摘要G.ydF4y2Ba
特发性肺纤维化的发病机制可能是细胞因子/趋化因子与生长因子相互作用的结果。肾素-血管紧张素(Ang)系统参与,尽管它的促纤维化作用归因于Ang II。然而,最近的研究表明肾素通过一种特定的受体与纤维形成有关。G.ydF4y2Ba
本研究检测肾素和肾素受体在正常和IPF肺和成纤维细胞中的表达。用肾素刺激人肺成纤维细胞或转染肾素小干扰RNA (siRNA),分析转化生长因子(TGF)-β1和α-1- I型胶原的表达。G.ydF4y2Ba
正常的肺和肺成纤维细胞表达肾素,在IPF肺和成纤维细胞中强烈地升高(〜10倍; P <0.05)。免疫细胞化学显示IPF成纤维细胞中的肾脏染色。肾素刺激的肺成纤维细胞显示出TGF-β1表达的增加(平均值±G.ydF4y2BasdG.ydF4y2Ba1.8×10G.ydF4y2Ba3.G.ydF4y2Ba±0.2×10G.ydF4y2Ba3.G.ydF4y2Ba与G.ydF4y2Ba1.2×10G.ydF4y2Ba3.G.ydF4y2Ba±0.3×10G.ydF4y2Ba3.G.ydF4y2Ba每18S核糖体RNA的mRNA拷贝数;P <0.01)、胶原蛋白(5.93×10G.ydF4y2Ba2G.ydF4y2Ba±0.66×10G.ydF4y2Ba2G.ydF4y2Ba与G.ydF4y2Ba3.28×10G.ydF4y2Ba2G.ydF4y2Ba±0.5×10G.ydF4y2Ba2G.ydF4y2Ba;p<0.01),而用siRNA抑制肾素表达则引起这两种分子的强烈减少。这些作用与Ang II无关,因为氯沙坦和卡托普利都不能降低这些作用。肾素降低基质金属蛋白酶-1表达,诱导TGF-β1活化(163±34)G.ydF4y2Ba与G.ydF4y2Ba110±15 pg活性TGF-β1 / mg总蛋白)。G.ydF4y2Ba
这些发现突出了肾素作为Ang ii非依赖性促纤维化因子在肺纤维化中的可能作用。G.ydF4y2Ba
特发性肺纤维化(Idiopathic pulmonary fibrosis, IPF)是一种进行性的毁灭性疾病,其特征是成纤维细胞/肌成纤维细胞增多和细胞外基质过度积聚,导致肺结构进行性和严重扭曲[G.ydF4y2Ba1G.ydF4y2Ba那G.ydF4y2Ba2G.ydF4y2Ba].G.ydF4y2Ba
尽管许多研究在人类疾病和实验模型进行的分子机制背后的肺纤维化仍不明朗。转化-β似乎发挥了重要作用纤维化,成纤维细胞诱导对肌成纤维细胞分化和增加胶原表达[生长因子(TGF)G.ydF4y2Ba3.G.ydF4y2Ba那G.ydF4y2Ba4.G.ydF4y2Ba].然而,肺纤维化反应可能是生长因子、细胞因子和趋化因子之间复杂相互作用的最终结果[G.ydF4y2Ba5.G.ydF4y2Ba那G.ydF4y2Ba6.G.ydF4y2Ba].G.ydF4y2Ba
肾素是一种蛋白酶,与其他天冬氨酸蛋白酶不同,它只有一种已知的底物,血管紧张素原,它被肾素裂解形成血管紧张素(Ang) I [G.ydF4y2Ba7.G.ydF4y2Ba].然后,Ang转化酶(ACE)将Ang I转化为Ang II。肾素- ang系统对控制血压和体液平衡至关重要。重要的是,局部自分泌/旁分泌肾素- ang系统的存在已被证实,它在许多组织中具有生理活性[G.ydF4y2Ba8.G.ydF4y2Ba].G.ydF4y2Ba
包括肺在内的不同器官的研究表明,肾素- Ang系统在纤维形成中发挥重要作用,尽管这种作用主要是通过Ang type 1 (AT1)受体Ang II的作用[G.ydF4y2Ba9.G.ydF4y2Ba-G.ydF4y2Ba12G.ydF4y2Ba].G.ydF4y2Ba
然而,最近的研究表明,肾素可以直接诱导人和大鼠系膜细胞中TGF-β1的显著剂量和时间依赖性增加,从而导致各种细胞外基质成分的增加[G.ydF4y2Ba13G.ydF4y2Ba].重要的是,系膜细胞中肾素/肾素前受体的激活通过Ang ii独立机制诱导TGF-β的合成。G.ydF4y2Ba
