文摘
Upregulation干扰素(IFN) -γ和基因的科学家趋化因子受体(CXCR) 3表达,两个关键分子肉质的炎症和肉芽肿形成,直接控制的辅助(Th) 1转录因子T-bet (T-box,表达了在t细胞)。不过,没有信息T-bet表达结节病或其与“sarcoidosis-associated”基因的关系。
因此,我们调查T-bet mRNA的表达,同时,一系列的基因被认为与结节病发病机理。记录被确定在支气管肺泡灌洗(BAL)从62个结节病病人和25个对照组细胞定量rt - pcr;T-bet蛋白质局部免疫组织化学。
病人的BAL细胞表达更高的mRNA T-bet水平比控件(意味着±sd褶皱变化3.64±1.72;p = 0.00006)。T-bet mRNA表达没有不同临床表型胸片影像质量综合评估阶段,存在/缺乏洛夫格伦综合征、肺外疾病/肺参与或进展/汇款(p > 0.05)。IFN-γT-bet mRNA表达与表现,CC趋化因子配体5,科学家趋化因子配体(科学家)10,白介素(IL) / IL-15受体β2受体CXCR3和CXCR6 (p < 0.01)。T-bet蛋白质局部肺泡巨噬细胞和淋巴细胞,组织多核巨细胞,巨噬细胞和淋巴细胞。
在肺结节病,T-bet upregulation与IFN-γ表达的变化有关,受体CXCR3和趋化因子/参与结节病的发病机理,这表明一个角色T-bet Th1疾病,包括一些sarcoidosis-associated基因的调制。
肺结节病是一种炎症性疾病的特点是激活淋巴细胞和巨噬细胞的积累在肺部,导致肉芽肿的形成(1,2]。肉芽肿形成的一个关键作用是由干扰素(IFN) -γ[3)和辅助(Th) 1型细胞积累的肉质的肺,它表达趋化因子受体科学家趋化因子受体(CXCR) 3 (4]。有证据表明,CXCR3和IFN-γTh1转录因子的直接控制下,T-bet (T-box t细胞表达)5- - - - - -7]。此外,这个关键Th1转录因子,T-bet,指导Th1血统的承诺8]。虽然结节病是一种主要Th1免疫疾病(9,10],CXCR3和IFN-γ参与其发病机制,目前还没有信息的参与Th1转录因子T-bet障碍。
除了T-bet控制CXCR3和IFN-γ表达式,它也参与了众多的免疫系统基因的调控。相比的直接要求T-bet CXCR3和IFN-γ表达无论细胞类型,调节其他基因可能是依赖于细胞类型和程度的监管可能会有所不同(5]。例如,T-bet诱发适度激活白介素(IL) (2 r)β2受体(CD122)和CC趋化因子配体(CCL)分部3根据细胞类型(5]。T-bet之间的关系和其他趋化因子或受体的表达在不同的细胞类型/疾病也被报道,如CCL5从哮喘患者外周血11),CCR5和趋化因子受体CXCR4在子宫内膜t细胞(12),CCL5和科学家趋化因子配体(CXCL) 9实验新月形的肾小球肾炎(13]。然而,知识T-bet目标,即基因启动子在其功能性监管和相关监管机制,还远远没有完成。解决角色T-bet作为合理的监管机构在结节病的免疫介质,我们研究了其与细胞因子及其受体的关系,之前与结节病的发病机理。我们主要集中在这些“sarcoidosis-associated”基因趋化因子指导贩卖激活t细胞进入肺肉质的,比如CCL2, CCL5, CXCL9, CXCL10 CXCL11 [14- - - - - -19],趋化因子受体,CC趋化因子配体(CCR) 510]和CXCR6 [4优先激活淋巴细胞上表达。
首先,我们确定的表达T-bet在支气管肺泡灌洗(BAL)细胞获得25 62个结节病病人和对照组和寻找差异表达模式与不同的疾病表型患者亚组。其次,我们旨在解决的问题是否有证据支持的理论T-bet调制CXCR3和IFN-γ基因表达在肺结节进行相关性分析的mRNA表达谱BAL细胞。最后,我们研究了一系列sarcoidosis-associated T-bet与基因的关系,即:1)配体受体CXCR3 (CXCL9 CXCL10和CXCL11) [14- - - - - -17];2)趋化因子CCL2, CCL518,19];3)趋化因子受体CCR2, CCR5和CXCR64,10,20.,21];和4)β-chain IL-2R和IL-15R受体亚基(10,22]。在此,我们报告的T-bet upregulation结节病与一些sarcoid-associated分子及其关系。介绍了我们的一些数据之前(23]。
