文摘
肺泡巨噬细胞在慢性阻塞性肺疾病发挥重要的作用通过生产基质金属蛋白酶(MMPs)和组织蛋白酶及其抑制剂,组织金属蛋白酶抑制剂和半胱氨酸蛋白酶抑制物c,我们提出,这些分子的表达水平在基线和肺泡巨噬细胞刺激后会受到与慢性阻塞性肺疾病相关基因型和表型。
定量PCR和elisa /明胶zymography被用来调查信使rna和蛋白质的表达水平,分别。的表达与基因型的关系,肺功能和肺气肿进行分析。
结果表明,基底的表达水平MMP12信使rna的扩散能力呈负相关的肺一氧化碳/肺泡体积和用力呼气量在1 s /多个比较校正后用力肺活量。MMP12蛋白质的表达水平与脂多糖刺激也逆相关的扩散能力肺一氧化碳/肺泡体积和肺气肿的程度呈正相关。基础的表达MMP1信使rna与肺气肿的程度呈正相关。组织蛋白酶L蛋白质水平呈正相关,用力呼气量在1 s %预测。
我们认为增加MMP12和MMP1表达可能在肺气肿的发病机制中发挥作用。组织蛋白酶L和MMP9可能参与气流限制的发展。
文摘
MMP12表达可能在肺气肿的发病机制中发挥作用,气流限制http://ow.ly/pICmy
介绍
慢性阻塞性肺疾病(COPD)的特点是不完全可逆的气流限制,是一种慢性全世界发病率和死亡率的主要原因(1]。这种疾病的特点是肺内炎症过程,以应对有害粒子主要产自香烟,伴有肺体系结构的破坏和修复,导致组织改造。虽然主要引发慢性阻塞性肺病是香烟的发展,只有少数慢性重度吸烟者发展有症状的慢性阻塞性肺病(2]。慢性阻塞性肺病的集群家庭表明有一个遗传因素(3),可以解释为什么只有一个子集的烟民发展这种疾病。
蛋白酶:antiproteinase失衡被认为发挥核心作用在COPD的发病机制4]。内的重要来源蛋白酶和antiproteinases肺肺泡巨噬细胞,产生基质金属蛋白酶(MMPs)及其抑制剂、组织金属蛋白酶抑制剂(TIMPs),以及组织蛋白酶和一个强有力的组织蛋白酶抑制剂、半胱氨酸蛋白酶抑制物C (CST3)。
基质金属蛋白酶是一个家族的蛋白水解酶,降解胶原蛋白和弹性蛋白和扮演一个重要角色在组织改造和修复与炎症有关5]。MMP1、MMP9 MMP12是由肺泡巨噬细胞和一些研究在动物和人类提供了证据,这些基质金属蛋白酶是重要的在气道炎症和肺气肿的发展6,7]。组织蛋白酶L (CTSL)和组织蛋白酶S (CTSS)溶酶体半胱氨酸蛋白酶由肺泡巨噬细胞(6),也可能参与了慢性阻塞性肺病通过弹性蛋白的降解8]。
慢性炎症过程被认为是重要的慢性阻塞性肺病的病理、细胞因子如白介素(IL) 1β和肿瘤坏死因子(TNF) -α疾病过程中可能发挥重要作用[9]。微生物感染诱导通过支气管炎症慢性阻塞性肺病患者急性加重,导致组织损伤,可能导致肺气肿的发展10]。还因此,重要的是要研究蛋白酶的表达变化和antiproteinases诱导炎性细胞因子和脂多糖(LPS),一个强有力的促分泌素各种炎性细胞因子(10]。
我们假定的高表达水平(基底和刺激IL-1β,TNF-α或有限合伙人)的蛋白酶(MMP1、MMP9 MMP12, CTSL和CTSS)和/或低水平的antiproteinases (TIMP1、TIMP2 TIMP3和CST3)在人类肺泡巨噬细胞可以降低肺功能(气流限制和一氧化碳(肺的扩散能力DLCO))和更大的肺气肿的程度。我们还提出,这些基因的多态性将改变他们的信使rna和蛋白质的表达水平。
材料和方法
研究对象
109名受试者接受肺切除术对小(< 3厘米直径),TNM(肿瘤、节点转移)阶段I或II,外围温哥华总医院肿瘤(加拿大温哥华BC)参与了这个研究。部分结果这些受试者包括54的一项研究[11]。术前肺功能测试进行包括在1 s (FEV用力呼气量1)、用力肺活量(FVC)和单一的呼吸DLCO/肺泡体积(V一个),按照美国胸科学会指南(12]。计算机断层扫描(CT)扫描在75年被用于评估肺气肿。受试者所示的特点表1。
