文摘
慢性阻塞性肺疾病(COPD)的特点是一个逐步丧失的肺部组织。诱导修复过程的成人病肺内主要兴趣和Wnt /β-catenin信号代表一个有前途的肺修复的目标。然而,新型治疗靶点的翻译模型系统为临床应用仍是一个重大的挑战。
我们生成的小鼠和patient-derived三维(3 d)体外肺组织文化(ltc)紧密模拟3 d肺微环境体内。使用两个著名的糖原合酶kinase-3β抑制剂,氯化锂(氯化锂)和CHIR 99021 (CT),我们决定Wnt /β-catenin-driven肺修复过程在高时空分辨率使用定量PCR,免疫印迹,ELISA、免疫组织学评估,和四维共焦活组织成像。
可行的3 d-ltcs展出保留肺结构和功能长达5天。我们将演示成功的Wnt /β-catenin信号激活小鼠和patient-derived 3 d-ltcs从慢性阻塞性肺病患者。Wnt /β-catenin信号导致肺泡上皮细胞标记表达增加,减少矩阵metalloproteinase-12表达式,以及改变巨噬细胞活性和弹性蛋白改造。重要的是,感应表面活性剂蛋白质C与疾病阶段显著相关(百分之预测用力呼气量在1 s)在patient-derived 3 d-ltcs。
Patient-derived 3 d-ltcs代表一个有价值的工具来分析潜在目标和药物对肺修复。增强Wnt /β-catenin信号衰减3 d-ltcs patient-derived慢性阻塞性肺病的病理特征。
文摘
Patient-derived 3 d-ltcs的临床前药物验证和成像的有力工具Wnt-induced肺修复http://ow.ly/L7BCe
介绍
慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一个全球性的健康问题,并将在2020年死亡的第三大原因。除了与终末期疾病发病率高,慢性阻塞性肺病严重限制了影响患者的生活质量。最重要的是,目前还没有治疗,企稳甚至逆转疾病进展(1- - - - - -3]。慢性阻塞性肺病导致进步的扭曲正常的肺结构和肺功能的损害。它是一个复杂的异构疾病表型。慢性阻塞性肺病的一个主要特点是肺气肿,定义为破坏肺泡表面积的气体交换,由于远端领空扩大(4- - - - - -6]。慢性炎症和正在进行的细胞外基质的蛋白水解作用,以及结构的细胞死亡,已被证明有助于疾病的起始和进展6,7]。此外,在COPD肺无法激活自我修复机制被认为是进步的一个重要原因破坏肺气肿的功能性组织。恢复功能肺组织在人类是一个巨大的进步,尤其是在光的事实新创成人肺再生尚未证明(8,9]。
肺上皮细胞对正常肺功能至关重要。除了免疫监测和粒子去除,气体交换的上皮细胞是最重要的。在肺泡上皮主要由肺泡上皮(AT) I和II型细胞。ATII细胞肺增长至关重要,作为祖细胞,启动肺泡上皮修复,给新ATII细胞或分化成ATI细胞(8,10- - - - - -12]。Wnt /β-catenin信号在肺上皮发展有至关重要的作用,进一步肺修复(代表一个有前途的因素9,11]。胚胎缺乏Wnt2/2b展示完整的肺发育不全和条件失活β-catenin结果没有肺芽(13]。此外,我们和其他人已经演示了一个关键角色的Wnt /β-catenin信号在慢性肺病的肺泡上皮细胞的功能。在慢性阻塞性肺病,Wnt /β-catenin信号是沉默14,15]。值得注意的是,Wnt /β-catenin激活糖原合酶激酶(GSK) 3β抑制预防,以及逆转,实验性肺气肿在活的有机体内动物模型(14]。重要的是,是否Wnt /β-catenin信号激活代表一个有效的目标发起人类COPD肺组织修复仍然未知。
新药从模型系统转化为临床应用仍是一个重大挑战16,17]。而肺疾病的动物模型代表优秀的和重要的工具来分析和验证新型疾病机制和整个生物体的潜在治疗靶点在活的有机体内,验证主要人体组织是主要局限于单一细胞类型的分析二维文化。我们生成和应用可行的和功能的三维(3 d)体外肺组织文化(ltc)小鼠和人肺组织调查和想象慢性阻塞性肺病的病理和治疗措施/肺气肿在时空分辨率的3 d肺微环境。这种技术可以让组织层面的分析对药理扰动在人类组织的反应。此外,小鼠3 d-ltcs可以延长机械的应用研究,同时降低整体动物实验。第一次,我们调查的适用性Wnt /β-catenin激活启动修复patient-derived COPD肺组织和进一步的机制和细胞变化引起的Wnt /β-catenin-driven肺修复在慢性阻塞性肺病。
材料和方法
人体组织
实验和人体组织的伦理委员会批准Ludwig-Maximillian大学(德国慕尼黑(项目编号455 - 12))。Asklepios生物库提供的所有样品都是肺部疾病(Gauting、德国(项目编号333 - 10))。书面知情同意了所有科目。发表组织从病人肺部肿瘤切除术是在这些研究中使用。慢性阻塞性肺病状态根据全球倡议被诊断为慢性阻塞性肺疾病定义(3]。肺功能测量是由确定在1 s (FEV用力呼气量1使用肺量测定法)、用力肺活量。所有患者的临床特点在这些研究中都包含在网上补充表S1。请注意,不是所有的病人可以被包括在所有实验进行这项研究。主题突出显示的数量相应的实验。
动物
无菌女性C57Bl / 6 n小鼠(C57Bl / 6 ncrl;岁的查尔斯河,Sulzfeld,德国),8 - 12周,被用于所有的研究。Wnt记者动物,BAT-GAL (B6.Cg-Tg (BAT-lacZ) 3 picc / J), TCF / LEF-green荧光蛋白(GFP)(股票Tg (TCF / Lef1-HIST1H2BB / EGFP) 61年赴麦加朝圣/ J),和MacGreen (B6N.Cg-Tg (Csf1r-EGFP) 1休谟/ J)都从杰克逊实验室(美国我酒吧港口)18,19]。老鼠被安置与水和食物随意。所有实验进行按照亥姆霍兹慕尼黑中心的指导方针的伦理委员会批准的(德国)和地区委员会上巴伐利亚(德国)55.2(项目编号1-54-2532-168-09)。
