECM)的沉积,是一种慢性,渐进且通常致命的肺病的原因不明,5年生存的∼20%1]。IPF影响全世界∼500万人,其发病率随年龄的增长有显著的增加(2]。根据最近的一项评估的数据Kolbet al。(3),总共有145 IPF发表的临床试验在2008年和2019年,调查了93种化合物/组合。令人失望的是,这些巨大的投资只有两种药物的批准(pirfenidone和nintedanib)。虽然有一些好处在放缓的步伐肺功能下降,这两个anti-fibrotic药物未能提高IPF患者总生存期(4]。
实验模型是不可或缺的重要工具,了解肺部疾病的发病机制以及评估药物疗效进行临床试验前。穷人的成功发展anti-IPF策略推动许多研究人员和专家来加强和强调的重要性,选择适当的动物模型和可靠的评估方法近年来(3,5- - - - - -9]。气管内的滴注法博来霉素的老鼠,虽然有局限性,仍然是最常用的采取和方式却与普遍接受的肺纤维化模型由于其相似之处总值IPF患者,低成本,相对轻松地感应和高重现性的6,9]。至少有一个共识关于这个模型:炎性浸润通常发生在7天,紧随其后的是一个渐进积累之后ECM蛋白质和纤维化反应峰值∼3 - 4周后(3]。然而,还剩下一点不安是否bleomycin-induced纤维化肺损伤终于恢复正常或部分分辨率(9]。早期研究声称观察自限性纤维化小鼠的反应(10- - - - - -13),这与人类IPF的进步和不可逆转的性质。相反,还有其他报告显示bleomycin-induced纤维化在C57BL / 6 j小鼠可以持续3 - 6个月的伤肺不解决(14,15]。造成这种差距的原因仍未得到解决,被推测与剂量相关博来霉素和/或不同的研究人员所使用的小鼠品系(9]。
考虑到读数为纤维化强度和分布采用以前的研究大多是通过牺牲动物在不同跨度为,有必要非侵入性方法与经典优化方法相结合,以调和辩论。传统方法用于肺纤维化评估包括胶原蛋白的生化量化(羟脯氨酸含量作为代理或天狼星红染色),组织学评估纤维分布(马森的三色的染色)和基因表达分析的纤维化的标记。由于片状分布bleomycin-induced纤维化病变以及固有的偏见与形态学评分系统,2017年美国胸科学会指南强烈推荐的羟脯氨酸测定全部肺匀浆作为最优的主要终点为临床前评估的潜在治疗对肺纤维化(6),而基因表达研究建议使用伴随着生化参数。减少observer-dependent可变性的形态学检查和评分系统,先进的计算机最近被开发和利用机器学习工具来定量分析肺组织的纤维化领域在整场幻灯片图像从动物模型或人类患者16,17]。
计算机断层扫描(CT),提供准确的纵向信息的非侵入性成像技术,现在在IPF的诊断中起着重要的作用通过识别常用的间质性肺炎的模式特点是网状和蜂窝胸膜下囊肿和bibasilar分布(18]。因为这个临床相关方法符合“3 r原则”(精致、替代、减少)在动物实验中,ct机通常被应用于小型啮齿动物肺纤维化模型(15,19- - - - - -21]。代表二维ct机的图像肺最初用来描述动物的肺损伤的严重程度。由于片状和异构bleomycin-induced模型的本质,它后来倾向于执行肺部CT图像的三维重建,以测量残余肺容积根据Hounsfield单位的相应范围值,定量radiodensity规模(22- - - - - -24]。值得注意的是,通过选择像素Hounsfield单位范围从121−121,博来霉素小鼠模型的肺CT图像被巧妙地划分为四个区域不同曝气状态,包括正常通风,通风差,恶性通货膨胀以及nonaeration [23]。
在这里,我们旨在动态跟随bleomycin-treated小鼠肺纤维化的特性在较长时间(16周)通过上述最新技术和传统的结合方法。
方法
的详细方法,包括动物实验程序,协议和看到的补充材料。
道德声明
所有动物实验动物保健和使用委员会批准广州医科大学(广州),并进行严格按照批准的指导方针。
统计数据