到目前为止,还没有关于肾素在肺中的表达和活性的研究。我们的研究目的是检测肾素和肾素受体在正常和IPF肺和成纤维细胞的表达,并评估肾素对不同成纤维细胞活性的影响。我们的结果显示肾素在IPF肺和成纤维细胞中上调,并增加胶原合成和TGF-β表达。G.ydF4y2Ba
方法G.ydF4y2Ba
材料G.ydF4y2Ba
肾素、细胞外信号调节激酶(ERK)1/2、磷酸化ERK1/2、β-微管蛋白、平滑肌α-肌动蛋白(αSMA)和(前)肾素受体的抗体均来自Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)。过氧化物酶偶联二抗购自Invitrogen公司(Life Technologies, Grand Island, NY, USA)。卡托普利、氯沙坦、放射免疫沉淀(RIPA)缓冲液和蛋白酶抑制剂鸡尾酒取自Biorad (Hercules, CA, USA),磷酸酶抑制剂取自Sigma (St Louis, MO, USA)。重组人肾素原从开曼化学公司(Ann Arbor, MI, USA)获得。G.ydF4y2Ba
细胞培养G.ydF4y2Ba
如前所述,来自IPF (n=8)和对照肺(n=4)的原代人成纤维细胞[G.ydF4y2Ba14G.ydF4y2Ba].成纤维细胞(第5-8代)在37℃5% CO下培养G.ydF4y2Ba2G.ydF4y2Ba/95%空气在25厘米G.ydF4y2Ba2G.ydF4y2Ba含含含10%胎牛血清的火腿F-12培养基,100 U·mLG.ydF4y2Ba-1G.ydF4y2Ba青霉素,100μg·mL的G.ydF4y2Ba-1G.ydF4y2Ba链霉素和2.5 mg·mLG.ydF4y2Ba-1G.ydF4y2Ba两性霉素BG.ydF4y2Ba
Western印迹G.ydF4y2Ba
达到80%汇合的细胞在无血清培养基中培养。条件培养基回收,浓缩25倍,并在列与3000-沓分子量极限透析(3000 YM; Millipore公司,Billerica的,MA,USA)。在本蛋白酶抑制剂4-(2-氨基乙基)benzenesulfonylfluoride盐酸盐,EDTA,苯丁抑制素,E-64的进行所有的程序,亮抑蛋白酶肽和抑蛋白酶肽(Millipore)上。对于细胞内蛋白质的提取,将细胞在RIPA缓冲液含有蛋白酶抑制剂混合物和磷酸酶抑制剂裂解。8微克蛋白上7-12%十二烷基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)凝胶,然后通过免疫印迹运行。每种抗体的条件依照制造商的说明书进行。蛋白质浓度通过Bradford测定法(Biorad公司)进行测定。G.ydF4y2Ba
明胶zymographyG.ydF4y2Ba
SDS-PAGE凝胶含明胶(1 mg·mLG.ydF4y2Ba-1G.ydF4y2Ba)被用来识别与溶明胶活性存在的蛋白质在无血清条件培养基来自人肺成纤维细胞与血管紧张肽原刺激。每个泳道中装入0.3微克蛋白质[G.ydF4y2Ba15G.ydF4y2Ba].G.ydF4y2Ba
人重组肾素刺激G.ydF4y2Ba
正常肺成纤维细胞在25厘米的汇合密度处被镀上G.ydF4y2Ba2G.ydF4y2Ba在无血清培养基中培养24小时。然后将培养基交换为含有10 nM人重组肾素的无血清培养基,再培养成纤维细胞3小时。用Trizol™(Life Technologies)提取总RNA,细胞上清在-70℃冷冻直到使用。在平行实验中,在加入肾素前1小时,用氯沙坦或卡托普利浓度为10 nM的预培养成纤维细胞。为了评价肾素受体的作用,在一些实验中,纤维母细胞在37°C下用多克隆抗肾素抗体(16 nM;Santa Cruz抗体sc67390)。G.ydF4y2Ba
ELISAG.ydF4y2Ba
在3 μg条件培养基中使用商品化的ELISA技术,根据制造商说明(Emax;计划,麦迪逊,WI,美国)。G.ydF4y2Ba
免疫细胞化学G.ydF4y2Ba