本研究通过英属哥伦比亚大学的温哥华/普罗维登斯医疗和医院和健康科学研究伦理委员会(加拿大温哥华BC)。所有科目为这项研究提供了书面知情同意。
计算层析分析
半定量肺气肿视觉评分的细节,和定量计算机分析的百分比与肺气肿肺,给出在线补充材料和方法。
支气管肺泡灌洗和细胞培养
切除肺或叶得到立即结束和支气管肺泡灌洗。洗胃的细节,巨噬细胞分离和随后的文化在网上补充材料和方法。
RNA提取,互补脱氧核糖核酸合成和定量实时PCR
互补脱氧核糖核酸制备的细节和量化实时PCR(在线补充表S1)给出了在线补充材料和方法。
蛋白定量
蛋白质的细节量化elisa或zymography给出在线补充材料和方法。
基因分型
我们选择多态性(在线补充表S2)在基质金属蛋白酶、组织蛋白酶,TIMPs和CST3之前与慢性阻塞性肺病和/或相关基因表达(rs1799750的监管MMP1,D20S838 rs3918242MMP9,rs2276109MMP12,rs2277698TIMP2(13- - - - - -17]。此外,我们选择单核苷酸多态性(snp)从人类基因组单体型图计划(www.hapmap.org)来识别一个单体型块覆盖每一个基因的启动子区域(细节在网上补充材料和方法)。
统计分析
统计分析使用JMP软件版本5.1 (SAS研究所Inc .,卡里、数控、美国)。线性回归分析是用来评估mRNA和蛋白表达与肺功能测试和定量CT扫描数据。我们也使用线性回归评估基因型与信使核糖核酸或蛋白表达与加性模型,假定值计算的线性模型基于沃尔德检验统计量。序数回归是用来检查半定量的CT评分之间的关系和基因表达水平。我们调整了年龄、性别、种族和吸烟史(久)。如果值不是正态分布,分析之前他们对数转换。
假定值< 0.05名义上被认为是重要的。由于分析的性质和独立和相关的变量的多个测试,修改Bonferroni调整为多个比较是所描述的Nyholt(18),这个调整过程的细节提供了在线补充表S3和S4。本研究设计的力量估计使用许多比例函数和在2005年通过线性回归函数19]。
结果
蛋白酶和antiproteinase mRNA的表达
蛋白酶的信使rna表达水平(MMP1、MMP9 MMP12, CTSL和CTSS)和antiproteinases (TIMP1、TIMP2 TIMP3和CST3)在肺泡巨噬细胞在不同实验条件下(基底,即。无教养的巨噬细胞,培养没有刺激,培养与刺激由IL-1βTNF-α或有限合伙人)所示S1-S9在线补充数据。没有刺激的肺泡巨噬细胞培养有显著提高(除了表达所有的基因TIMP3和CST3)相对于基底基因表达水平。LPS刺激,所有蛋白酶的表达水平(CTSS除外),以及TIMP1显著增加。相反,的表达水平TIMP2和中科3降低LPS刺激后。与IL-1β或TNF-α刺激后的表达水平MMP1,MMP9和TIMP1显著增加。刺激与IL-1β或TNF-α导致显著下降TIMP2表达式。
没有明显的影响年龄、性别或种族的基础表达基因。吸烟状态在基底的影响基因表达S5在线补充表所示。MMP12高和基底表达式TIMP2基底表达降低与前相比,吸烟者吸烟。TIMP3基底表达呈正相关,久的时间CTSS与久的表达呈负相关。
蛋白酶和antiproteinase基因型与基底和刺激基因表达
随着遗传变异可能影响慢性阻塞性肺病表型调制的蛋白酶和antiproteinase信使rna和蛋白质表达谱,我们调查是否多态性改变各自的基因产物的表达水平。所有的多态性我们调查在哈迪温伯格平衡(p≥0.18)在高加索亚组(n = 87),如在线补充表所示S2。
总结的结果之间的关联基因型和基底基因表达和表达改变S6在线补充表所示。MMP1信使rna基底反向LPS引起的表达和蛋白表达均与越来越多的2 g等位基因MMP1rs1799750(在线补充无花果S10和S11分别)。CTSL蛋白表达无刺激与越来越多的反向相关的T等位基因CTSLrs2274611(在线补充图S12)。最重要的基因型与基因表达协会为基底的表达CST3信使rna,反向与越来越多的一个等位基因有关CST3rs6036478(在线补充图向)。校正后,所有这些协会依然显著多重比较。
