文摘gydF4y2Ba
以前的动物模型的急性肺损伤(ALI)是有限的,因为他们只复制复杂的临床病理学阿里的一部分。我们开发一个平移阿里的老鼠模型,它不仅反映了主要的临床和病理特征,还使调查阿里决议。gydF4y2Ba
犀牛老鼠接受了气管滴注法仍的盐酸。立即期间滴剂后,老鼠与补充氧气精心维护,以避免死亡。在指定的跨度为,肺损伤评估通过分析血液气体,呼吸力学、支气管肺泡灌洗液,肺泡液体间隙和肺组织学。gydF4y2Ba
动物表现出显著的减肥,减少氧化,增加呼吸倒电容和肺部炎症(intra-alveolar白细胞涌入/细胞因子水平和组织学损伤分数)。此外,老鼠显示alveolar-capillary屏障功能障碍/上皮损伤反映在增加肺泡蛋白质、肺湿/干重比和晚期糖化终产物可溶性受体,以及减少肺泡液体间隙。天1和3之间的这些损伤参数达到顶峰,随后几乎完全恢复5 - 10在天。组织学显示纤维化在10天的证据。gydF4y2Ba
酸愿望的结果表明,该解析模型代表一个强大的实验工具调查有害,炎症、纤维化和阿里的解决和弥补的过程。gydF4y2Ba
急性肺损伤(ALI),或者更严重的形式急性呼吸窘迫综合征(ARDS),继续造成重大的发病率和死亡率(gydF4y2Ba1gydF4y2Ba]。它的特点是急性渗出性阶段涉及肺部水肿和炎症,导致严重的低氧血,常常需要机械通气。从阿里复苏包括阶段的分辨率和修复,其中可能包括大量的肺纤维化。然而,管理是否和如何将这些病理生理过程发生的机制仍然知之甚少(gydF4y2Ba2gydF4y2Ba]。的主要原因之一是缺乏理解现有的临床前模型的本质,只要没有完全复制复杂的临床病理学阿里。大部分的动物研究都集中在急性渗出性阶段,机制和很少的模型允许考试后阶段的炎症,分辨率和修复。这些问题尤为突出在最近的美国胸科学会车间所需报告特性模型动物实验阿里(gydF4y2Ba3gydF4y2Ba),以及由其他评论强调需要真正转化ALI / ARDS[造型gydF4y2Ba4gydF4y2Ba,gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba
酸愿望范式可能被描述为最可翻译直接ALI / ARDS模型,因为有明显的临床相关gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]。尽管如此,只有3%的近期文献表明在利用酸愿望(gydF4y2Ba4gydF4y2Ba]。这是最有可能是由于一个狭窄的剂量之间的窗口没有受伤,压倒性的损伤导致高死亡率。为了规避这个问题,大多数模型利用酸愿望包括机械通风保持动物,这限制了调查人员的急性阶段(< 4 - 6 h) ALI / ARDS [gydF4y2Ba6gydF4y2Ba,gydF4y2Ba7gydF4y2Ba),或者使用低酸体积、高pH值和/或单侧肺滴剂来改善生存(gydF4y2Ba8gydF4y2Ba,gydF4y2Ba9gydF4y2Ba]。然而,这一方法可以说是不可能复制的严重性(更不用说双边性质)临床阿里需要真正的转化。gydF4y2Ba
在这项研究中,我们已经开发、优化和特征的模型酸愿望繁殖许多生理、生物和病理变化中发现人类ALI / ARDS,此外,显示几乎全部解决了5 - 10天。我们相信,这个模型将大量使用,进一步理解人类的ALI / ARDS,特别是那些过程调节分辨率和修复。gydF4y2Ba
方法gydF4y2Ba
酸愿望的动物模型gydF4y2Ba
伦理审查委员会批准的协议都是伦敦帝国理工学院(英国伦敦),和英国的权威下进行家庭办公室按照动物(科学程序)法案1986年,英国。我们使用雄性C57BL / 6小鼠(查尔斯河,马尔盖特,英国)年龄在10 - 12周,体重25 - 30 g。总共使用了68只动物:23测量呼吸力学和肺泡炎症,25评估肺泡液体间隙,20肺湿/干重和组织学评分。gydF4y2Ba