实验肺气肿动物模型
肺气肿是诱导如前所述14]。简而言之,猪胰弹性蛋白酶(σ,Taufkirchen,德国)溶解在无菌PBS(美国Gibco,卡尔斯巴德,CA)和应用orotracheally (100 U·公斤−1体重在80年µL PBS)。控制老鼠收到80µL无菌PBS。3 d-ltcs 7天滴剂后,生成如下所述。
人类和小鼠3 d-ltcs的一代
过程的概述图在网上补充图S1。在无菌条件下接受了手术治疗。小鼠3 d-ltcs,健康和气性老鼠犀牛的克他命(Bela-Pharm、Vechta、德国)和甲苯噻嗪盐酸盐(CP-Pharma, b .,德国)。插管和隔膜的解剖后,肺被刷新通过心脏与无菌氯化钠溶液和样品的支气管肺泡灌洗液(BALF)被(2×500µL无菌PBS)所有的动物都被灌输与PBS或弹性蛋白酶。在参与实验动物,没有BALF。使用注射泵、肺与温暖,渗透到琼脂糖胶凝温度低(2%重量,A9414;σ;保持在40°C)无菌栽培介质(DMEM /火腿的F12;Gibco,补充100 U·毫升−1青霉素、µg·100毫升−1链霉素和2.5µg·毫升−1两性霉素B;σ)。气管是结扎与线程保留肺内的琼脂糖。肺切除,转移到一个管培养中、在冰上冷却10分钟允许琼脂糖凝胶。叶分离和切割vibratome(岩狸V55;蔡司,德国Jena)的厚度300µm使用的速度10 - 12µm·s−180赫兹的频率、振幅为1毫米。琼脂糖主要是洗后切片。3 d-ltcs培养在培养基补充0.1%胎牛血清(FCS)(美国CT PAA,费尔菲尔德)。片漂浮在媒体文化时期。个人3 d-ltcs种植在37°C在湿润条件下含5%(体积/体积)有限公司2在淹没条件下24-well板块的变化中每隔一天。
patient-derived 3 d-ltcs,肺段non-COPD和慢性阻塞性肺病患者无肿瘤浸润的插管通过充满温暖的可见支气管和琼脂糖(3 wt %)后立即切除。肺段是在冰上冷却30分钟允许琼脂糖凝胶,减少的厚度500µm使用6 - 10的速度µm·s−1100赫兹的频率、振幅为1.2毫米。生物排除标准包括叶与已知的癌症;在逻辑上,我们不接受任何没有完整的细支气管的叶,当我们无法弥补这些叶与琼脂糖后续切割。
生活/死染色,WST-1试验和ELISA,一拳一脚3 d-ltcs生成的标准化和量化评估。3 d-ltcs穿孔直径4毫米使用活组织检查,确保排除主要的航空公司。拳来自类似肺的周边区域最小化样本变异和标准化组织体积的进一步定量分析。
细胞培养
MH-S小鼠肺泡巨噬细胞(写明ATCC crl - 2019)和MLE12小鼠肺上皮细胞(写明ATCC crl - 2110)保持在RPMI 1640(美国生活技术,卡尔斯巴德,CA)补充10% FCS, 100 U·毫升−1青霉素和100µg·毫升−1链霉素。细胞被播种在80%∼confluency(300 000个细胞/)24-well板和允许坚持24 h。细胞被血清饥饿(0.1% FCS)前24小时,允许细胞同步治疗。细胞治疗24小时为0,2、10或20毫米氯化锂(氯化锂)在0.1% FCS-supplemented RPMI媒介。
99021年氯化锂和CHIR Wnt /β-catenin激活
Wnt /β-catenin激活诱导小鼠和人3 d-ltc使用的两个著名GSK-3β抑制剂,能激活Wnt /β-catenin:氯化锂(10毫米;σ)和CHIR 99021 (CT)(2µM;Tocris /研发,明尼阿波利斯,美国)。抑制GSK-3β活动引起胞内积累β-catenin,功能与规范化Wnt信号通路/β-catenin [20.,21]。连续切片/拳从小鼠和人类3 d-ltcs被用于治疗和控制。
生活/死染色
穿孔3 d-ltc(超过两拳/动物/病人和治疗)与栽培介质孵化补充2µM calcein-AM和4µM ethidium homodimer-1(技术)。40分钟后,样本水洗,4%多聚甲醛固定,用共焦显微镜成像(LSM 710;蔡司)。
WST-1化验
每个3 d-ltc打孔孵化200µL栽培介质补充WST-1µL·15毫升−1(罗氏,曼海姆,德国)鼠标3 d-ltcs或30µL·毫升−1patient-derived 3 d-ltcs。2 h后,150年µL上层清液被读者和测量板在450海里。参考测量在690 nm减去为非特异性吸收正确。对于每个时间点和治疗,穿孔3 d-ltcs从至少三个不同的老鼠,或不同组织区域的个体patient-derived 3 d-ltcs /病人,进行分析。所有样本的平均值正常化第0天治疗(100%)。
治疗后0、2、10或20毫米氯化锂,肉类和MLE12细胞孵化1 hµL·WST-1 100毫升−1培养媒体。100年µL浮在表面的转移和吸光度测量详细。
RNA隔离
与PBS 3 d-ltcs洗两次,快速冻结在液氮和摧毁使用microdismembrator年代(热费希尔科学,达姆施塔特,德国)。后来,完美的纯RNA纤维组织包(5 ',希尔登,德国)是用于修改的协议由制造商提供。3 - 5片/肺样本来自不同地区或叶被用来增加的代表性组织。每个RNA隔离片从一个包含两个动物和实验使用至少两个独立样本执行弹性蛋白酶灌注物。RNA浓度确定使用Nano-Drop分光光度计(热费希尔科学)。对人类样本,RNA质量评估使用生物分析仪2100毛细管电泳(安捷伦科技,Oberhaching,德国)。
相对定量聚合酶链反应
相对定量(q) PCR进行使用SYBR绿色(罗氏)和LC480光周期计(罗氏),如前所述[14]。产生HPRT被用来作为参考基因。使用引物PCR进行列在网上补充表S2和S3的最终浓度500海里,与退火温度56 - 60°C。ΔCp被定义为一个基因的相对转录丰度(ΔCp = Cp产生HPRT - Cp目标基因)。
西方墨点法