成纤维细胞(1×10G.ydF4y2Ba4.G.ydF4y2Ba无血清培养系统)在盖玻片上孵化24 h。成纤维细胞与acetone-methanol固定在-20°C(1:1) 2分钟又孵化与反肾素单克隆抗体(英国Kidlington Serotec) 37°C 30分钟紧随其后的是生物素化的山羊anti-mouse免疫球蛋白G 20分钟(美国Biogenex,圣拉蒙,CA)。3-氨基-9-乙基咔唑(Biogenex)在醋酸缓冲液中含0.05% HG.ydF4y2Ba2G.ydF4y2BaO.G.ydF4y2Ba2G.ydF4y2Ba用作衬底。细胞核用苏木精反染。使用1×81显微镜(Olympus, Tokyo, Japan)观察封面,使用Evolution MP相机(Media Cybernetics Inc., Bethesda, MD, USA)捕捉图像,并使用Photoshop (Adobe Systems Inc., San Jose, CA, USA)处理。图像分析使用Image Pro-Plus 4.5 (Media Cybernetics Inc.);量化以像素平均密度(pmd)表示。G.ydF4y2Ba
RT-PCR和实时定量PCR扩增G.ydF4y2Ba
根据制造商的说明,使用Trizol™提取总RNA和蛋白质。使用Advantage RT-for-PCR试剂盒(Clontech, Palo Alto, CA, USA)逆转录1 μg总RNA。采用i-Cycler iQ检测系统(Biorad)进行实时定量PCR扩增[G.ydF4y2Ba14G.ydF4y2Ba].PCR进行cDNA工作在25 -μL反应混合物体积包含3μL cDNA、PCR反应混合液20×Taqman探针TGF -β1、αSMA,α1 I型胶原蛋白和肾素,1μL 20×Taqman 6-carboxyfluorescein-minor槽粘合剂探针(美国应用生物系统公司,培育城市,CA)。对于肾素受体,我们使用Primer-BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)从序列GI:15011917中设计的引物。序列为:sense 5 ' -CATTGTCCATGGGCTTCTCT-3 ';和反义5“-GCATTCTCCAAAGGGTACGA-3”。对于实时PCR,我们使用SYBR®Green PCR Master Mix (Applied Biosystems)和每个引物10 pmol。通过1×10的拷贝数系列稀释度确定每个PCR产物的动态范围G.ydF4y2Ba10G.ydF4y2Ba1×10G.ydF4y2Ba2G.ydF4y2Ba;所有pcr检测均为3个重复。结果以18S核糖体RNA (rRNA)的拷贝数(4352930E;应用生物系统公司)。G.ydF4y2Ba
小干扰RNAG.ydF4y2Ba
小干扰RNA(siRNA)如先前所述设计的[G.ydF4y2Ba16G.ydF4y2Ba那G.ydF4y2Ba17G.ydF4y2Ba].使用Clontech RNAi Designer设计肾素siRNA寡核苷酸序列(G.ydF4y2Bahttp://bioinfo.clontech.com/rnaidesigner/G.ydF4y2Ba),并用BLAST验证其同源性。合成了两个互补的寡核苷酸(Applied Biosystems),并根据制造商的说明克隆到psi雷恩- retroq - tet载体(BD Clontech, High Wood, CA, USA)。G.ydF4y2Ba
包装细胞转染G.ydF4y2Ba