数据处理与棱镜version 6.0(美国GraphPad,圣地亚哥,CA)和表达意味着±扫描电镜。与Bonferroni单向方差分析事后测试是用来比较不同群体之间的区别。p < 0.05被认为是具有统计学意义。
结果
生化测定胶原蛋白含量
为了动态地描述bleomycin-treated肺纤维化模式,老鼠接受一个气管内的滴注法博来霉素的牺牲以不同的时间间隔长达16周后损伤(图1一个)。全部肺组织匀浆首次受到colorimetric-based羟脯氨酸测定,胶原蛋白含量测定(强烈推荐方法6,25,26]。结果表明,肺总羟脯氨酸水平倾向于逐渐增加从星期1到星期4和之后保持不变(图1 b)。因为上述的一些观测现象与数据显然是矛盾的报道显示,其他地方bleomycin-induced肺通常羟脯氨酸含量降至8周开始的基础水平(12,27,28),另一批老鼠是利用重复这项研究。这是表明在4到16周,鼠标羟脯氨酸水平仍稳步高(补充图从我们的模型),这意味着数据系统高度可重复和确认。
进一步测试肺羟脯氨酸含量是否bleomycin-induced小鼠模型在相应比例大量的原生胶原蛋白,小天狼星红染色,允许分析”新成立的“胶原纤维是然后上执行相同的动物。与羟脯氨酸的变化模式不同,胶原纤维明显显示4周大幅增加,但趋势向下在16周的随访(图1 c和d)。这些结果表明,小鼠的肺纤维化的微环境可能从胶原蛋白合成转向退化下周4。
量化程度的肺损伤,以及胶原蛋白在组织学结构图像
接下来,bleomycin-treated肺的结构变化被苏木精和伊红染色组织病理学检查。最小化observer-dependent偏见,彩色肺组织部分由商业整场幻灯片图像扫描仪进行扫描获取高分辨率数字图像的整个部分,然后进行定量计算的受损区域使用一种新颖的自动化工具叫做轨道图像分析(16]。与胶原蛋白的表达数据一致,受伤区域的比例表现出显著增加从星期1到星期4,然后似乎减少在10到16周(图3一和b)。
胶原蛋白的特征结构的三重螺旋三线性蛋白链组装成三聚物的形式。在支离破碎的蛋白酶如基质金属蛋白酶、胶原蛋白分子的变性三重螺旋展开[29日]。胶原蛋白杂交肽(CHP)是一种合成肽,能具体地绑定到退化、变性等胶原蛋白分子,而不是完整的胶原蛋白(29日]。使用荧光标记,CHP (Cy5-CHP),我们测试了肺组织中胶原蛋白的分子结构是否完整在第16周。有最小的荧光CHP信号在正常的肺间质区域,信号逐渐从星期1到星期4的纤维化(增加图4一的荧光强度和b)。在16周达到高峰,在水平明显高于4周。这些数据强烈支持胶原蛋白矩阵的概念经历了从4至16周趋向下降的过程。
在活的有机体内肺ct机的分析结构和曝气
为了进一步验证在体外组织数据以及减少动物传动物可变性,在活的有机体内肺结构或功能的变化是由微ct成像,动态监测提供纵向信息在同一个体动物(6]。代表肺ct机部分横博来霉素治疗后从星期1到星期16所示图5。这是证明肺等领域的整合达到最大水平在4周,然后逐渐减少,暗示经济复苏过程的后期纤维化。
更微妙的段出那些肺部区域曝气的部分或完全丧失,一个新颖的算法建立了最近的一项研究也引入到本研究,完成了歧视的充气不良与Hounsfield单位和无空气区域阈值从胡锦涛和−−434−121 120年至121年,分别为(23]。表示在图6,三种类型的区域与纤维化小鼠不同曝气条件匹配与横向CT部分可见的结构性变化,表明了该方法的可靠性。进一步的肺容量分析表明,充气不良和无空气区域的比例显著增加在星期4之前,然后显着地减少10周和16周之间,而那些通常充气区域表现出相反的趋势(图6 b)。这个结果可以通过统计测量另外验证相应的值的多个动物(图6 c)。集体,在活的有机体内数据暗示bleomycin-triggered肺纤维化是容易自发地解决。
免疫组织化学分析的hydroxyproline-containing分子