样本处理和单一化RNA隔离部分中描述。蛋白质提取使用组织蛋白质提取试剂缓冲区(热费希尔科学)补充蛋白酶和磷酸酶抑制剂(罗氏)。蛋白质含量3 d-ltcs测量使用皮尔斯BCA蛋白质化验设备(热费希尔科学)。印迹,硝化纤维膜。阻塞后5 wt - %脱脂奶粉(AppliChem) 1 h,墨迹都孵化主要抗体在4°C一夜之间或在室温下1.5 h。二次抗体是孵化为1.5 h。增强化学发光检测的底物(热费希尔科学)是使用和墨迹成像使用一种ChemiDoc XRS + (BioRad、大力神、钙、美国)。列出使用的抗体在网上补充表S4。
表面活性剂蛋白质C ELISA
量化分泌表面活性剂蛋白C (SFTPC)内容,ELISA系统(Cusabio,武汉,中国)是根据制造商提供的协议使用。SFTPC内容显示为比例占总蛋白质决定使用皮尔斯BCA化验设备。
免疫荧光
3 d-ltcs固定丙酮/甲醇(AppliChem,达姆施塔特,德国)50:50卷20分钟,穿孔直径4毫米,使用相同的标准中所描述的部分生活/死染色,阻止体重1 h和5%的牛血清白蛋白在PBS(σ),和孵化主要抗体在一夜之间在4°C。与二次孵化后抗体1 - 2 h,染色是评估通过共焦显微镜。三维重建进行了使用伊万里瓷器×64软件(版本7.6.4;瑞士苏黎世,Bitplane)。抗体表S5在网上补充列出使用。
半定量分析细胞凋亡的3 d-ltcs在不同时间点,4毫米拳为每个时间点(n = 3)准备和沾裂解半胱天冬酶3抗体和4′6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)。共焦z-stack图像拍摄100×放大使用瓷砖扫描(2×2)获得的最大区域每个穿孔。最大强度图像生成与禅宗软件和裂解半胱天冬酶3阳性染色细胞相对于细胞的总量确定量化通过DAPI使用伊万里瓷器×64软件。
组织学和免疫组织化学
免疫组织化学染色进行如前所述[14]。简而言之,3 d-ltcs固定为4%(重量/体积)多聚甲醛一夜之间,石蜡包埋。3-µm部分被使用切片机(蔡司),安装在玻璃幻灯片和受到抗原检索。deparaffinisation和补液后,染色根据标准协议进行苏木精和伊红()),马森的三色的和哈特的污点(弹性)。最后,样本安装使用HI-MO安装介质(Bio-Optica、米兰、意大利)和盖玻片覆盖。米拉克斯集团的幻灯片进行微观扫描扫描仪(蔡司)和代表图像显示在所有数据。
LacZ染色
如前所述(执行LacZ染色22]。简而言之,3 d-ltcs源自BAT-GAL老鼠洗两次与PBS和前缀10分钟在4%多聚甲醛。洗后,3 d-ltcs孵化染色溶液(5毫米铁氰化钾,5毫米亚铁氰化钾,2毫米六水合氯化镁,65毫米磷酸氢二钠和磷酸氢钠15毫米(σ)和1毫克·毫升−15-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-d-galactopyranoside(半乳糖苷;研究产品国际,在黑暗中,美国)在一夜之间37°C。半乳糖苷在绿松石染色细胞染色结果规范化Wnt信号被激活。第二天,3 d-ltcs清洗和安装所述免疫组织化学染色。
共焦活细胞成像
延时共聚焦显微镜对LSM710系统包含一个倒AxioObserver(蔡司)。Z1站。3 d-ltcs维护被淹没在DMEM /火腿的F12培养基,含有0.1% FCS和15毫米玫瑰(Gibco),在此期间的观察。3 d-ltcs的成像是使用成像板执行(BD、海德堡、德国)点S1孵化室(蔡司)37°C。3 d-ltcs固定使用一个热压处理过的不锈钢戒指。显微镜是在中间的部分进行的。图像采集30分钟内开始转移3 d-ltcs成像的盘子。Z-stacksµm(50 - 100)的中间3 d-ltcs获得使用EC Plan-Neofluar DICII 20×/ 0.8 na物镜(蔡司)30分钟间隔24 h。自动延时显微镜是由ZEN2009软件(蔡司)。共焦四维数据集被导入到伊万里瓷器7.4.0软件(Bitplane)和加工采用体绘制算法。
成像的延时视频MacGreen动物进行使用35毫米CellView细胞培养菜(他一一BioOne, Frickenhausen,德国)。3 d-ltcs被组织培养空间固定插入(ThinCerts 8-µm孔隙大小;他一一Bio-One)和CellView细胞培养皿的盖子与封口膜紧密密封。3 d-ltcs然后成像有或没有10毫米氯化锂治疗。从中间一个z平面的每个组织切片选择明亮的野外采集的空间定位使用禅宗软件实验的持续时间。绿色通道的最大强度投影生成和亮视场覆盖单一z平面图像。细胞轨道长度和速度进行了分析使用跟踪点估计算法在伊万里瓷器现货-20µm检测直径5.5。
统计分析
所有数据都意味着±sd和计算使用GraphPad棱镜5(美国GraphPad软件,拉霍亚,CA)。比较两组,配对t检验,如果不适用一个未配对t检验与韦尔奇的调整使用。的计算意义的日志褶皱的变化,一个单样本t检验比较使用假设的值为0。比较两个以上的组使用方差分析和Bonferroni执行的事后测试。相关分析、非参数法(枪兵)假定由于使用非高斯分布和小样本大小的人类样本。p < 0.05被认为是具有统计学意义。
结果
生存能力和功能的小鼠3 d体外肺组织文化