小鼠腹腔内注射,曝露的甲苯噻嗪(6毫克公斤gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba)和氯胺酮(60 mg·公斤gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba10),给定一个腹腔内液体丸μL·ggydF4y2Ba−1gydF4y2Ba0.9%生理盐水,先发制人的液体复苏。老鼠垂直悬挂的门齿气管滴注法仍在一个定制的山,像前面描述的那样gydF4y2Ba10gydF4y2Ba](在线补充材料提供了更多细节)。细导管引导1厘米低于声带,和75年μL iso-osmolar(鼠标等离子体,gydF4y2Ba即。gydF4y2Ba322 mOsm·LgydF4y2Ba−1gydF4y2Ba)解决方案的0.1 M盐酸(pH值1.0)灌输。在接下来的4 h,在此期间动物表现出显著的呼吸抑郁/痛苦急性酸aspiration-induced阿里的结果,老鼠保存在一个定制的湿润下的透明的复苏框补充氧气吸入氧气分数(gydF4y2BaFgydF4y2Ba阿,我gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)降低逐渐从1.0到0.21)。在此期间,动物是仔细监控和体温维持使用外部热源,之后,他们分别转移到通风笼与空气和自由获取食物和水。gydF4y2Ba
生理测量gydF4y2Ba
在指定的跨度为(1、2、3、5和10天)酸滴剂后,动物称重和接受手术准备机械通风,进行标准化评估肺气体交换能力和呼吸力学。准备鼠标机械通风和肺功能测试之前已经详细描述(gydF4y2Ba11gydF4y2Ba,gydF4y2Ba12gydF4y2Ba]。总之,老鼠,曝露,tracheostomised使用定制的通风机和通风,左颈动脉插管监测动脉血液气体和血压。在最初肺招聘策略(30而言不啻gydF4y2Ba2gydF4y2Ba5 s O),动物是通风30分钟(潮汐卷8 - 9毫升·公斤gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba呼气末正压通气的2.5而言不啻gydF4y2Ba2gydF4y2Ba啊,呼吸速率120呼吸·分钟gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba和gydF4y2BaFgydF4y2Ba阿,我gydF4y2Ba2gydF4y2Ba1.0)标准化肺体积的历史。通风的末尾,血液气体测量和呼吸力学确定使用end-inspiratory闭塞技术,如前所述[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba,gydF4y2Ba13gydF4y2Ba]。Acid-injured动物与否则未经处理的小鼠相比,接受手术准备和30分钟通风过程。gydF4y2Ba
肺部炎症gydF4y2Ba
在上述过程结束时,老鼠被麻醉过量牺牲。支气管肺泡灌洗(BAL)进行750μL盐水如前所述[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba)和样本离心机240×gydF4y2BaggydF4y2Ba。BAL液中的蛋白质含量(BALF)量化(赫默尔亨普斯特德镇Bio-Rad实验室、英国)和BALF白介素(IL) 6、肿瘤坏死因子(TNF) -αkeratinocyte-derived趋化因子(KC)、巨噬细胞炎性蛋白质(MIP) 2和可溶性受体晚期糖化终产物(愤怒)测定使用ELISA试剂盒(研发系统,阿宾顿,英国)。BALF细胞计数得到使用血球计,微分细胞学上执行DiffQuik-stained样品由cytospin (Shandon,道,英国)。gydF4y2Ba
肺泡液体间隙gydF4y2Ba