将迁移Pt67细胞(Clontech)接种到80%汇合(1×10)的六孔板中G.ydF4y2Ba6.G.ydF4y2Ba细胞·好G.ydF4y2Ba-1G.ydF4y2Ba)转染前24小时;用4 μg DNA和10 μL lipofectamine 2000进行转染。将PT67细胞按1:20的比例稀释,转染24 h后进行电泳。转染后的PT67细胞用2 μg·mL培养10 dG.ydF4y2Ba-1G.ydF4y2Ba嘌呤霉素(Clontech公司),和大的,健康的分离集落并转移至单独的孔和板。24小时后,更换培养基,并确定感染的效率,小型蜂窝亚群用抗生素治疗。使用被感染的细胞进行实验,或者选择尽快,而不是之前24小时后感染。定量PCR来验证肾素表达的抑制。含有病毒颗粒携带siRNA或空载体(LUC)的siRNA(20μL),过滤介质加入到成纤维细胞在2mL低葡萄糖Dulbecco改良的Eagle氏感染平台。将受感染的成纤维细胞以1:10的比例24小时后稀释,然后嘌呤霉素加入到0.5微克·mL的终浓度G.ydF4y2Ba-1G.ydF4y2Ba.2周后,大的健康菌落被分离并转移到单独的孔和板上。G.ydF4y2Ba
胶原蛋白测量G.ydF4y2Ba
使用Sircol胶原测定法(Biocolor Ltd, Carrickfergus, UK)在条件培养基中定量胶原蛋白[G.ydF4y2Ba18G.ydF4y2Ba].对于这些实验,将1mL天生素红染料加入100μL调理培养基中并在室温下混合30分钟。以10,000×离心后G.ydF4y2BaG.G.ydF4y2Ba用1 mL 0.5 M NaOH溶解胶原蛋白结合染料10 min,用分光光度法(Nanodrop 1000;Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)。G.ydF4y2Ba
统计分析G.ydF4y2Ba
数据以平均值±表示G.ydF4y2BasdG.ydF4y2Ba.使用未配对的T检验或通过单向ANOVA进行分析数据,然后是Dunnett的测试。使用Spearman的测试进行了相关性分析。p值<0.05被认为是统计学上的显着性。G.ydF4y2Ba
结果G.ydF4y2Ba
肾素在IPF肺和IPF成纤维细胞中表达增加G.ydF4y2Ba
8株IPF和4株正常人肺成纤维细胞亚融合培养,实时荧光定量PCR检测肾素表达水平。见G.ydF4y2Ba图1AG.ydF4y2Ba,来自IPF肺的成纤维细胞的肾素mRNA基础水平比正常肺成纤维细胞增加了10倍(4.7×10G.ydF4y2Ba6.G.ydF4y2Ba±1.2×10G.ydF4y2Ba6.G.ydF4y2Ba与G.ydF4y2Ba0.4×10G.ydF4y2Ba6.G.ydF4y2Ba±0.1×10G.ydF4y2Ba6.G.ydF4y2Ba肾素每18S rRNA基因mRNA拷贝;P <0.01)。无差异肾素受体的表达被发现(G.ydF4y2Ba图1 bG.ydF4y2Ba),尽管在蛋白水平上观察到IPF成纤维细胞有更高的趋势(G.ydF4y2Ba图1 cG.ydF4y2Ba和d)。通过免疫细胞化学在蛋白质水平证实了IPF成纤维细胞的肾素表达增加。如举例说明的那样G.ydF4y2Ba图2G.ydF4y2Ba,IPF成纤维细胞显示出血管紧张肽原的强烈的细胞质染色其似乎是位于内质网和高尔基体。定量分析证实肾素在IPF成纤维细胞染色与正常肺成纤维细胞(159±4.8相比显著增加G.ydF4y2Ba与G.ydF4y2Ba125±8.4 PMD;G.ydF4y2Ba图2 eG.ydF4y2Ba).G.ydF4y2Ba
肾素及肾素受体在不同成纤维细胞中的表达。将成纤维细胞培养至早期融合,实时荧光定量PCR检测肾素及其受体的表达。a)肾素在来自间质性肺纤维化(IPF)患者的成纤维细胞中过表达(n=8),而来自人类对照肺的成纤维细胞(n=4)。b)肾素受体表达无差异。c)从正常和IPF肺中制备的细胞裂解液通过Western blotting分析肾素受体表达,如方法部分所述。d)蛋白水平剂量分析无显著差异。核糖体RNA:核糖体RNA。**:P <0.01。G.ydF4y2Ba
肾素免疫细胞化学染色。将a、b)间质性肺纤维化(IPF)和c)对照肺的成纤维细胞镀在盖玻片上,并用抗人肾素单克隆抗体孵育。比例尺:a) 20 μm;b) 5μm;5μm c)。IPF成纤维细胞显示强烈的胞浆标记,如图b),而人类正常肺成纤维细胞显示弱染色。d)阴性对照,用非免疫血清替代一抗(标尺=20 μm)。e)肾素标记定量。这张图展示了在四种不同菌株中进行的实验。Pmd:像素平均密度。 **: p<0.01.