3 d-ltcs生成正常和病变小鼠组织,以及patient-derived肺部组织。原理概述的过程是在网上补充图S1。从300年健康和肺气肿的动物(3 d-ltcsµm厚度,图1一个)仍然可行的5天的时间取决于生活/死染色(图1 b),表现出轻微的初始增加代谢活动由WST-1测量(在线补充图2一个)。重要的是,细胞功能也保持活细胞成像分析的支气管上皮细胞,显示纤毛持续跳动在第七天(在线补充视频S1)。我们特别感兴趣的肺泡上皮细胞功能,我们进一步确定SFTPC分泌来衡量ATII细胞功能,可比在5天,但表现出显著下降在文化(7天14图1 c)。为了评估是否肺泡上皮细胞的死亡负责这个SFTPC分泌下降,我们进行裂解半胱天冬酶染色的文化时间,发现一般增加凋亡细胞,特别是在每天7比5。然而,一些细胞数量受到影响(图1 d支气管内,箭头表示结构细胞(黄色)和肺泡(红色)区域,以及细胞凋亡非结构性,潜在的白细胞(白色),和在线补充图2 b)。这是进一步证实了越来越多的支离破碎的原子核在第七天,由圆)染色3 d-ltcs(在线补充图2 c)。在细胞生存能力和功能的同时,我们描述肺结构在文化时期使用组织学和组织三维共焦成像。重要的是,健康以及病理生理的肺部病变小鼠肺(桶状)的体系结构组织保存文化的时间,通过免疫荧光分析(胶原蛋白我CD45 pro-SFTPC,水通道蛋白5 podoplanin和钙粘蛋白)和组织学染色(圆),马森的三色的和哈特的染色;图2一个- - - - - -c和在线补充图3)。基于这些发现,我们进行进一步的实验最大培养一段5天。
小鼠三维(3 d)体外组织文化在文化时间(LTC)是可行的。)计划的不同地区3 d-ltcs称为最高,中部和底部的飞机。b)代表生活/死不同平面的共焦图像3 d-ltcs从健康和气性C57Bl / 6小鼠在指定的时间点。昊图公司的意见,中间和底部的飞机。健康细胞所示绿色细胞质(箭头)和死细胞由红核(箭头)。表面活性剂c)量化蛋白质c (SFTPC)的分泌3 d-ltcs从健康C57Bl / 6小鼠在不同时间点的培养。n = 8。*:p < 0.05相比之前的时间点;#:第一天相比,p < 0.05。d)裂解半胱天冬酶3染色3 d-ltcs从健康C57Bl / 6小鼠在种植。裂解半胱天冬酶3阳性细胞是由箭头表示。箭头表示结构细胞在支气管(黄色)和肺泡(红色)地区,以及凋亡细胞类型、潜在的白细胞(白色)。细胞核染色蓝色(4′6-diamidino-2-phenylindole (DAPI))。酒吧= 50µm规模。
改变肺结构和Wnt信号减少保存在肺气肿的三维(3 d)体外组织文化(ltc)。3)三维重建immunofluorescence-labelled d-ltcs从健康和气性C57Bl / 6动物。胶原蛋白染色;细胞核染色4′6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)。酒吧= 100µm规模。从健康和b)免疫荧光染色3 d-ltcs气性C57Bl / 6小鼠培养24 h,显示胶原蛋白I型、CD45、pro-surfactant蛋白C (SFTPC),水通道蛋白(AQP) 5、podoplanin (PDPN)和钙粘蛋白染色。核与DAPI染色蓝。酒吧= 50µm规模。c)苏木精和伊红()),马森的三色的和弹性蛋白染色3 d-ltcs从健康和肺气肿的C57Bl / 6小鼠切片后直接生成。酒吧= 100µm规模。 d) Gene expression analysis by quantitative PCR of Wnt target genes Axin2, Nkd1 and Fgfr2, Wnt ligand Wnt2, Wnt antagonists Dkk2 and Mmp12 and the extracellular matrix components Eln and Col1a1 in 3D-LTCs from control and emphysematous C57Bl/6 mice immediately after slicing. Hprt was used as the reference gene. n=7–10. Data are presented as mean±sd*:p < 0.05;* *:p < 0.01;* * *:p < 0.001。
Wnt /β-catenin信号被激活的氯化锂(氯化锂)和CHIR 99021 (CT)在三维(3 d)体外从气肿小鼠肺组织培养(ltc)。Wnt基因表达分析目标基因Axin2和Dkk2定量PCR,免疫印迹和代表微的活跃β-catenin (ABC)蛋白表达在3 d-ltcs气性C57Bl / 6小鼠在表示时间点治疗后)10毫米氯化锂或b) 2µM CT。二甲亚砜(2µm;σ,Taufkirchen,德国)用作CT控制治疗。n = 4到10。*:p < 0.05;* *:p < 0.01;* * *:p < 0.001。左c):代表LacZ染色3 d-ltcs气性BAT-GAL Wnt-reporter动物3 h(治疗后0.1%胎牛血清(FCS)控制介质(Ctrl)或10毫米氯化锂。激活细胞染色用蓝色(箭头);酒吧= 20µm规模。 Inset: activated cells in bronchial regions; scale bar=100 µm. Right: representative confocal images of 3D-LTCs from emphysematous TCF/green fluorescent protein (GFP) Wnt-reporter animals after 72 h of treatment with 0.1% FCS control medium or 10 mM LiCl. Activated cells are expressing GFP (arrows). Scale bar=50 µm. d) Four-dimensional confocal live cell imaging of 3D-LTCs from emphysematous TCF/GFP Wnt-reporter animals at start of imaging and after 24 h treatment with 10 mM LiCl. Wnt/β-catenin activated cells (expressing GFP) are shown within white circles. Scale bar=100 μm. See also online supplementary video S2.