在一个单独的一系列实验中,肺泡液体间隙(AFC)决定在天1,2,3,5,10后酸滴剂(未经处理的动物),使用先前描述的修改gydF4y2Ba原位gydF4y2Ba模型(gydF4y2Ba14gydF4y2Ba]。老鼠,曝露,tracheostomised插管gydF4y2Ba通过gydF4y2Ba颈动脉和通风如上所述。后静脉heparinisation(20单位)、动物牺牲,抽血泄肺血管和减少任何潜在的亚足联肺血管压力的影响。每只动物然后收到三个肺招聘演习进一步规范卷肺部的历史和空的容器。整个过程用了< 15分钟。gydF4y2Ba
老鼠然后接受气管内的滴剂700μL iso-osmolar中含有5%低内毒素的牛血清白蛋白(BSA;Sigma-Aldrich有限公司吉林厄姆,英国)和50μg·毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba594 -共轭荧光AlexaFluor BSA(表达载体,佩斯利,英国)。没有切断滴剂注射器,400μL instillate立即撤回re-instilled,其次是切除200年前整除μL作为时间(t)零参考样本。这个过程保证均匀分布的instillate,参考样品尽可能代表肺泡的内容。老鼠被放置在一个持续气道正压系统在8而言不啻交付100%的氧气gydF4y2Ba2gydF4y2Ba啊,和维护在36.5华氏-38°C。30分钟后滴剂,气胸手术是诱导肺复苏的其余instillate最大化。亚足联比例超过30分钟是由方程:gydF4y2Ba
在哪里gydF4y2BaFgydF4y2Ba0gydF4y2Ba荧光的吗gydF4y2BatgydF4y2Ba= 0分钟参考样本gydF4y2BaFgydF4y2Ba30.gydF4y2Ba荧光的吗gydF4y2BatgydF4y2Ba= 30分钟样本。在网上可以找到更详细的方法补充材料。gydF4y2Ba
肺损伤评分gydF4y2Ba
在一个单独的一系列实验中,酸受伤的老鼠(在每个时间点)和未经处理的动物被牺牲了,他们在15而言不啻左肺灌输和膨胀gydF4y2Ba2gydF4y2BaO删除了4%多聚甲醛和石蜡包埋。片在10-μm厚度随后被苏木精和伊红染色(Sigma-Aldrich有限公司),或马森的三色的染色(Sigma-Aldrich有限公司)纤维化。肺损伤分数量化由调查员蒙蔽用最近公布的标准治疗组,使整体分数在0和1之间(有关详细信息,请参阅在线补充材料)gydF4y2Ba3gydF4y2Ba]。正确的肺系之前多聚甲醛滴剂,和删除测定肺湿/干重比。gydF4y2Ba
统计数据gydF4y2Ba
数据意味着±gydF4y2BasdgydF4y2Ba。生理参数的统计分析是由单向方差分析与Bonferroni测试每个时间点和之间的两两比较的控制(表示为天0)。我们用斯皮尔曼相关系数的测试愤怒水平和其他连续变量之间的相关性。统计学意义是定义为p < 0.05。gydF4y2Ba
结果gydF4y2Ba
生理学gydF4y2Ba
老鼠表现出显著的减肥后的头3天酸滴注法尽管最初液体复苏,随后恢复到伤前水平的第十天(gydF4y2Ba图1一个gydF4y2Ba)。在第一次2天,动物显示减少运动,立毛和呼吸困难表明损伤。与此一致的是,相比之下,未受伤害的动物(天0),动脉氧合显著恶化由第一天与逐步改善损伤后第五天(gydF4y2Ba图1 bgydF4y2Ba)。指动脉氧张力((gydF4y2BaPgydF4y2Ba啊,一个gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)/gydF4y2BaFgydF4y2Ba阿,我gydF4y2Ba2gydF4y2Ba比率)实现临床ARDS标准(< 200)第一天和阿里标准(< 300)天2和3。呼吸系统倒电容大幅增加在损伤后1和2天,然后返回到基线从第三天(gydF4y2Ba图1 cgydF4y2Ba)。没有明显变化,呼吸系统阻力(数据未显示)。另外,湿/干重比决心评估肺水含量,这显示出显著增加61%在第一天,拒绝向正常的限制白天3 (gydF4y2Ba图1 dgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