因为组织的生化测定羟脯氨酸进行完全水解产品,理论上该方法可以检测所有形式的hydroxyproline-containing物质在组织内。因此,我们推断,胶原降解的不变条件下羟脯氨酸的含量可能会导致不完整的切除组织的物质。证实这一假说,小鼠肺组织受到免疫组织化学染色与特定的抗体羟脯氨酸以观察其本地化。控制老鼠的肺间质近-对羟脯氨酸,而这些地区治疗组4周表现出广泛分布和适度增加羟脯氨酸的积累。与此形成鲜明对比的是,在10或16周,羟脯氨酸的积极方面,尽管显示范围更加紧凑,极大地提高了强度与周4 (图7)。值得注意的是,发生的细胞群有极强的细胞内免疫染色的羟脯氨酸在10和16周(图7箭头),而hydroxyproline-positive分子似乎主要位于细胞外区域4周。疣状的总强度信号对计算羟脯氨酸4周和16周之间无显著差异(图7 b),同意完全与生化方法的数据。第一hydroxyproline-specific应用免疫组织化学在肺纤维化评估清楚地表明hydroxyproline-rich胶原蛋白片段不能完全切除和纤维化catabolised即使长期演进(图8)。
讨论
我们所知,这是最彻底、深bleomycin-induced肺纤维化过程的描述。除了传统的方法,对纤维化评估的几个最新的改进技术也有意引进和利用,如人工智能分析张幻灯片的图像,CT-based肺通气的量化以及胶原蛋白的独特的triple-helical结构测定CHP染色。除了生化测定羟脯氨酸含量,大部分的数据从这个研究同意与流行的观念,小鼠肺纤维化可以自发地解决。这个奇怪的矛盾终于协调我们的应用程序的免疫组织化学检测hydroxyproline-containing分子纤维化肺组织内的分布。
在这里,三个不同的证据提出了解决平衡的转变从胶原蛋白合成实验的整个过程中降解纤维化。1)I型胶原蛋白的表达,在转录和翻译水平显著下降后瞬态在前4周上涨。2)天狼星红染色,被认为是特别适合的评价非常小的纤维化病变由于其灵敏度高(30.),进一步证实了后者新的胶原蛋白下降。3)CHP染色的胶原蛋白链直接验证胶原降解后纤维化高峰的出现。然而,我们的生化测定羟脯氨酸产生矛盾的数据,显示肺总羟脯氨酸的量达到了顶峰,博来霉素受伤后4周和维护一个稳定的高水平之后,直到实验结束(16周)。特殊的羟脯氨酸数据提示我们第一考虑的潜在影响的方法。羟脯氨酸可以量化的高效液相色谱法(HPLC),而最广泛使用的方法是基于氧化的反应比色测定羟脯氨酸p-dimethylaminobenzaldehyde [31日]。通过仔细搜索的发表文献的详细信息关于羟脯氨酸含量在小鼠肺纤维化模型中,我们发现两篇文章有相似的结果报告给我们的,有一个使用高效液相色谱法(15),另一个利用比色测定(14]。因为以前这两个独立的研究没有调查原生胶原蛋白的确切状态,尚不清楚的是,非等价的羟脯氨酸含量与原生胶原蛋白数量在目前研究中同样可以观察到。任何结论,至少这一现象bleomycin-induced增强小鼠的肺羟脯氨酸可以维持很长一段时间已经证明在其他地方(14,15]。
胶原蛋白降解发生通过细胞外和细胞内途径。细胞外途径涉及到乳沟的胶原原纤维蛋白水解酶,在细胞内途径包含绑定和胶原蛋白片段的成纤维细胞或巨噬细胞溶酶体降解[32]。理论上,生化测定羟脯氨酸应该检测所有形式的hydroxyproline-containing物质,包括原生胶原蛋白,胶原蛋白片段和免费的羟脯氨酸。因此,肺损伤后羟脯氨酸含量升高,除了代表胶原蛋白生产的增加,也意味着一个缺陷在整个营业额的胶原蛋白(33]。几个途径已确定内部胶原蛋白片段,因此允许细胞清除和回收矩阵组件(33- - - - - -35]。有趣的是,与控制相比,小鼠缺乏这些受体负责胶原掩饰展览增加肺总博来霉素受伤后4周羟脯氨酸含量没有改变炎症或胶原蛋白合成率(33,35]。然而,我们没有发现任何重大改变这些基因的表达水平在两组之间在周4和16(数据未显示),这意味着胶原内在化的过程可能在此期间正常运行。这种猜测可以加强这一事实hydroxyproline-rich分子大多是驻留在胞内细胞的隔间在10或16周,4周的现象完全缺席。根据证据,很有可能,维护一个非常高水平的羟脯氨酸在肺纤维化的决议阶段可能不完整造成的间隙胶原蛋白降解产物的细胞内空间(图8)。未来的研究需要关注澄清胶原蛋白的详细机制营业额在肺纤维化的时间窗口决议。