在小鼠肺气肿的治疗激活Wnt /β-catenin信号3 d-ltcs
异常的Wnt /β-catenin信号曾被卷入的开发和进展慢性肺疾病(14,22- - - - - -24]。Wnt /β-catenin信号被发现在人类从慢性阻塞性肺病患者小气道细胞表达下调15),以及在肺气肿的小鼠模型14]。我们首先旨在调查这些疾病相关通路是否维护修改,可以修改体外条件。3 d-ltcs产生肺气肿的老鼠post-elastase 7天治疗,它的特点是减少炎症过程,建立了空域扩大(在线补充图S4) (14]。我们分析了几个Wnt目标基因的转录水平和Wnt通路组件和观察到的明显降低Wnt目标基因的表达Axin2和Nkd1,Wnt受体Fgfr2以及Wnt配体Wnt2抑制剂,Wnt信号Dkk2增加3 d-ltcs气性老鼠(图2 d)。此外,著名的人类肺气肿病理措施和小鼠肺气肿模型保存,包括upregulation基质金属蛋白酶12 (Mmp12)、弹性蛋白(民族解放军)和胶原蛋白I (Col1a13 d-ltcs气性老鼠()成绩单图2 d)[25,26]。
接下来,我们问及Wnt / 3 d-ltcsβ-catenin信号可以被重新激活。为此,我们应用小鼠3 d-ltcs调查的可行性两个不同化合物诱导Wnt /β-catenin信号激活,氯化锂(10毫米)和CT(2µM) (27]。重要的是,我们没有观察到毒性在10毫米氯化锂的应用或2µM CT 3 d-ltcs从健康和肺气肿的老鼠体外,与二维文化上皮细胞系,而肉类巨噬细胞细胞系表现出增加细胞毒性,报道之前(在线补充图5和[28])。氯化锂和CT治疗导致Wnt /β-catenin目标基因的表达增加,等Axin2或Dkk2量化,qPCR以及显著增加表达活跃β-catenin蛋白表达(图3a和b),作为活跃的替代标记规范Wnt信号。这些发现符合之前在活的有机体内研究小鼠实验性肺气肿模型(14),从而突显出3 d-ltcs作为一个合适的工具模型,进一步扩大对肺部疾病机制和功能在活的有机体内。
起始的肺泡上皮细胞修复和减少治疗Wnt emphysema-related机制/β-catenin激活小鼠3 d-ltcs
接下来,我们使用3 d-ltcs Wnt记者从两个不同的老鼠(BAT-GAL和TCF / LEF-GFP) (18,19)进一步阐明在Wnt /β-catenin激活细胞效应和机制。Wnt /β-catenin激活细胞主要是确定在支气管上皮细胞以及肺泡的实质,为分析LacZ染色(图3 c左)以及GFP表达(图3c)。值得注意的是,住3 d-ltc成像允许时空Wnt /β-catenin-activated肺细胞的识别对氯化锂治疗(图3 d和在线补充视频S2)。Wnt /β-catenin-activated肺实质细胞主要ATI细胞呈阳性标记podoplanin (PDPN: T1-α)和ATII细胞标记pro-SFTPC (图4),但是我们没有观察到大量的Wnt /β-catenin-activated间叶细胞或内皮细胞(数据未显示)。我们观察到显著增加表达式PDPN mRNA和蛋白表达在Wnt /β-catenin激活在小鼠3 d-ltcs(氯化锂图4 b和d)。此外,我们发现homeodomain-only减少蛋白质(HOP) X mRNA,最近描述了肺泡上皮细胞标记,这可能会抑制表面活性剂生产(图4 d)[29日,30.]。然而,我们没有观察到显著变化SFTPC mRNA和蛋白(图4摄氏度和d)。我们进一步阐明Wnt /β-catenin激活的影响通过氯化锂Mmp12和弹性蛋白在elastase-induced肺气肿的病理变化。重要的是,这两个Mmp12和民族解放军成绩单降低气肿3 d-ltcs氯化锂或CT治疗,分别为(图4 d和在线补充图S6)。我们的数据表明,上皮细胞是主要反应细胞Wnt /β-catenin激活(无花果3 d和4),这表明观察到的效果主要是上皮细胞衍生Mmp12与民族解放军的表情;然而,直接或间接影响其他细胞如巨噬细胞不能排除。这条直线上,而我们没有观察到任何巨噬细胞毒性和细胞凋亡在Wnt /β-catenin激活3 d-ltcs氯化锂(在线补充图S4),我们监测到活细胞成像使用MacGreen动物巨噬细胞运动。有趣的是,我们发现显著减少巨噬细胞运动(如分析轨道长度和速度)LiCl-treated 3 d-ltcs从健康和肺气肿的动物,而控制治疗(在线补充图S7和视频S3和S4)。
临床验证治疗Wnt在patient-derived 3 d-ltcs /β-catenin信号激活
基于这些发现,小鼠3 d-ltcs密切的反映方面在活的有机体内情况和代表一个强大的工具来进一步确定Wnt /β-catenin激活的机制在肺组织生活,我们旨在翻译结果patient-derived 3 d-ltcs,使用的主要目标为未来临床前药物验证和治疗反应的研究。类似于小鼠3 d-ltcs 3 d-ltcs COPD患者保持可行性分析的代谢评估(在线补充图S8a)和生活/死染色(在线补充图S8b),和保存正常或病理生理结构变化在文化组织评估三维共焦成像(图5和b和在线补充图S9)。我们分析了MMP12针对疾病的病理改变和发现MMP12基因表达显著增加3 d-ltc copd患者相比non-COPD患者(图5度)。
Wnt /β-catenin活化诱发肺上皮细胞标记在三维(3 d)体外组织文化(ltc)肺气肿的老鼠。图片3)代表d-ltcs气性TCF / LEF-EGFP Wnt-reporter动物治疗72 h后0.1%胎牛血清控制介质(Ctrl)或10毫米氯化锂(氯化锂)。箭头:激活细胞表达绿色荧光蛋白(GFP);箭头:未激活的podoplanin (PDPN,上层行)和pro-surfactant蛋白C (pro-SFTPC,低行)表达细胞;规模50µm酒吧。高倍pro-SFTPC或PDPN分别和GFP-expressing细胞(右)。蛋白表达的肺泡上皮细胞标记PDPN和SFTPC 3 d-ltcs气性C57Bl / 6小鼠在氯化锂治疗免疫印迹检测到b)和c) ELISA,分别。d)基因表达的3 d-ltcs气性C57Bl / 6动物在不同时间点的10毫米氯化锂治疗与控制:Pdpn,Sftpc,Hopx,Mmp12和民族解放军。n = 3 - 10。*:p < 0.05;* *:p < 0.01。
Patient-derived三维(3 d)体外组织文化和结构完整性(ltc)仍然是可行的。3)三维重建immunofluorescence-labelled d-ltcs从非慢性阻塞性肺疾病(COPD)和慢性阻塞性肺病患者。我和右左:胶原蛋白:钙粘蛋白染色;核沾染了4′6-diamidino-2-phenylindole (DAPI);酒吧= 100µm规模。b)免疫荧光染色3 d-ltcs non-COPD和慢性阻塞性肺病患者培养24小时。Pro-surfactant蛋白C (pro-SFTPC) podoplanin (PDPN)和钙粘蛋白染色;核是使用DAPI染色蓝;酒吧= 50µm规模。c)基因表达基质金属蛋白酶12 3 d-ltcs人力non-COPD和COPD患者肺片后直接生成。 n=5–6. *: p<0.05.