材料和方法
主题
根据标准协议[落下帷幕了2462年)患者肺结节病(胸片(CXR)阶段我n = 17;阶段II n = 33;阶段III n = 8;第四阶段n = 4)和25捷克裔的对照组。结节病的诊断是确定符合国际标准25]。因为影像学分期提供预后信息有限,没有疾病活动的信息,为了排除吸烟对基因表达的影响,我们进一步细分56不吸烟患者根据症状的持续时间进行评估:随访2年(缓解n = 23日进展持久性n = 26;在七个病人,2岁后数据无法获得);存在/缺乏洛夫格伦综合征(LS;n = 8/48);和BAL细胞(> 11% BAL患者淋巴细胞n = 45;≤11% BAL患者淋巴细胞n = 11;≥85% BAL患者巨噬细胞n = 11;< 85% BAL患者巨噬细胞n = 45)。引用值BAL细胞计数(≥85%的巨噬细胞,淋巴细胞≤11%,≤2.5%中性粒细胞和嗜酸性粒细胞≤1%)是基于我们自己的实验室和对应于Z值iegenhagenet al。(26]。进一步形成的子组根据器官参与(肺参与只有n = 37;肺外参与n = 19)。调查患者的临床和实验室特点,明白了表1。对照组由25个学科(17不吸烟者(九个男性和八个女性)和八个吸烟者(7个男性和一个女性);均值±sd年龄44.7±16.2岁)接受落下帷幕的临床研究为心因性咳嗽,咳嗽与gastro-oesophageal返流性疾病或肺高血压有关。在这一组,包括三个疑似肺恶性肿瘤患者;在影响叶洗胃了。都有正常BAL液细胞学、免疫学、微生物学和CD4 + / CD8 +比值。没有病人接受皮质类固醇治疗前落下帷幕。
所有患者把他们的知情同意使用落下帷幕,这是主要是为获得诊断评估,本研究的目的。当地伦理委员会深造大学和教师医院奥(奥,捷克)批准了这项研究。
BAL样品处理和RNA隔离
落下帷幕的细胞被离心分离液体如前所述[21]。从分不开的BAL细胞总RNA分离与mirVana microrna的工具包(美国Ambion、奥斯汀、TX)。RNA质量和数量使用2100生物分析仪测定RNA 6000纳米化验(美国安捷伦科技,帕洛阿尔托,CA)。执行反转录与翻转™RTase混合使用固定脱氧胸苷引物(ABgene,埃,英国)根据制造商的指示。
测量定量rt - pcr的mRNA表达谱
引物序列,探讨和研究基因的扩增子大小将上市表2。PCR反应是RotorGene3000系统上执行(Corbett研究,悉尼,澳大利亚)如前所述[27]。相对表达式是由一个二阶导数计算方法(RotorGene软件6.1.81;Corbett)的研究。互补脱氧核糖核酸RNA从人类普遍引用(美国Stratagene拉霍亚,CA)被用作校准器PSMB2作为参考基因(27]。表达水平的变化提出了均值±sd褶皱的变化相对表达相比,对照组(正常1.0)(28,29日]。
通过免疫组织化学方法测定细胞相关T-bet蛋白质
石蜡包埋的低温恒温器片transbronchial获得的肺组织活检(n = 5),胸腔镜手术(n = 3)和淋巴结通过免疫组织化学方法处理样品(n = 1)。微波抗原检索后,柠檬酸缓冲(pH值6.0),幻灯片与反孵化T-bet单克隆抗体(525803年克隆,稀释1:50;研发系统公司,明尼阿波利斯,美国),观想使用标准间接avidin-biotin辣根过氧化物酶的方法(想象+ System-HRP;Dako斯特鲁普、丹麦)。部分与苏木精复染色。T-bet染色与老鼠的免疫球蛋白G (Ig)同形像控制抗体(克隆DAK-GO1,稀释1:50;Dako)所有病例研究确认染色特异性。淋巴细胞表达的类型T-bet被subpopulation-specific抗体(CD3,克隆F7238;克隆L26 CD 20日;稀释1:50; Dako).