蛋白酶和antiproteinase mRNA表达与慢性阻塞性肺病表型
我们分析了慢性阻塞性肺病表型的关系,使用线性回归分析基底mRNA表达水平(表2和在线补充表S7)。的基础表达水平MMP12在肺泡巨噬细胞表现出显著的反向关联DLCO/V一个%多个校正后,预测依然显著的比较。散点图之间的关系MMP12基底mRNA表达和DLCO/V一个% pred所示图1。还有一个逆基底之间的联系MMP12和FEV1/ FVC % (图2)。数据还表明,有正相关(p = 0.0052,未修正的多个比较)基底之间的表达MMP1和半定量的视觉评估肺气肿程度的CT扫描(n = 75);校正之后,这种关系不再显著为多个比较,所需的意义p < 0.0012。没有显著关联(未修正的p = 0.120)和肺气肿的计算机定量评估CT扫描(n = 45),这可能是由于低的这些数据。
基底mRNA表达基质金属蛋白酶12之间的关系(MMP12在肺的肺泡巨噬细胞和扩散能力一氧化碳(DLCO)/肺泡体积(V一个(%)%预测pred)。
![图2 -](http://www.qdcxjkg.com/content/erj/43/1/82/F2.medium.gif)
基底mRNA表达基质金属蛋白酶12之间的关系(MMP12在肺泡巨噬细胞并在1 s (FEV用力呼气量1)/用力肺活量(FVC) %。
我们还测试了LPS引起的mRNA表达的变化之间的联系,慢性阻塞性肺病TNF-αIL-1β和表型(表3和在线补充表S8)。最重要的结果是,表情的变化MMP9信使rna刺激TNF-αFEV呈负相关1% pred (p = 0.0005),但这没能活下来修正为多个比较,因为所需的水平的意义p < 0.00042。
信使rna和蛋白质之间的关系表达式
当我们假定基因表达与慢性阻塞性肺病表型相关的蛋白表达水平,我们研究了基因的mRNA和蛋白表达之间的联系,显示至少名义上重要的协会与临床结果。我们比较mRNA水平与蛋白质浓度的MMP1、24小时MMP9, MMP12, CTSL, TIMP2 CST3 48 h后在媒体文化。蛋白质的水平S9在线补充表所示。我们观察到显著的信使rna和蛋白质含量之间的相关性可以与LPS刺激,MMP9没有有限合伙人,和MMP12有无有限合伙人(在线补充表S10)。之间的相关性MMP12信使rna和蛋白质的表达MMP12肺泡巨噬细胞所示图3。基底mRNA的表达MMP12也呈正相关的蛋白表达水平与LPS刺激(p = 1×10吗−5)。
![图3 -](http://www.qdcxjkg.com/content/erj/43/1/82/F3.medium.gif)
之间的相关性MMP12信使rna和蛋白质的表达基质金属蛋白酶(MMP) 12日在肺泡巨噬细胞。的信使rna表达水平MMP12在24 h MMP12呈正相关,蛋白质在媒体中肺泡巨噬细胞在培养48 h . a)没有刺激和b)和脂多糖刺激。
我们也调查了褶皱mRNA和蛋白水平的变化之间的相关性在文化与不同刺激(在线补充表S11)。重要关系观察MMP1水平与LPS刺激后的变化和IL-β。MMP9信使rna和蛋白质的变化表现在文化与所有刺激也显著相关。
讨论