接下来,我们研究Wnt /β-catenin patient-derived 3 d-ltcs激活。Wnt /β-catenin受体激动剂氯化锂和CT导致强烈的Wnt /β-catenin目标基因的表达AXIN2和NKD1,以及显著增加活跃β-catenin蛋白表达(图6),进一步支撑patient-derived 3 d-ltcs反映相关肺部改变和Wnt /β-catenin信号激活代表一个功能目标的潜在临床应用。
Wnt /β-catenin信号诱导patient-derived三维(3 d)体外组织文化(ltc)。Wnt基因表达分析目标基因AXIN2和NKD1为定量PCR和代表西方墨点法和微的活跃β-catenin (ABC)蛋白表达在patient-derived 3 d-ltcs表示时间点治疗后)10毫米氯化锂(氯化锂)或b) 2µM CHIR 99021 (CT)。学报》第4 - 14 n =。数据意味着±sd。*:p < 0.05;* *:p < 0.01;* * *:p < 0.001。
肺泡上皮细胞修复的起始治疗Wnt /β-catenin激活patient-derived 3 d-ltcs导致肺泡上皮细胞的激活
能够成功地激活Wnt /β-catenin信号patient-derived 3 d-ltcs敦促我们去进一步探索Wnt /β-catenin激活的细胞效应在人类的肺部组织。Wnt /β-catenin激活氯化锂导致显著增加PDPN mRNA和蛋白表达,以qPCR分析(图7)、免疫印迹(图7 b)和免疫荧光染色法(图7 c)。值得注意的是,在小鼠3 d-ltcs相比,我们还发现SFTPC mRNA的增加(图7)和蛋白质(图7 b和c),这表明Wnt /β-catenin活化刺激人类3 d-ltcs ATII细胞功能。这些数据进一步证实了水平的下降HOPX信使rna在Wnt /β-catenin激活通过氯化锂(图7)。最近,减少HOPX表达式与ATII细胞成熟(29日,30.]。在一起,这些观察结果支持认为Wnt /β-catenin信号能够增加ATII和ATI细胞标记表达和功能在人类患病的肺。接下来,我们分析了个人组织应对Wnt /β-catenin诱导治疗3 d-ltcs (n = 13)。重要的是,我们发现ATII取决于细胞的激活SFTPC与慢性阻塞性肺病疾病显著相关阶段(由5预计在1 s (FEV用力呼气量1))(图7 d,SFTPCp = 0.0079)。同样,Wnt /β-catenin-dependentAXIN2表达与FEV1% pred;然而,在这种探险的队列(从来没有达到统计学意义图7 dAXIN2p = 0.1167)。这些数据表明,patient-derived 3 d-ltcs价值评估药物治疗反应个性化疾病阶段;然而,这需要进一步探索更大的患者群。
Wnt /β-catenin感应导致肺上皮细胞标记激活patient-derived三维(3 d)体外组织文化(ltc)。信使rna和蛋白质表达的肺泡上皮细胞标记podoplanin (PDPN) homeodomain-only蛋白质X (HOPX)和表面活性剂蛋白C (SFTPC) patient-derived 3 d-ltcs氯化锂治疗后使用)定量PCR分析,b)我)免疫印迹或ii) ELISA。n = 5 - 10;*:p < 0.05;* *:p < 0.01;* * *:p < 0.001。c)代表PDPN和pro-SFTPC免疫荧光染色patient-derived 3 d-ltcs 72 h后治疗0.1%胎牛血清控制介质(Ctrl)或10毫米氯化锂(氯化锂)。箭头显示阳性的细胞。酒吧= 50µm规模。d)的相关性AXIN2和SFTPC信使rna诱导的24小时氯化锂治疗与慢性阻塞性肺病patient-derived 3 d-ltcs疾病严重程度,由肺功能(在1 s (FEV用力呼气量1)%预测);n = 13。
最后,我们分析的结果Wnt /β-catenin激活MMP12和弹性蛋白。虽然我们没有看到一个重要的监管MMP12基因表达(图8),我们观察到显著减少弹性蛋白原蛋白表达在72 h对氯化锂治疗人类3 d-ltcs (图8 b),因此可能反映数量减少的弹性蛋白片段(31日]。这是进一步证实了弹性蛋白本地化使用哈特的染色显示一种改进的线性沉积在肺泡壁弹性蛋白在人类3 d-ltcs Wnt /β-catenin激活氯化锂。这些发现强调,Wnt /β-catenin激活也干扰共同病理过程中观察到肺气肿患者,和3 d-ltcs合适的工具来调查潜在的新的治疗方法的效果对慢性阻塞性肺病患者临床相关的措施。
Wnt /β-catenin激活改变弹性蛋白改造patient-derived三维(3 d)体外组织文化(ltc)。一)MMP12基因表达,3 d-ltcs非慢性阻塞性肺疾病(COPD)和慢性阻塞性肺病患者治疗后10毫米氯化锂在不同时间点;n = 8。b)弹性蛋白原蛋白表达在patient-derived 3 d-ltcs治疗后与10毫米氯化锂72 h;n = 7;*:p < 0.05。c)弹性蛋白染色的patient-derived 3 d-ltcs表示时间点后氯化锂治疗。箭头显示线性沉积在肺泡壁弹性蛋白,当箭头显示密度,不连续沉积;酒吧= 100µm规模。
讨论
慢性阻塞性肺病是一种破坏性疾病的渐进破坏功能肺组织,只有有限的症状治疗方法是可用的。肺移植是唯一的治疗COPD患者与一个已知的生存受益;然而,这是有限的主要是通过捐献器官的短缺。改善供体肺的适用性体外肺灌注和基因疗法是一个主要的研究领域。然而,新的治疗方法,目标肺内源性修复过程的迫切需要。
然而,可靠和健壮的工具,允许适当的验证和预测潜在的新的治疗方法仍然稀少。我们生成3 d-ltcs从人体病变组织,可以应用于想象改变复杂的3 d肺部病变的肺组织的体系结构与时空分辨率。我们提供病理评估概念,药物patient-derived 3 d-ltcs验证和机械的研究,我们认为将打开成功的翻译和精密医学临床的新途径。