同样,与正常肺(n=5)相比,IPF肺(n=7)中肾素mRNA表达水平显著升高(17.5×10G.ydF4y2Ba5.G.ydF4y2Ba±13.8×10G.ydF4y2Ba5.G.ydF4y2Ba与G.ydF4y2Ba1.9×10G.ydF4y2Ba5.G.ydF4y2Ba±0.6×10G.ydF4y2Ba5.G.ydF4y2Ba每18S rRNA的mRNA拷贝数;p < 0.05;G.ydF4y2Ba图3G.ydF4y2Ba).此外,肾素受体水平显示出增加的趋势,尽管结果没有达到统计学意义(185.5×10G.ydF4y2Ba5.G.ydF4y2Ba±193.5×10G.ydF4y2Ba5.G.ydF4y2Ba与G.ydF4y2Ba20.7×10G.ydF4y2Ba5.G.ydF4y2Ba±8×10G.ydF4y2Ba5.G.ydF4y2Ba肾素受体mRNA每18s rRNA拷贝;p = 0.06;G.ydF4y2Ba图3 bG.ydF4y2Ba).有趣的是,肾素和受体的表达与受体之间存在正相关;因此,肾素表达较高的四个患者也具有更高的受体表达(Spearman R = 0.65,P <0.05)。G.ydF4y2Ba
肾素及肾素受体在间质性肺纤维化(IPF)和正常肺中的基因表达。采用实时荧光定量PCR技术检测正常对照组(n=5)和IPF患者(n=7)肺组织中肾素及其受体的mRNA表达谱。a)肾素在IPF患者肺组织中过表达(p<0.01)。b)肾素受体在IPF肺中呈非显著性增高趋势(p=0.06)。核糖体RNA:核糖体RNA。**:P <0.01。G.ydF4y2Ba
肾素通过Ang ii独立机制上调TGF-β1和胶原的表达G.ydF4y2Ba
为了评估肾素的推定型抗衡学作用,使用重组肾素刺激两种不同的正常人肺成纤维细胞菌株,并通过实时PCR测量TGF-β1和α-1型I胶原的表达。如图所示G.ydF4y2Ba图4G.ydF4y2Ba,肾素显著提高两种TGF-β1的水平(1.8×10G.ydF4y2Ba3.G.ydF4y2Ba±0.2×10G.ydF4y2Ba3.G.ydF4y2Ba与G.ydF4y2Ba1.2×10G.ydF4y2Ba3.G.ydF4y2Ba±0.3×10G.ydF4y2Ba3.G.ydF4y2BaTGF-β1 mRNA拷贝每18S rRNA;P <0.01;G.ydF4y2Ba图4G.ydF4y2Ba)和胶原蛋白(5.93×10G.ydF4y2Ba2G.ydF4y2Ba±0.66×10G.ydF4y2Ba2G.ydF4y2Ba与G.ydF4y2Ba3.28×10G.ydF4y2Ba2G.ydF4y2Ba±0.5×10G.ydF4y2Ba2G.ydF4y2Baα-1型I型胶原mRNA每18秒拷贝拷贝;P <0.01;G.ydF4y2Ba图4 bG.ydF4y2Ba).用特异性抗肾素受体抗体预处理细胞可消除肾素诱导的胶原蛋白增加(G.ydF4y2Ba图4摄氏度G.ydF4y2Ba).这种作用与Ang II无关,因为AT1受体的特异性抑制剂氯沙坦和ACE抑制剂卡托普利并没有降低肾素诱导的TGF-β1或胶原的过表达。当Angⅱ刺激成纤维细胞时,TGF-β1和α-1型胶原的表达水平也增加(在线补充图S1A和B);然而,正如预期的那样,氯沙坦消除了这一增量。肾素刺激也增加了αSMA的表达(G.ydF4y2Ba图4 dG.ydF4y2Ba),但该结果并未在蛋白质水平上得到证实(G.ydF4y2Ba图4 eG.ydF4y2Ba).G.ydF4y2Ba
肾素上调转化生长因子(TGF)-β1和α-1 I型胶原(col I)基因表达G.ydF4y2Ba.G.ydF4y2Ba人肺成纤维细胞的刺激用10nM重组肾素显示出一个)一个显著增加)TGF-β1和bα-1栏I.治疗氯沙坦(LOS)和卡托普利(CAP)没有逆转这种效果。c)中胶原表达的增加阻断特异性抗肾素受体抗体。d)平滑肌α肌动蛋白(αSMA)mRNA水平通过定量RT-PCR分析和e)通过Western印迹分析蛋白水平确定的。结果代表与不同的成纤维细胞株两个独立的实验,每个重复进行三次的平均值。核糖体RNA:核糖体RNA。*:P <0.05;**:P <0.01。G.ydF4y2Ba