在这项研究中,我们发现的基因型MMP1,CTSL和CST3显示显著的关联与mRNA的表达和/或蛋白质水平。的MMP11 2 g / g多态性(rs1799750)曾被与基因表达(20.),但这是第一个描述的影响在肺泡巨噬细胞的转录。没有rs2274611的先前的研究CTSL多态性,但CTSL启动子SNP (rs3118869)与记者有关基因的表达在体外(21]。rs3118869显示表达式比C等位基因的一个等位基因(p = 3.36×10−6荧光素酶检测和相关(p = 0.0143)和更高层次的CTSL蛋白质在我们的研究中(在线补充表S6)。rs3118869 C等位基因的连锁不平衡(r2= 0.8648)rs2274611 C等位基因,这是相关(p = 0.0007)高CTSL蛋白质在我们的研究中(在线补充表S6)。因此,这个研究首次证实功能rs3118869对转录的影响我们也展示了小说与CTSL蛋白质水平。没有以前的研究的CST3rs6036478多态性在文献中,但这个SNP的SNP的单体型高连锁不平衡(r2> 0.92),它已被证明影响血清/血浆CST3水平[22- - - - - -25]。我们观察的(小)等位基因rs6036478基底较低有关CST3信使rna(在线补充表S6)与这些以前的数据是一致的,小说在慢性阻塞性肺病的背景下。
的基础水平MMP12信使rna的表达呈负相关DLCO/V一个% pred和FEV1/ FVC % (表2)。MMP12蛋白质含量与LPS刺激后也负相关DLCO/V一个% pred和肺气肿的量化评分呈正相关(表4和在线补充表S12)。校正后,尽管这些后者关联不显著为多个比较,协会的方向的一致性表明蛋白酶。一个真正的病理生理学作用
我们的小说之间的联系的结果MMP12表达和肺扩散能力,以及肺气肿的程度,表明MMP12肺气肿在人类发展的作用。据报道,遗传变异MMP12与COPD和哮喘(26]。然而,没有直接联系肺气肿和报告的表达MMP12肺泡巨噬细胞的人类。MMP12基因敲除小鼠不开发肺气肿后暴露于香烟烟雾中(27),这表明存在MMP12烟雾诱发肺气肿的老鼠是至关重要的。我们的研究进一步表明角色MMP12肺气肿的发病机理。底层机制,这种作用可能与MMP12 TNF-α刺激中性粒细胞的激活,导致生产MMP9、中性粒细胞弹性蛋白酶和组织蛋白酶G,降低弹性蛋白,可能导致肺气肿28]。此外,MMP9和特定MMP12降解胶原蛋白(29日,30.]。MMP12增加肺部(31日和痰32慢性阻塞性肺病的患者。
我们还表明,基底的水平MMP1信使rna的半定量的评估呈正相关,肺气肿的程度(p = 0.0052),在我们以前的报告,基于第一44例CT扫描(11]。因此,我们扩展不仅证明以前的观测MMP12信使rna还与蛋白质水平DLCO/V一个和肺气肿。
香烟和其他刺激物刺激肺泡巨噬细胞产生基质金属蛋白酶(33,34和组织蛋白酶35]。可以降解胶原蛋白而MMP9、MMP12 CTSL和CTSS降低弹性蛋白36]。尽管人类MMP1胶原酶,其表达转基因小鼠的肺部造成肺气肿(37)和表达可以增加患者的肺肺气肿(38]。吸烟者有气道阻塞显示增加MMP1、MMP9的表达与吸烟者没有慢性阻塞性肺病和非吸烟者(39]。
我们观察到小说协会TNF-α诱导MMP9与FEV mRNA表达1% pred (表3)。这与之前的数据,证明观察是一致的MMP9表达增加FEV在周围的肺实质小航空公司1% pred下降(40]。也有支持性的证据表明MMP9有助于肺气肿从小鼠模型的发展41,42]。我们的数据表明,MMP9的水平在特定的促炎症反应刺激在慢性阻塞性肺病的发展起着至关重要的作用,同意TNF-α研究表明,增加与减少肺功能(40],TNF-α扮演着一个重要的角色在香烟烟雾诱发肺气肿43]。
CTSL蛋白质含量与FEV有关1% pred,这表明这种蛋白酶在慢性阻塞性肺病的发展。然而,个人的巨噬细胞分泌更多CTSL最好肺功能。我们没有观察到这种关系在我们之前的研究11但同样的趋势(即。更高的CTSL有或没有有限合伙人与更高的肺功能)与估计的回归分析。然而,假定值没有明显由于样本量较小。目前还不清楚机制构成这种“矛盾”的关系。然而,CTSL表达在胸腺细胞对自然杀伤t细胞发育至关重要44),和自然杀伤细胞对病毒感染免疫的重要作用[45),外周血中减少在慢性阻塞性肺病46]。同样,CTSL参与抗原处理(47,48和辅助细胞的发展49,50]。因此,CTSL蛋白表达可以增强免疫能力,减少急性加重和预防进展的慢性阻塞性肺病。CSTL也扮演一个重要角色在神经肽的生产(51),如神经肽Y,减少慢性阻塞性肺病患者的气道上皮与影响吸烟者(52),表明这个分子的保护作用。此外,CSTL参与促肾上腺皮质激素的生产,和upregulation激素减毒后COPD患者的运动(53]。