虽然以前的报告使用展示肺片从啮齿动物模型和人类组织主要为短期毒理学和药理学分析(32- - - - - -36),我们报告的应用3 d-ltcs patient-derived肺部病变的肺组织研究和潜在的高时空分辨率肺修复。这是一个重大进步最后临床前药物和疗法的发展差距,因为它允许cell-matrix交互的评价以及人类肺组织细胞功能。3 d-ltcs有利,因为他们的多才多艺的人类患者应用材料。他们正是类似于矩阵和细胞成分的疾病研究,在这种情况下,慢性阻塞性肺病,但这可以翻译其他肺部疾病。我们最近演示了protease-controlled药物释放在人类3 d-ltcs从肺癌患者使用介孔二氧化硅纳米粒子37]。尽管是非常宝贵的对于测试药物在一个完整的生物系统,在活的有机体内分析在动物模型只能概括我们的最新对疾病的理解。因此,从动物研究发现可能不是完全像人类疾病潜在的条件,显示patient-derived组织学习的重要性。在这里,我们表明,主要病理变化是保存在3 d-ltcs当比较小鼠组织在活的有机体内和体外,进一步加强了人类3 d-ltcs的适用性体外。
我们应用3 d-ltcs首次展示Wnt /β-catenin信号激活的成功导致了两种不同的化合物诱导的小鼠和人类的肺修复过程3 d-ltcs。为此,我们分析了肺泡上皮细胞功能,曾被认为是影响Wnt /β-catenin激活,以及著名的病态的措施,比如MMP12高程和改变弹性蛋白营业额和沉积。3 d-ltcs Wnt信号减少,类似于慢性阻塞性肺病患者和所示在活的有机体内肺气肿动物模型(14,15]。特别是,Wnt /β-catenin激活导致微分ATI和ATII细胞标记物的表达。我们发现增加SFTPC转录和蛋白表达在Wnt /β-catenin patient-derived 3 d-ltcs激活,表明Wnt信号激活/β-catenin ATII细胞功能,甚至导致ATII细胞人口的增加。增加表达SFTPC中没有检测到3 d-ltcs肺气肿的老鼠,这可能是由于细胞的差异/蛋白质周转和动力学;然而,进一步强调了使用的相关性patient-derived组织评估和验证的有前途的新靶点和药物。
值得注意的是,增加在SFTPC Wnt /β-catenin激活伴随着损失HOPX表达式。它最近表明,HOPX ATI表达的细胞中失去ATII细胞成熟(29日]。HOPX表达减少,正如我们所观察到的Wnt /β-catenin信号激活,因此会表明增加成熟SFTPC生产ATII人类肺组织细胞在Wnt /β-catenin信号激活,而不是在ATI细胞减少。这个概念是由其他ATI的增加细胞标记在Wnt /β-catenin信号激活,如podoplanin。这些数据表明,Wnt /β-catenin激活将刺激,ATII和ATI细胞在人类患病的肺部组织。符合这一点,Treutlein和他的同事们最近的证据表明存在bipotent肺泡祖细胞在小鼠肺发展,导致ATI和ATII细胞和表达标记的血统29日]。可能这些bipotent肺泡祖细胞的数量变化小鼠和人类之间可能的原因之一的差异在SFTPC表达由于Wnt /β-catenin激活。同样地,我们发现co-expression ATII ATI细胞标记以及单一ATI细胞表达podoplanin Wnt /β-catenin激活。综上所述,这些数据从鼠标和人体组织支持的概念,ATI的细胞可能来源于不仅从ATII细胞,但也从其他——人类的肺组织,有待进一步明确,肺泡祖细胞(8,9,11,38]。为了证明这个明确,未来的研究需要进行fate-mapping和体外跟踪在转基因动物,然而,这些分析是有限的人类肺组织与当前技术。
我们发现MMP12在小鼠和人类emphysemateous调节3 d-ltc,按照先前的发现的增加MMP12在慢性阻塞性肺病患者26]。值得注意的是,我们观察到明显减少了Mmp12基因表达在3 d-ltc气性动物氯化锂治疗24小时后,它连同逆转民族解放军小鼠3 d-ltc转录水平。巨噬细胞的主要来源之一是Mmp12 [39]。我们进一步显示减少巨噬细胞跟踪速度和长度对氯化锂治疗气性3 d-ltc暗示Mmp12减少可能是由于选择性抑制巨噬细胞的活动。这个选择性细胞作用可能参与肺气肿的衰减氯化锂在活的有机体内报道了Kneidingeret al。(14),然而,其他的参与比Wnt通路/β-catenin不能排除在外。氯化锂是一个著名的活化剂Wnt /β-catenin信号,但也能影响其他除了Wnt信号通路/β-catenin [28]。在这里,我们证实Wnt /β-catenin激活和改变Mmp12和民族解放军表达式emphysemateous 3 d-ltc使用CT GSK-3β抑制剂,它被认为是一个更强有力的和特定的Wnt /β-catenin活化剂(21]。详细的信号机制以及其他细胞类型的潜在贡献,如中性粒细胞、b细胞,t细胞,内皮细胞,需要在将来的研究中检查。
在人类3 d-ltc,我们没有观察到显著的变化MMP12在patient-derived 3 d-ltc成绩单。这可能是由于有限数量的样本,我们可以分析在这个概念验证研究。然而,我们观察到降低弹性蛋白原表达式3 d-ltc溶解产物,这可能是指减少趋化活性和弹性蛋白片段氯化锂治疗后。成熟的各种弹性蛋白原弹性蛋白由单体不可逆交联通过lysyl氧化酶类。蛋白质水解弹性蛋白的丝氨酸蛋白酶,如中性粒细胞弹性蛋白酶或MMP12结果在多个弹性蛋白片段的大小和构成。之前的研究已经证实,MMP-12−/ -老鼠免受香烟的发展(CS)全身的肺气肿通过弹性蛋白片段生成的减少,因此,减少单核细胞趋化现象的活动相比,这些老鼠BALF控制(25]。最近的研究进一步强调了减少赖氨酰化氧表达式和fibulin-5活动导致受损弹性纤维组装和维修在慢性阻塞性肺病患者40,41]。在这种背景下,弹性蛋白原的减少可能减少misassembled弹性蛋白纤维(因此减少蛋白质过载)和单核细胞趋化活性的潜在来源。氯化锂治疗在慢性阻塞性肺病是积极干扰主要病理过程进一步支持人类3 d-ltc哈特的染色,这证明线性弹性蛋白沉积在肺泡的增加。