通过免疫细胞化学测定细胞相关T-bet蛋白质
T-bet蛋白质检测到acetone-chloroform固定cytocentrifuge BAL细胞制剂使用streptavidin-biotin /辣根过氧化物酶的方法使用一个anti-T-bet抗体(525803年克隆,稀释1:50;研发系统公司)和一个负控制鼠标IgG1(克隆DAK-GO1,稀释1:50;Dako)如前所述16]。
统计分析
信使rna表达的比较两组之间进行使用非参数Mann-Whitney u测验和克鲁斯卡尔-沃利斯检验三个或更多的团体。斯皮尔曼等级相关是用来评估T-bet和趋化因子受体信使rna表达之间的关系,细胞轮廓的BAL流体和结节病的临床过程。所有计算都是由软件SPSS 16.0(美国SPSS Inc .,芝加哥,IL)。一个假定值< 0.05被认为是重要的。
结果
T-bet mRNA表达谱和所选介质作为一个整体,在特定的肉质的临床表型
为了研究T-bet的信使rna表达水平,IFN-γ,IL-2R / IL-15RβCCL2, CCL5, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CCR2, CCR5, CXCR3和CXCR6结节病,相对平衡细胞信使rna表达水平测定在对照组,结节病病人和病人的子组。所有RNA样本病人和控制质量好(相对完整号码> 5)。
信使rna转录因子的表达谱T-bet作为一个整体和肉质的临床表型
的相对表达水平T-bet结节病病人高于对照组(意味着±sd褶皱变化3.64±1.72;p = 0.00006) (图1一个)。当我们比较T-bet表达吸烟和不吸烟(过度吸烟者和不吸烟者)患者和控制,我们观察到的趋势降低T-bet表达吸烟控制(p = 0.06)和吸烟比相应的不吸烟的患者(p = 0.12)控制和患者,分别为(图1 b)。因此,排除吸烟的影响,我们只比不吸烟患者细分的肉质的临床表型。
当T-bet表达水平的比较在特定CXR阶段(I, II, III和IV), T-bet表达式没有不同阶段:4.00±1.87,3.00±1.40,2.22±1.04,5.68±2.65,分别(p > 0.05) (图1 c)。当T-bet表达水平比较子组根据存在/缺乏LS(表型的特点是急性发作,发烧,结节性红斑,关节痛和双侧肺门淋巴结病),观察LS没有区别(2.68±1.22)和构造的病人(3.44±1.57;p > 0.05) (图1 d)。同样,当患者细分根据涉及的器官,患者T-bet表达式之间的区别只有肺参与(3.86±1.76)和那些也有肺外的参与(2.30±1.05)不显著(p > 0.05) (图1 e)。在分组根据疾病的患者随访时颁发新加坡莱佛士学院集团与结果后,我们没有观察到任何数量的差异T-bet成绩单(疾病缓解2.71±1.23,持续进步/结节病3.24±1.47;p > 0.05) (图1 f)。
根据细胞进一步患者亚组形成的落下帷幕。子组基于BAL巨噬细胞计数(截止巨噬细胞85%),BAL患者巨噬细胞在正常范围内表达低水平的T-bet(1.73±0.79)比< 85% BAL患者巨噬细胞(3.72±1.69,p = 0.05) (图1克)。在子组基于BAL淋巴细胞计数(截止11%淋巴细胞),T-bet表达高BAL患者淋巴细胞倾向于展览T-bet表达式(3.66±1.66)高于那些BAL淋巴细胞较低(1.98±0.90,p = 0.15) (图1 h)。
T-bet mRNA表达的相关基因表达的选择sarcoidosis-relevant基因
因为T-bet被认定为有效的调制器的众多基因的mRNA表达,我们调查了其可能的关系IFN-γ的mRNA表达,IL-2R / IL-15RβCCL2, CCL5, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CCR2, CCR5, CXCR3和CXCR6 BAL细胞结节病病人。