肾素降低基质金属蛋白酶1的表达,但对基质金属蛋白酶2无影响G.ydF4y2Ba
用肾素处理人肺成纤维细胞,研究了基质金属蛋白酶(MMP)-1和MMP-2的表达,两种与IPF的发病有关的两种酶[G.ydF4y2Ba19G.ydF4y2Ba].用肾素刺激导致MMP-1表达的显着降低(G.ydF4y2Ba图5G.ydF4y2Ba),而它对MMP-2表达没有影响(G.ydF4y2Ba图5 bG.ydF4y2Ba)或活动(G.ydF4y2Ba图5度G.ydF4y2Ba).G.ydF4y2Ba
肾素下调基质金属蛋白酶(MMP)-1的表达,但对MMP-2无影响。a)经10 nM重组肾素刺激的人肺成纤维细胞MMP-1表达明显降低。b) MMP-2基因表达未发生改变。c)酶谱分析MMP-2和MMP-2明胶溶解活性带未见变化。结果代表了两个独立的实验,不同的成纤维细胞菌株,每个执行三次重复。核糖体RNA:核糖体RNA;帽子:卡托普利;洛杉矶:洛沙坦。**:P <0.01。G.ydF4y2Ba
有人认为肾素的作用是由ERK1/2介导的[G.ydF4y2Ba13G.ydF4y2Ba].为了研究肾素刺激人肺成纤维细胞是否激活ERK1/2信号通路,我们用Western blot检测细胞提取物中ERK1/2总量和磷酸化水平。见G.ydF4y2Ba图6G.ydF4y2BaB和B,用肾素治疗成纤维细胞强烈刺激ERK1 / 2的磷酸化。ERK1 / 2激活的时间谱表明,增加了20-30分钟的高原,此后逐渐下降。G.ydF4y2Ba
肾素激活细胞外信号调节激酶(ERK)1/2磷酸化,增加活性转化生长因子(TGF)-β1G.ydF4y2Ba.G.ydF4y2Ba人肺成纤维细胞用10nM重组肾素刺激。一个)的总西方印迹对应和b)密度计分析和磷酸化的ERK1 / 2(磷酸化ERK1 / 2),这表明肾素诱导ERK1 / 2磷酸化。c)以活性型TGF-β1甲显著增加观察到,不是由卡托普利(CAP)或氯沙坦(LOS)颠倒的效果。结果代表与不同的成纤维细胞株两个独立的实验,每个重复进行三次的平均值。*:P <0.05;**:P <0.01。G.ydF4y2Ba
肾素通过Ang ii独立机制诱导TGF-β1活化G.ydF4y2Ba
用肾素刺激两种正常人肺成纤维细胞,用ELISA法测定条件培养基中活性TGF-β1的水平。如图所示G.ydF4y2Ba图6 cG.ydF4y2Ba,肾素刺激显著增加活性TGF-β1的水平,不受ACE抑制剂或AT1受体阻滞剂的影响。G.ydF4y2Ba
沉默肾素诱导TGF-β和胶原蛋白表达明显减少G.ydF4y2Ba
为了确定肾素缺失对成纤维细胞行为的影响,我们将人正常肺成纤维细胞瞬时转染肾素siRNA。用siRNA,我们实现了约75%的肾素沉默,通过PCR (G.ydF4y2Ba图7G.ydF4y2Ba);Western blotting条件培养基的蛋白水平证实了这种下降(G.ydF4y2Ba图7 bG.ydF4y2Ba).Real-time PCR检测肾素siRNA对TGF-β、胶原蛋白和αSMA表达的影响。如图所示G.ydF4y2Ba图7C.G.ydF4y2Ba,与正常成纤维细胞和用空Luc结构包装的病毒处理的成纤维细胞中观察到的水平相比,沉默肾素导致TGF-β1的表达显著下降(对照1.84×10)G.ydF4y2Ba2G.ydF4y2Ba±0.48×10G.ydF4y2Ba2G.ydF4y2Ba,吕克·1.26×10G.ydF4y2Ba2G.ydF4y2Ba±0.42×10G.ydF4y2Ba2G.ydF4y2Ba肾素siRNA 0.42×10G.ydF4y2Ba2G.ydF4y2Ba±0.24×10G.ydF4y2Ba2G.ydF4y2BaTGF-β1 mRNA拷贝每18S rRNA;P <0.01)。G.ydF4y2Ba