在哺乳动物细胞中,有多种类型的蛋白质翻译后的修改级别,如磷酸化、泛素化以及羟基化。这些修改后的氨基酸组可以与相应的抗体结合免疫印迹免疫沉淀反应操作。至于anti-hydroxyproline抗体,这些大多是利用检测到的事件脯氨酸羟基化的胞内信号传感器(36,37]。领域的器官纤维化的生化测定羟脯氨酸一直作为胶原蛋白含量评价的“黄金标准”。因此,当前的研究是第一次介绍免疫测定羟脯氨酸的纤维化的研究。
虽然我们的数据和解释似乎合理,一点不能忽视的是,这些研究中羟脯氨酸含量声称解决博来霉素模型的自然趋势向下后纤维化(峰值28,38,39),这是我们当前的数据完全相反。尽管还不清楚这种差异与博来霉素或动物的来源,我们至少提供了一种可能性,沉积胶原蛋白在小鼠肺纤维化模型可能有机会在某些情况下不完全清除。此外,我们还提供了一个强大且易用的技术探索目的地纤维化肺组织的胶原蛋白降解产物。这是有利于调和的辩论关于纤维化恢复问题,目前高度依赖的生化测定羟脯氨酸。
虽然CT扫描可以报告动态结构变化引起的纤维化病变,从而提供纵向和本地化信息、肺CT成像的小动物仍然是一个挑战由于其相对较低的分辨率。CT可以使用参考校准值的空气(1000−胡),纯净水胡(0)和致密骨胡(+ 1000)。最近的两项研究试图使用Hounsfield单位价值细分纤维化病变小鼠的通风区域。尽管Ruscitti等。(40)定义不充气地区500−−100年胡锦涛的范围,他们没有区分无空气区域通常有一个值高于100−胡。的基础上分析大量的肺纤维化小鼠的肺部CT图像,另一项研究中提出了一种新的分层标准肺通气,分类不充气和无空气区域为胡锦涛和−−−434 121 120年至121年,分别为(23]。我们这部小说算法应用于当前的研究和发现,肺通气功能往往自发地从博来霉素4周后,恢复支持该小鼠模型的自限性性质报道由其他人(12,28,41]。我们所知,我们的研究首次计算肺部病变的三维体积不同曝气条件下在实验性肺纤维化持续进展,这肯定会成为一个更可靠的功能为未来的药物疗效评价读出。
关于纤维化定量的多个方法,我们仍然相信,羟脯氨酸含量的生化试验是最客观、精确的方法如果胶原蛋白矩阵合成在毁灭主宰。然而,在某些情况下,例如当研究纤维化或长时间的治疗药物的疗效评价中可能涉及胶原蛋白降解,羟脯氨酸以及CHP的免疫组织化学染色的变性胶原建议首先确认是否强化胶原蛋白发生退化。
总之,我们的结果表明,在后期纤维化改变羟脯氨酸含量,长期以来被认为是作为肺纤维化的“黄金标准”评估不配合其他评价参数的变化,包括组织学染色、基因表达以及肺通气。这明显例外结果被证实与降解胶原蛋白片段的完整切除,羟脯氨酸组织化学染色做了演示。因此,当前的研究的数据不仅呼吸研究人员提供一个新的视角对该决议的性质小鼠肺纤维化的过程,但也提醒他们一定要谨慎使用传统的羟脯氨酸测定时反映出的胶原蛋白。
补充材料
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脚注
作者的贡献:金苏和南山中构思项目和设计实验。金苏和Ruijuan关写的手稿。李Penghui杨,杨Yunxin赖和Jiangtian于编辑的手稿。Shengren歌,Zhenli富杰赵,挂阴和Gencheng龚进行实验。Shengren歌,Zhenli傅、杰赵应他,思敏赵,小民彭和Yumei罗进行了数据分析。阅读和批准所有的作者都最后的手稿。
利益冲突:美国歌曲没有披露。
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- 收到了2021年3月23日。
- 接受2021年9月14日。
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