T-bet mRNA的表达与IFN-γ表达升高(p < 0.001), CCL5 (p < 0.001), CXCL9 (p = 0.033), CXCL10 (p = 0.006), IL-2R / IL-15Rβ(p < 0.001), CXCR3 (p < 0.001)和CXCR6 (p = 0.001) (表3)。尽管我们还观察到一个与CCR2-variant B正相关(p = 0.003),这个成绩单变体不是调节在结节病与控制。CCR2-variant的表达式,发现调节我们的肉质的病人,不与T-bet (p > 0.05)。同样,我们的相关分析表明,表达CCL2, CXCL11和CCR5 (p > 0.05)没有与T-bet有关。斯皮尔曼系数的所有研究基因中列出表3。
基因的mRNA的表达(表达为一个褶皱变化)发现在病人组与T-bet呈现有/没有LS所示图2一个。的基因与T-bet mRNA的表达CCL5 (p = 0.033), CXCL9 (p = 0.041)和IL2-R / IL-15Rβ高(p = 0.042)在我们的病人没有LS相比那些LS。趋化因子的表达CXCL10往往是更高的病人没有LS (p = 0.08);IFN-γ(p = 0.25)和受体CXCR3 (p = 0.12)和CXCR6 (p = 0.22),两组之间的差异没有达到显著性。
基于显著差异的mRNA表达谱T-bet根据BAL患者亚组巨噬细胞(截止85%),我们也比较mRNA的表达趋化因子CCL5 CXCL10,主要由巨噬细胞产生,在这些子组。更多的CCL5成绩单落下帷幕巨噬细胞中检测出患者较低的子组相比,高BAL患者巨噬细胞(p = 0.003);区别CXCL10成绩单两亚组之间的数量没有达到显著性(p = 0.17) (图2 b)。
T-bet mRNA表达的相关性与BAL细胞轮廓
为了找出是否T-bet mRNA表达与球细胞轮廓,我们进行了相关分析。T-bet mRNA表达与相对(枪兵的ρ(r年代)= 0.427,p < 0.001),但不是绝对的(r年代= 0.008,p > 0.05), BAL淋巴细胞计数。此外,T-bet与相对负相关(r年代= -0.381,p < 0.002),倾向于与绝对的(r年代= -0.236,p = 0.07), BAL巨噬细胞。没有观察到协会BAL中性粒细胞和嗜酸性粒细胞(p > 0.05)。
讨论
因为Th1转录因子T-bet已被证明中发挥关键作用的转录控制Th1反应和CXCR3和IFN-γ,两个关键基因为结节病发病机理,分析了T-bet mRNA和蛋白表达在BAL细胞结节病的病人。与对照组相比,在结节病T-bet mRNA表达升高,因此,建议该转录因子的作用在这种Th1疾病的免疫发病机理。T-bet蛋白表达局部肺泡巨噬细胞和淋巴细胞,多核巨细胞和组织,上皮样细胞和淋巴细胞。最后,我们的实验调查T-bet之间可能的关系和一系列基因结节病的发病机制表明,T-bet与IFN-γmRNA表达的增加有关,CCL5, CXCL10, CXCR3, CXCR6和IL-2R / 15 rβ。
鉴于T-bet在Th1细胞分化的关键作用8)及其要求CXCR3和IFN-γupregulation [5- - - - - -7),我们假设T-bet参与Th1-polarised炎症在结节病的发病机理。符合这一假设,我们的数据表明,T-bet mRNA表达升高是结节病病人与对照组相比。水平的提高T-bet也被报道在其他Th1疾病,如克罗恩氏病(32和腹腔疾病33,34),T-bet表达式平行的疾病过程。符合观测的N是伊洗利et al。(35),我们观察到的趋势降低表达T-bet吸烟者与不吸烟者相比,在控制和患者团体。出于这个原因,我们进一步subanalysed T-bet表达式只有在不吸烟的受试者(90%的患者)。在结节病表型的情况下评估CXR分段,我们没有观察到任何与个人CXR阶段。此外,我们没有发现任何区别患者呈现/ LS,与肺外疾病/肺参与和进步/汇款。这允许我们推测T-bet可能没有影响的临床表型,但它可能作为“sarcoidosis-predisposing”分子,因此,解释结节病在吸烟者的发病率相对较低36]。
基于观测T-bet-deficient老鼠和转染细胞系T-bet是绝对要求的诱导转录CXCR3和IFN-γTh1细胞(5- - - - - -7),我们建议T-bet也可以调节CXCR3和IFN-γ结节病的基因表达。CXCR3的T-bet控制表达式是结节病的特别感兴趣,因为这趋化因子受体t细胞在招聘中起着举足轻重的作用与后续肺肉芽肿形成(4]。在这项研究中,我们观察到很强的相关性之间T-bet和CXCR3和IFN-γ表达BAL细胞从肉质的肺。我们的相关分析,因此,支持T-bet调制的概念CXCR3和IFN-γ基因表达的肉质的肺。需要进一步功能研究证实CXCR3的直接控制和IFN-γT-bet表达式的肉质的肺。