小干扰RNA (siRNA)沉默肾素可导致转化生长因子(TGF)-β1的下调。用含肾素siRNA病毒或空载体(Luc)处理人肺成纤维细胞。siRNA在a) RNA和b)蛋白质水平上显著降低了肾素的表达。c)肾素siRNA处理的细胞TGF-β1明显降低。结果代表了两个独立的实验,用一个转染成纤维细胞菌株进行了三次重复。rRNA基因:核糖体RNA。**:P <0.01。G.ydF4y2Ba
mRNA上的胶原蛋白表达也显著降低(对照5.2×10)G.ydF4y2Ba2G.ydF4y2Ba±0.6×10G.ydF4y2Ba2G.ydF4y2Ba,吕克·4.7×10G.ydF4y2Ba2G.ydF4y2Ba±0.11×10G.ydF4y2Ba2G.ydF4y2Ba肾素siRNA 0.74×10G.ydF4y2Ba2G.ydF4y2Ba±0.4×10G.ydF4y2Ba2G.ydF4y2Baα-1 type I collagen mRNA per 18S rRNA;P <0.01)和蛋白水平,其中抑制肾素表达可使成纤维细胞条件培养基中分泌的胶原减少50% (G.ydF4y2Ba图8G.ydF4y2Bab). αSMA表达无变化(数据未显示)。G.ydF4y2Ba
肾素下调对胶原生成的影响。用肾素小干扰RNA (siRNA)处理人肺成纤维细胞,a) real-time PCR检测α-1 I型胶原(col I)基因表达,b)条件培养基中胶原蛋白水平采用sicol胶原测定法(bioccolour Ltd, Carrickfergus, UK)。肾素下调导致胶原合成明显减少。结果代表了两个独立的实验,用一个转染成纤维细胞菌株进行了三次重复。核糖体RNA:核糖体RNA;卢克:空向量。**:P <0.01。G.ydF4y2Ba
讨论G.ydF4y2Ba
IPF和其他纤维化性肺疾病的发展涉及成纤维细胞的激活,它们向肌成纤维细胞分化,以及细胞外基质蛋白的过度生产,随后出现异常的结构重塑。IPF是最具侵袭性的间质性肺疾病,其发病机制被认为与上皮细胞与成纤维细胞之间的交流失调有关,并由多种细胞因子、趋化因子和生长因子之间复杂的相互作用介导,其中以TGF-β为核心。在此背景下,一些研究表明肾素- Ang系统在肺纤维化发生中起作用,但其促纤维化作用主要归因于Ang II [G.ydF4y2Ba20.G.ydF4y2Ba].G.ydF4y2Ba
我们的结果首次证明,人肺中表达肾素,并且在IPF肺组织中表达强烈上调。同样,与正常人肺成纤维细胞相比,IPF成纤维细胞肾素表达增加了10倍,并显示出强烈的胞浆免疫反应肾素信号。然而,我们的结果G.ydF4y2Ba在体外G.ydF4y2Ba实验支持肾素的促纤维化作用,因为用肾素刺激人肺成纤维细胞可诱导TGF-β的过表达,TGF-β是一种关键的成纤维因子,胶原是纤维化瘢痕的主要成分。我们的结果还表明,在肾素释放的刺激下,正常的人成纤维细胞的活性TGF-β1增加。有趣的是,肾素也引起了MMP-1的减少,当用TGF-β治疗成纤维细胞时也可以观察到这种效果[G.ydF4y2Ba21G.ydF4y2Ba].此外,使用siRNA下调肾素表达导致TGF-β1和胶原的基础表达显著降低;然而,这并不影响基础αSMA的表达。在系膜细胞中也描述了类似的作用,发现用siRNA靶向肾素受体可以消除肾素诱导的TGF-β1上调,表明这种受体可以直接起作用[G.ydF4y2Ba13G.ydF4y2Ba].G.ydF4y2Ba
我们肾素和肾素 - 血管紧张素系统的认识有了很大发展,在过去的几年里。因此,肾素 - 血管紧张素系统,该系统在传统上被视为循环系统具体而言,还可以局部地起作用,并且最近的证据表明,一个完整的,功能性肾素 - 血管紧张素系统的细胞[内是否存在G.ydF4y2Ba22G.ydF4y2Ba].然而,该系统的生理作用及其在组织病理学中的意义仍有待确定。G.ydF4y2Ba