应该注意的是,为了充分确定肺修复的能力,甚至re-growth同样在人体组织,patient-derived 3 d-ltcs最有可能需要更长时间点和先进文化系统的分析可能会被考虑。我们的体外系统目前缺少几个有关在活的有机体内通过血管灌注等投入,一个气液界面的存在(即。再控制的气体水平)和机械拉伸。另一个潜在的差异在我们的系统在活的有机体内环境源于缺乏可再生能源供应的免疫细胞。虽然我们仍然观察免疫细胞在我们的系统中,我们还没有完全描述这些细胞的活动(如。两极分化)。此外,其他实验参数等的媒体组合和使用特定生长因子可能是研究特定的细胞或组织水平的关键反应。所有这些参数已被证明对细胞和组织水平产生深远的影响的行为,包括修复和再生42]。优化和进一步了解这些参数的作用很重要3 d-ltc的最大化使用。
小鼠3 d-ltc研究中,我们使用的特征明显模型elastase-induced肺气肿,展览空间扩大,已被证明展览减少Wnt /β-catenin信号在活的有机体内(14]。这个模型不能反映病理特征,包括慢性支气管炎,它存在于COPD患者(2]。这里,我们周边组织用于patient-derived 3 d-ltc和主要专注于肺泡上皮细胞的作用然而,据报道,肺泡上皮细胞损伤,内皮细胞损伤和凋亡可能发生在肺气肿6,7]。虽然我们没有观察到大量的Wnt /β-catenin激活内皮细胞在气肿3 d-ltc在当前的研究中,这将是未来重要的研究,以进一步探索Wnt /β-catenin信号对其他主要的作用机制导致肺泡组织破坏。
此外,研究小鼠3 d-ltc暴露于香烟烟雾或源自动物已经受到香烟在活的有机体内将有助于进一步确定和验证承诺目标,针对COPD的药物。3 d-ltc在这种背景下的一个优点是可以想象和跟踪细胞在自然环境4 d共焦活组织成像,我们在这项研究中应用于想象Wnt /β-catenin激活肺细胞随时间(视频2),以及跟踪巨噬细胞移动在Wnt /β-catenin激活(视频3和4)。此外,使用几个相邻切片具有类似肺细胞组成和架构是有利的,并允许更精确的评估治疗效果,因为片从相同的示例可以用于治疗和控制。因此,3 d-ltc进一步受益于分析各种可能性从少量的组织和读数,当使用动物模型,从而降低整体动物实验。
在目前的研究中,我们发现增加的显著相关性SFTPC基因表达后氯化锂治疗病人的疾病阶段,很大程度上取决于临床肺功能。Wnt /β-catenin信号激活分析增加了AXIN2表达与氯化锂治疗,遵循相同的趋势没有达到统计学意义(图7d)。值得注意的是,我们观察到强增加ATII细胞标记表达式更严重的慢性阻塞性肺病患者,表明这些病人不仅有肺上皮细胞修复能力,但可能会从中受益。因此,个性化医学3 d-ltc代表一个有价值的工具裁剪治疗病人的个人需求,从而促进药物测试之前进行临床研究。此外,一些化合物可以并行测试串行部分,这可能导致更健壮和可靠的结果。尽管这项研究旨在提供3 d-ltc的适用性的概念验证,患者样本的数量是有限的。未来的研究与更大的群组研究中特别是non-COPD以及慢性阻塞性肺病患者需要进一步分析疾病异质性和验证我们的发现的疾病特异性。
patient-derived 3的一个主要优点d-ltc在这项研究中,使用的分析是复杂的三维结构和内源性细胞功能和程控patient-derived组成的组织。其他应用程序的基本肺片技术包括decellularised切片的研究,可以用来研究种子细胞体内的行为,如细胞外基质的作用和细胞命运决定机械性能(43,44),作为一种工具学习和指导人类多能干细胞分化成肺上皮细胞(45]。同样,H呃et al。(46)建立了一个“lung-on-a-chip”micro-device模型alveolar-capillary接口。这种方法最近也用于创建一个系统来研究在活的有机体内例如肺泡microinjuries和伤口修复47]。这些模型,主要是基于细胞系的使用,可以,在某种程度上,已经成功申请了强劲的高通量药物发现。然而,进一步分析复杂的生理反应和药物效率patient-derived原生肺组织是必要的。这里,我们关注人类的肺的内源性修复能力,洞察细胞功能和其余肺的能力应对新治疗方案,如Wnt-β-catenin诱导肺修复。我们相信这是特定值的确定和预测新靶点的适用性和药物进入临床试验。
总之,这些发现强调,3 d-ltc不仅代表一个有价值的工具,用于临床前药物评价和治疗反应,但进一步适合调查重要疾病相关机制与时空分辨率3 d。因此,我们认为3 d-ltc作为一个重要的桥梁技术的模型药物鉴定、评估、治疗的预测和个性化的药物。
确认
我们感谢Konigshoff实验室的所有成员刺激讨论和批判阅读的手稿。我们尤其感谢Nadine亚当(综合肺病学中心、慕尼黑)以及安雅Stowasser (Asklepios诊所,Gauting),戴安娜斯坦哈特(Asklepios诊所,Gauting),玛丽亚马格达莱纳斯坦(综合肺病学中心、慕尼黑),玛丽亚纽尔(综合肺病学中心、慕尼黑),和安德里亚Naujok(综合肺病学中心、慕尼黑),优秀的技术援助。的小动物设施的所有成员学会感谢他们持续的支持和帮助。我们也感谢Tobias Stoeger(综合肺病学中心、慕尼黑)提供MacGreen动物。
脚注
可以从本文的补充材料www.qdcxjkg.com
支持声明:本研究支持的一个欧洲研究委员会开始向m . Konigshoff (erc - 2010 - 261302英镑)和初级研究小组计划(亥姆霍兹联合会,柏林,德国)。D.E.瓦格纳支持惠特克国际学者奖学金和亥姆霍兹慕尼黑博士后项目。为这篇文章一直存放在资助信息FundRef。
利益冲突:披露可以找到与本文的在线版本www.qdcxjkg.com
- 收到了2014年10月3日。
- 接受2015年3月22日。
- 版权©2015人队