尽管T-bet参与了众多免疫系统的调节基因,了解其目标,启动子的动机和监管机制远未完成。相比的直接要求T-bet CXCR3和IFN-γ表达无论细胞类型,调节其他基因可能是高度依赖“上下文”(5]。解决角色T-bet在结节病从这方面,我们研究了其与选定的细胞因子的关系/受体与疾病发病机理。研究趋化因子受体,我们观察到很强的相关性之间T-bet CXCR6,受体CXCR3 t细胞发生在结节病(4]。此外,很强的相关性之间的观察T-bet CCL5 CXCL10,招聘两种趋化因子发挥重要作用的t细胞的肺结节病(4,15- - - - - -17,19]。另外,我们观察到一个强大的协会之间T-bet和IL-2R / IL-15Rβ(CD122)在结节病的患者;本协会已经报道在动物细胞培养(5,7]。IL-2R / IL-15Rβ单元由两个共享sarcoidosis-related受体(37]:激活标记IL-2R IL-15R,肉质的t细胞受体参与成长10,22]。
我们也有兴趣调查的细胞类型(s)表达T-bet。因为趋化因子或受体,表达式的已被证明是由T-bet调制,发现无论是在肺泡淋巴细胞(IL-2R CXCR3和CXCR6) [4,10,22)或巨噬细胞(CCL5和CXCL10) (17,19),我们假设,细胞可以表达T-bet相同。在我们的免疫化学实验,T-bet局部肺泡巨噬细胞和淋巴细胞和巨噬细胞肺活检,多核巨细胞,上皮样细胞肉芽肿和淋巴细胞。T-bet表达式已经发现在不同的细胞类型,如自然杀伤细胞、树突,T和b细胞(5];在此我们报告T-bet表达式也在肺巨噬细胞。有趣的是,我们注意到加强生产T-bet结节病低BAL患者巨噬细胞。因为我们也发现调节CCL5在这些患者中,我们推测,这一事实可能是代偿反应保持CCL5趋化因子梯度的肉质的肺。T-bet的动力学表达式在肺泡巨噬细胞疾病在未来应该调查研究。
这项研究有一定的局限性。首先,我们只有四个评估患者的纤维化阶段结节病,因为可用的有限数量的患者表型。其次,我们使用rt - pcr T-bet测量和趋化因子受体体外提供信息可能在结节病的关系,但我们并不能证明T-bet之间的相互作用的机理和相关基因的功能研究。第三,本研究只集中在T-bet mRNA表达谱BAL细胞而不是在肺和淋巴结组织和外周血细胞。然而,根据我们的免疫组织化学实验,很明显,T-bet也表示sarcoidosis-associated细胞浸润肉质的肺组织和它在将来的研究中应该调查获得T-bet表达式的完整细胞结节病。
总之,我们的数据表明,Th1转录因子的表达T-bet调节在肺结节病。T-bet之间的观察有很强的正相关关系和基因表达IFN-γ和CXCR3的肉质的平衡细胞,建议之前报道的这些基因直接控制T-bet也发生在肺结节病的隔间。此外,我们的相关分析显示之间的关系T-bet sarcoidosis-associated趋化因子CCL5 CXCL10,和受体IL-2R / IL-15R CXCR6肉质的落下帷幕。需要进一步功能研究证明T-bet之间的相互作用的机理和相关的基因。
确认
我们承认员工的帮助呼吸医学部门的支气管镜检查部门(学院医院,奥,捷克共和国),a Arakelyan(分子生物学研究所亚美尼亚国家科学院埃里温,亚美尼亚共和国)统计的建议,j . Srovnal(实验室的实验医学,分子和转化医学研究所、医学及牙科学院,大学深造,奥,捷克共和国)测量的RNA完整性和r . Langerova(实验室Immunogenomics Immunoproteomics,医学院和Denistry深造大学)和大肠Sedlakova(临床和分子病理学、医学院和牙科,深造大学)在免疫组织化学实验技术援助。
脚注
支持声明
资金从捷克获得卫生部(IGA MZ CR NT / 11117 - 6和IGA MZ CR NR / 9037),在某种程度上,从内部授予机构深造大学(IGA PU项目SV LF_2010_008)和CZ.1.05/2.1.00/01.0030。
感兴趣的语句
没有宣布。
- 收到了2010年6月10日。
- 接受2011年3月28日。
- ©2011人队