最近,鉴定特定的350个氨基酸蛋白(Pro-)肾素受体,增加了系统的复杂性。虽然肾素以前仅作为负责血管紧张素切割形成血管生成的酶以形成Ang I,但越来越多的证据表明肾素和亲肾素与受体结合到受体触发细胞内信号传导,反过来改变基因表达[G.ydF4y2Ba23G.ydF4y2Ba].因此,肾素表现出新的受体介导的作用,独立于Ang II,而Ang II似乎是由丝裂原活化蛋白激酶途径的细胞外ERK1/2介导的[G.ydF4y2Ba24G.ydF4y2Ba-G.ydF4y2Ba26G.ydF4y2Ba].在此背景下,我们的研究结果还表明,肾素刺激可诱导人肺成纤维细胞中ERK1/2的大量激活,证实了该通路在促纤维化基因(如编码TGF-β1和胶原蛋白的基因)上调中的作用。重要的是,最近的证据表明,(前)肾素受体结合肾素及其非活性前体前肾素,它们的结合触发细胞内信号,上调纤维原介质的表达[G.ydF4y2Ba27G.ydF4y2Ba].在我们的研究中,我们还测量了肺和成纤维细胞中肾素受体的水平,尽管我们观察到IPF肺和成纤维细胞中增加表达的趋势,结果没有达到统计学差异。然而,有趣的观察是肾素和受体表达之间的IPF肺部的强烈相关性。G.ydF4y2Ba
以往的研究表明肾素可能具有促进纤维化的作用G.ydF4y2Ba在活的有机体内G.ydF4y2Ba,正如在治疗高血压的Goldblatt大鼠的夹肾实验中所证明的那样[G.ydF4y2Ba28G.ydF4y2Ba].然而,对包括肺在内的其他器官的研究却很少。与其他组织一样,Ang II通常被认为是肾素- Ang系统在肺修复和重塑中的主要效应者。因此,已经证明Ang II可引起肺泡上皮细胞的凋亡,并且是人肺成纤维细胞产生前胶原的有效诱导物G.ydF4y2BaviaG.ydF4y2Ba激活1型受体,至少在一定程度上,G.ydF4y2BaviaG.ydF4y2BaTGF-β的自分泌作用[G.ydF4y2Ba29G.ydF4y2Ba-G.ydF4y2Ba31G.ydF4y2Ba].然而,我们的研究结果表明肾素对人肺成纤维细胞有直接影响,因为氯沙坦抑制Ang II或卡托普利抑制ACE对肾素诱导的纤维化介质TGF-β1和胶原的上调作用很小或没有影响。这些结果清楚地支持了肺间充质细胞中,肾素能够通过Ang ii独立的途径诱导前纤维化分子的上调。G.ydF4y2Ba
在最近的一项研究中,从健康肾脏分离的原代人系膜细胞被用来评估肾素和肾素前触发的基因表达谱。研究表明,两者都有一个相似的转录特征,独立于Ang的产生。重要的是,肾素和肾素原诱导的基因表达变化与器官损伤和纤维化的发展是一致的,主要通过TGF-β机制[G.ydF4y2Ba32G.ydF4y2Ba].G.ydF4y2Ba
我们的研究结果和上述关于肾纤维化的研究表明,肾素本身可能在细胞外基质积累中发挥重要作用,并提示抑制(前)肾素/受体系统可能会减少纤维胶原和纤维化因子(如TGF-β)的释放。在此背景下,最近证实阿利克仁,一种口服有效的直接肾素抑制剂,能显著预防内皮型一氧化氮合酶缺陷小鼠袖带损伤引起的心肌肥厚、炎症、纤维化和肾小球硬化[G.ydF4y2Ba33G.ydF4y2Ba].在我们的研究中,siRNA靶向沉默人肺成纤维细胞的肾素基因,可以改善胶原蛋白的表达和TGF-β1的表达。G.ydF4y2Ba
总之,我们的研究结果突出了肾素可能成为肺纤维化的Ang II无关的思考因子。IPF是迄今为止最具侵略性的间质性肺病,大多数患者在几年内从这种疾病中死亡。虽然致病机制不完全理解,但该疾病可能是由于各种易感性和环境触发器的组合而产生的各种基因的异常表达和调节的结果。我们的研究结果表明,肾素可以是参与该疾病发病机制的介质之一。G.ydF4y2Ba
脚注G.ydF4y2Ba
这篇文章有补充资料可从G.ydF4y2Bawww.www.qdcxjkg.com.G.ydF4y2Ba
支持声明G.ydF4y2Ba
这项工作是由Consejo Nacional de Ciencia YTecnologíd授予III 89442的支持部分支持。G.ydF4y2Ba
感兴趣的语句G.ydF4y2Ba
没有宣布。G.ydF4y2Ba
- 收到了G.ydF4y2Ba2010年8月13日。G.ydF4y2Ba
- 接受G.ydF4y2Ba2011年5月24日。G.ydF4y2Ba
- ©2012人队G.ydF4y2Ba
参考资料G.ydF4y2Ba
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