肺泡炎症gydF4y2Ba
BAL细胞学显示一个戏剧性的变化在细胞结构损伤后肺泡空间gydF4y2Ba图2一个gydF4y2Ba和b)。在滴注法之前,细胞内容几乎完全肺泡巨噬细胞。酸滴剂后中性粒细胞的比例急剧增加,BAL中性粒细胞数量显示峰值在第二天后跟一个显著下降3天有效的第十天。此外,我们发现在愿望后淋巴细胞比例逐渐增加,白天10(中性粒细胞消失了一次),他们构成了细胞总数的15%人口网上(见补充材料)。中性粒细胞牙槽炎的时间剖面反映的变化BALF的小鼠中性粒细胞趋化因子水平MIP-2和KC (gydF4y2Ba图2 cgydF4y2Ba和d)和促炎介质TNF-α和il - 6 (gydF4y2Ba图2 e和fgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
肺泡上皮功能障碍gydF4y2Ba
Alveolar-capillary屏障通透性评估的BALF蛋白质显示大幅增加在第一天第十天(恢复到正常水平gydF4y2Ba图3gydF4y2Ba)。BALF的愤怒也显著调节在第一天,随后降低,接近基线的第三天(gydF4y2Ba图3 bgydF4y2Ba)。BALF可溶性愤怒水平被发现反向关联gydF4y2BaPgydF4y2Ba啊,一个gydF4y2Ba2gydF4y2Ba/gydF4y2BaFgydF4y2Ba阿,我gydF4y2Ba2gydF4y2Ba(r = -0.71, p < 0.01;gydF4y2Ba图3 cgydF4y2Ba)。最后,我们通过测量亚足联肺泡上皮功能检查率(gydF4y2Ba图3 dgydF4y2Ba),它显示在第一次严重恶化后2天酸滴注法。有趣的是,肺恢复能力明显液体后第三天,显示肺泡上皮功能的恢复。gydF4y2Ba
肺损伤评分gydF4y2Ba
酸吸入引起的肺实质性改变架构而未受伤害的控制。在第一个48 h有破坏肺泡和肺泡腔内的流体和出血(gydF4y2Ba图4 a - cgydF4y2Ba)。肺泡壁明显增厚,中性粒细胞和单核细胞浸润,有透明膜沉积。后第三天肺中性粒细胞浸润,肺泡结构和碎片有些正常化,但仍然是一个细胞渗透,本质上主要是单核的(gydF4y2Ba图4 d-fgydF4y2Ba)。总而言之,肺损伤分数显著增加天1和2 (gydF4y2Ba图4 ggydF4y2Ba)。此外,细支气管壁增厚表明胶原沉积。证实了这种可能性,部分沾着马森的三色的显示胶原蛋白在增加,尤其是在近端到终端的城墙细支气管(gydF4y2Ba图5gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
讨论gydF4y2Ba
尽管多个潜在的分子目标已确定和证明是有效的在动物模型的阿里,还没有一个翻译为ALI / ARDS患者临床益处。翻译的一个主要缺陷,从基础研究到临床应用的多样性是动物模型不能完全复制人类的条件。实际上,最近的评论强调最佳ALI / ARDS模型,所需的功能,目前没有动物模型复制这种毁灭性疾病的复杂性(gydF4y2Ba3gydF4y2Ba,gydF4y2Ba4gydF4y2Ba,gydF4y2Ba15gydF4y2Ba]。在这项研究中,我们将描述ALI / ARDS诱导的小鼠模型的双边滴剂酸,我们认为代表一个重要一步的繁殖的绝大多数临床ALI / ARDS的主要病理生理特征。gydF4y2Ba
当前研究的主要目标是开发一个模型,引起实质性的伤害,但低死亡率随着时间的推移,允许调查决议/修复过程从这个高度受伤的基线。现有的模型很少能捕捉到这两个方面。实验范式,如高弹机械通气(gydF4y2Ba16gydF4y2Ba),静脉注射油酸(gydF4y2Ba17gydF4y2Ba],盲肠的结扎和穿刺引起的脓毒症gydF4y2Ba18gydF4y2Ba),可以诱导压倒性的伤害从数小时到数天时间,但不允许调查修复/决议。相反,模型,如气管内的内毒素和博来霉素可能允许调查周围的某些方面解决炎症和纤维化的过程可以发生后临床ALI / ARDS,但不产生大量的低氧血是疾病诊断的先决条件(gydF4y2Ba4gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba
双边滴剂类似的浓度的酸用于这项研究已经报道产生重要的早期小鼠的死亡率(gydF4y2Ba9gydF4y2Ba]。这是最有可能是由于大量的支气管痉挛和上呼吸道水肿引起的酸,和/或严重低氧血在肺损伤的急性期结合呼吸抑郁症产生的麻醉。而其他研究已经绕过这个通过减少剂量/强度的酸(gydF4y2Ba8gydF4y2Ba,gydF4y2Ba9gydF4y2Ba)或利用机械通风(gydF4y2Ba6gydF4y2Ba),我们发现,小心气道操纵在滴注法,以及补充氧的使用与维护湿度/温度在最初的几个小时后滴注法成功地减少死亡率为零。酸滴注法,然而,导致显著的减肥,这持续了受伤的前3天,尽管最初的流体丸。我们之前发现,使用完全相同的麻醉方案和滴剂技术,低剂量内毒素滴剂导致的减肥只有∼2%在24小时gydF4y2Ba10gydF4y2Ba),而本研究∼8%。因此,减肥在当前模型的程度可能真正反映疾病的严重程度和进展。gydF4y2Ba
由于他们的肋骨、麻醉和手术准备在老鼠身上不可避免的引发一些肺泡破裂,直到建立机械通风。肺崩溃的程度及其对呼吸生理参数的影响往往难以控制。因此我们评估这些acid-injured动物动脉血液气体和呼吸力学和未经处理的控制体积严格标准化后的肺部的历史,gydF4y2Ba即。gydF4y2Ba招聘策略之后,短时间内正压通风O为100%gydF4y2Ba2gydF4y2Ba。在第一次愿望后3天,呼吸系统力学和动脉氧合都与正常相比大幅恶化。事实上,氧化达到的标准临床ALI / ARDS的前3天,使零死亡率和有效地全面复苏的天5 - 10更加显著。受伤的缺乏死亡高峰期间(1 - 2天)也可能是特定于酸模型以最小的血液动力学的妥协,相比与其他ALI模型,如高剂量脂多糖、盲肠的结扎穿刺和油酸。gydF4y2Ba
先前的研究已经显示肺内炎症阿里的重要性。动物研究已经识别出多种炎症介质,当干扰,减弱伤害(gydF4y2Ba19gydF4y2Ba),而临床研究显示强大的各种介质和死亡率之间的相关性(gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]。成功的从阿里因此复苏需要适当和及时解决炎症(gydF4y2Ba21gydF4y2Ba]。虽然大多数的临床前试验目标炎症通路预防性或非常损伤诱导后不久,在现实中大多数ALI患者出席了以后在疾病的进展,这意味着一个更现实的目标可能是炎症分辨率的增强。移除中性粒细胞从肺泡空间分辨率发生[是绝对必要的gydF4y2Ba22gydF4y2Ba]。在当前的模型我们发现BAL中性粒细胞数量的峰值在第二天,大大减少了3天。继续增加中性粒细胞(和TNF-α水平)肺泡空间48 h酸愿望与先前的研究一致[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba),尽管研究没有调查后跨度为。中性粒细胞在肺泡空间的存在和间质肺损伤评分的主要决定因素是利用在这项研究在线(见补充材料),和减少损伤分数从第三天证实,中性粒细胞中不仅从肺泡肺本身,而不是迁移/重新分配其他肺车厢内不可以落下帷幕。尽管中性粒细胞的命运并没有专门调查,他们最有可能接受由肺泡巨噬细胞凋亡efferocytosis紧随其后(gydF4y2Ba24gydF4y2Ba,gydF4y2Ba25gydF4y2Ba),这对于解决炎症反应是至关重要的。中性粒细胞减少的水平是由可溶性炎性介质的变化,有效地反映肺泡也符合一个重大转变的环境从促炎症状态pro-resolution天2 - 3之间的状态。最后,增加肺泡空间内的淋巴细胞比例明显对损伤后的第十天,这可能是符合最近的工作突出的潜在参与调控t细胞在阿里的决议gydF4y2Ba26gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba
它已经表明,肺泡水肿形成ALI / ARDS与上皮功能障碍(gydF4y2Ba27gydF4y2Ba]。恶化呼吸力学观察反映肺部水肿和肺泡塌陷,并增加BALF蛋白质含量和肺湿/干重比确认重要的肺泡渗透率和水肿在急性期的损伤模型。各种特定的生物标记上皮损伤在阿里已经提出,与愤怒最近提倡(gydF4y2Ba28gydF4y2Ba]。愤怒表达1型基底表面的上皮细胞,并已被证明能增加BALF和等离子ALI / ARDS患者的gydF4y2Ba29日gydF4y2Ba]。在小鼠模型中酸的愿望,BALF愤怒水平还发现关联强烈酸灌输的pH值(gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba]。我们发现BALF可溶性愤怒与氧化水平,这表明我们的模型产生显著的上皮功能障碍及其随后的决议。除了屏障通透性恶化,我们发现酸滴剂导致肺泡液体减少间隙。酸愿望模型被证实能够减少亚足联[gydF4y2Ba31日gydF4y2Ba],但我们首次展示在这个模型的改善亚足联后第二天,强烈提示上皮的分辨率和修复。这种改善伴随着许多其他参数的分辨率在第三天。gydF4y2Ba
不确定为什么ALI / ARDS决议涉及纤维化在某些病人而不是其他人的。很少有动物模型允许这个修复过程的调查,特别是大量的初始伤害的一个起点。增加胶原蛋白沉积的证据从近端到远端细支气管被发现后48 h内酸管理,发展到明显的纤维化病灶数量增加了10天。这是可能的肺纤维化可以解释为什么倒电容值10天没有完全恢复正常,保持16%的增长相比的控制。尽管普遍肺泡中断观察2天,有一些回到认可肺泡结构第十天,减少肺泡碎片。虽然间质细胞结构仍出席第十天,这主要是由单核细胞和淋巴细胞。调查这些细胞类型的相关性(包括单核细胞和巨噬细胞的子集)将进一步研究利用这个模型的主要目标。gydF4y2Ba
总之,酸的急性损害阶段愿望模型特征和被描述为临床上最适用的模型可用(gydF4y2Ba32gydF4y2Ba]。虽然先前的研究利用这个模型经常减少(在我们看来)的可译性使用单边滴剂或小剂量的酸来限制损伤,通过认真的气道管理和恢复,我们可以开发一个模型,复制人类ALI / ARDS的主要特征,gydF4y2Ba即。gydF4y2Ba急性发作,双边损伤导致严重低氧血与呼吸倒电容增加,肺泡液体间隙,受损上皮损伤和屏障通透性,修复涉及纤维化。而受伤的程度很难与人类的情况下,水平低氧血期间观察到的类似于临床ALI / ARDS,和其他参数确定(BALF蛋白质和肺湿/干重比)相同或更大规模的“实质性/致命”阿里其他模型(gydF4y2Ba如。gydF4y2Ba盲肠的结扎和穿刺gydF4y2Ba33gydF4y2Ba),油酸(gydF4y2Ba34gydF4y2Ba和ventilator-induced肺损伤gydF4y2Ba12gydF4y2Ba])。我们相信,这种动物模型提供了一个强大的转化平台,真正的临床相关情况概括人类ALI / ARDS的疾病,严重程度和时间进程。这样一个模型应该允许我们更好地研究病理过程,临床适用的影响二次侮辱和潜在的治疗干预措施,特别是重点解决和维修。gydF4y2Ba
脚注gydF4y2Ba
社论评论看gydF4y2Ba1062页gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
可以从本文的补充材料gydF4y2Bawww.www.qdcxjkg.comgydF4y2Ba
支持声明gydF4y2Ba
这项工作是支持的威康信托基金会(授予081208年和092851年)。gydF4y2Ba
感兴趣的语句gydF4y2Ba
没有宣布。gydF4y2Ba
- 收到了gydF4y2Ba2011年6月2日。gydF4y2Ba
- 接受gydF4y2Ba2011年9月23日。gydF4y2Ba
- ©2012人队gydF4y2Ba
引用gydF4y2Ba
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