在这项研究中,基因表达有显著差异在没有刺激的巨噬细胞培养与原发性巨噬细胞相比,正如我们之前所示(11]。这种现象也被观察到小鼠巨噬细胞(54)和其他细胞后文化(55,56]。虽然它是不足为奇nonphysiological条件(即。细胞培养)改变基因表达在我们的研究中,这是由于是否坚持的gcells塑料基质细胞培养的菜肴或组件的培养基是未知的。
最近的一项研究调查后基因表达的变化滴剂LPS的肺在健康个体(n = 8)相比,滴注法的盐水侧肺(57]。在那在活的有机体内研究[57),TIMP1是调节2.4倍(p = 3×10吗−4)与有限合伙人的挑战之后,镜像的增加TIMP1信使rna后,我们观察到文化与有限合伙人(在线补充图S6)。同样的,TIMP2有限合伙人的mRNA表达下调是跟踪滴剂(p = 3×10−3),我们也观察到显著减少TIMP2信使rna后文化与有限合伙人(在线补充图S7)。
与我们相比之前的研究(11样本大小),我们已翻了一番,增加的力量分析和评估额外的基因(即。的antiproteinasesTIMP1,TIMP2,TIMP3和CST3)。我们也测量了水平的蛋白质对应六而我们之前的手稿只包括信使rna的基因数据11]。
我们的研究有一些限制对基因表达和慢性阻塞性肺病或肺气肿表型。总样本109例80%电力检测基因表达之间的联系和慢性阻塞性肺病表型只有r2值≥0.3。我们有一个小的DLCO/V一个% pred和CT扫描数据,与这些表型关联不大。此外,有一小部分严重的慢性阻塞性肺病患者在我们的研究中(59%的受试者FEV1值在正常范围内)。此外,肺癌患者的肺泡巨噬细胞的使用对我们的研究增加了潜在的偏见。具体地说,几位MMP的多态性与肺癌有关58),因此风险等位基因可能是选择在我们的学习小组。不过,所有的单核苷酸多态性与期望在我们的研究中表现出良好的协议在哈迪温伯格平衡(在线supplemetary表S2)表明没有强烈的选择性偏差。此外,等位基因频率通常类似于人类基因组单体型图数据(在线supplemetary表S2)。蛋白酶和antiproteinase基因的表达水平也可能受到肺部肿瘤的存在。然而,如上所述,我们的结果类似于Reynier等。(57在受试者没有癌症,表明本研究适用于非癌人群的观察。
总之,蛋白酶和antiproteinases之间,我们的数据进一步支持先前的研究证明MMP12和MMP1可能在肺气肿的发病机制有重要的作用。此外,CTSL可以积极影响气流的发展限制通过蛋白质表达和遗传变异的影响。
确认
作者欣然承认香港的技术援助,罗莎·加西亚,贝思惠伦,塞巴斯蒂安Cogswell,芭芭拉·摩尔,马克·艾略特和史蒂夫Kalloger(公元前温哥华英属哥伦比亚大学,加拿大)。我们也感激地承认伊肯·埃文斯和约翰(英属哥伦比亚大学)为我们提供肺标本病人肺切除手术,以及Paola Nasute Fauerbach,内斯托尔·穆勒(英属哥伦比亚大学)分配的半定量的肺气肿分数CT扫描。
彼得·d·削减是雅各Churg迈克尔·史密斯杰出的学者和杰出的研究员。
脚注
可以从本文的补充材料www.www.qdcxjkg.com
支持声明:本研究得到的资助支持加拿大卫生研究院的研究。A.J.桑福德的接受者是迈克尔·史密斯医疗研究基金会高级奖学金奖(批准号ci - ssh - 01874 (07-1))。t . Ishii是辉瑞的接受者从日本呼吸协会奖学金,奖学金的支持公元前肺脏协会,CIHR / HSFC影响战略培训项目。
利益冲突:没有宣布。
- 收到了2012年10月30日。
- 接受2013年4月30日。
- ©2014人队