抽象的
造血c-kit+祖细胞可能参与肺血管重构和肺动脉高压(PH)。基质衍生因子-1 (SDF-1/CXCL12)及其受体CXCR4和CXCR7已被证明对血管周围生态位的造血c-kit+祖细胞的归巢和动员至关重要。
我们将CXCR4拮抗剂AMD3100和CXCR7拮抗剂CCX771应用于慢性缺氧暴露小鼠,以研究c-kit+祖细胞在ph中的作用。CXCL12、CXCR4和CXCR7蛋白表达、血流动力学参数、右心室质量、研究血管重构的程度和血管周围祖细胞的聚集。
慢性缺氧暴露小鼠在ph发生后,肺组织总CXCR4、CXCR7和CXCL12表达增加。这与右心室收缩压显著升高、右心室肥厚、血管重塑和血管周c-kit+/sca-1+祖细胞聚集有关。CCX771给药未消除这些作用。相比之下,AMD3100,无论是单独或联合CCX771,均可防止血管重塑、PH和c-kit+/sca-1+祖细胞的血管周围聚集,这些药物具有协同作用。
这项研究为造血c-kit+祖细胞在缺氧诱导的血管重构中的作用提供了重要的病理生理学见解,并可能对PH有治疗意义。
近年来的许多研究表明,非常驻祖细胞可能与慢性缺氧诱导的肺动脉高压(PH)有关[1].积累骨髓(BM)循环内皮祖细胞存在的累积证据[2],循环平滑肌祖细胞[3.]及循环纤维细胞[4],这可能有助于血管改造的过程。目前,对BM衍生的血管祖细胞的单一最佳标记没有明确的共识。然而,用于BM衍生的血液吞咽祖细胞的通常接受的标记是C-kit / CD117,用于干细胞因子的跨膜酪氨酸激酶受体[5].以前的研究报道了c-kit+细胞从脑基底膜移动并追踪到动脉粥样硬化病变[6]和心肌梗死的网站[7].此外,Toshneret al。[8研究表明,在与人类严重肺动脉高压相关的丛状病变中,尤其存在表达祖细胞标志物的细胞。在这些病变中伴随有祖细胞归巢信号的表达。
CXC趋化因子基质衍生因子-1(SDF-1 / CXCL12)及其受体CXCR4在调节癌细胞转移方面发挥了重要作用[9],淋巴细胞贩运[10]及调动造血祖细胞至缺血组织[11].最近的证据表明,另外七个跨膜CXCL12受体由RDC1 / CXCR7编码[12,13].CXCR7可能与CXCR4复杂,形成增强CXCL12信令的异二聚体[14].肿瘤细胞,活性内皮细胞,胎儿肝细胞和其他细胞类型报告了CXCR7的表面表达[15].有人认为,CXCR7调节动物模型中的几个主要生物学过程,包括细胞存活、细胞粘附和肿瘤发展[15].CXCR4,CXCR7和CXCL12的表达响应于组织缺氧而上调,有助于募集循环祖细胞[16- - - - - -18].
因此,我们的研究的目的是通过减少肺癌C-kit +出血祖细胞聚集来确定AMD3100,CXCR4拮抗剂,CCX771,CXCR7拮抗剂或两者的施用,CXCR4拮抗剂,CCX771,CXCR7拮抗剂或两者均来会丧失缺氧诱导的pH。
材料和方法
学习规划
预防策略
44 6周龄雄性C57BL / 6J小鼠(Janvier,Le Genest-St-ide,法国)暴露于正常缺氧(10%吸气氧气分数(F我,o.2))或常氧(20.9%F我,o.2)3周,然后随机分配到每日的四个群体:1)腹腔注射盐水;2)腹膜内注射10 mg·kg−1AMD3100(Sigma-Aldrich,Saint-Quentin-Fallavier,法国);3)皮下注射10 mg·kg−1CCX771(ChemoCentryx,山景,CA,USA);4)在10 mg·kg的情况下,含有AMD3100和CCX771的组合治疗−1从第一天到第21天。
治疗策略
将28只6周龄雄性C57BL/6J小鼠暴露于常压缺氧(10%)F我,o.2)或常氧(20.9%)F我,o.2)5周。在这一暴露3周后,将小鼠随机分配为每日接受:1)腹腔注射盐水;2)腹膜内注射10 mg·kg−1AMD3100;3)皮下注射10 mg·kg−1CCX771;4)在10 mg·kg的情况下,含有AMD3100和CCX771的组合治疗−1从第21天到第35天。
动物实验由行政小组在ChirurgieExpérimentaleMarieLannelongue(Le Plessis-Robinson,法国)的嘉实小组批准。
血液动力学测量和组织收集
用腹膜内注射氯胺酮麻醉小鼠(60 mg·kg−1)和木嗪(8 mg·kg−1).从复古轨道丛中收集血液样品。在插入连接到右心室的压力传感器的24型针内,记录右心室收缩压(RVSP)通过右颈静脉。老鼠被放血安乐死。气管内灌注50% OCT于PBS中膨胀肺,迅速冷冻保存于-80°C。通过计算右心室(RV)与左心室(LV)加间隔(S)的重量比(RV/(LV+S))来评估右心室肥厚。
免疫荧光
5 μm丙酮固定冰冻切片染色。使用的抗小鼠一抗为:anti- rdc1 /CXCR7 (Novus Biologicals, Littleton, CO, USA), anti- sdf -1α/CXCL12α (eBioscience, San Diego, CA, USA), anti- sc -1 (Abcam, Paris, France), anti- sa -1 (R&D Systems, Lille),法国)、anti-FcϵRIα(免疫球蛋白E高亲和力受体;eBioscience)和抗肥大细胞胰蛋白酶(Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA, USA)。同型匹配的无关抗体作为阴性对照。AlexaFluor488-, AlexaFluor594-或alexafluor647标记种特异性二抗或链霉亲和素用于显示染色(Invitrogen公司,Cergy-Pontoise,法国)。切片在常规荧光和共聚焦激光扫描显微镜(Olympus FV-1000;奥林巴斯,朗吉斯,法国)与适当的排放过滤器。
微观形态测量学
随机测定30个小动脉内壁厚度与直径<30 μm、30 ~ 50 μm、50 ~ 75 μm和75 ~ 100 μm的肺小动脉内壁厚度之比。通过计数每只小鼠30个小动脉上表达c-kit的细胞(每组n = 3个),计算每个肺动脉(横断直径30 - 100 μm)上c-kit+细胞的平均数量。
免疫印迹
Western blot检测常氧和低氧肺(n = 3-5),如前所述[19].然后用抗CXCR4(Capralogics,Hardwick,VT,USA),抗CXCR7(NoVus生物)或抗CXCL12(eBioscience)抗体染色,然后与辣根过氧化物酶 - 缀合的二抗孵育。使用新的Hyperfilm ECL(GE Healthcare,France),由Lumi-illypliese Blotting底物(Roche,Neuilly-sur-Seine,France)可视化蛋白质带。膜被剥离在恢复蛋白质印迹剥离缓冲液(Thermo Fisher,Brebières,法国)中,并重复使用用于用山羊多克隆抗体(ABCAM)检测β-肌动蛋白条带。使用imagej确定蛋白质带强度(国家健康机构,美国MD,MD;http://rsb.info.nih.gov/ij/).
统计分析
定量变量以均值±表示扫描电镜.组间多组比较采用方差分析(ANOVA), Fisher投影最小显著差异法事后分析。P值<0.05被认为是反映统计学意义。
结果
CXCL12,CXCR4和CXCR7表达和血管血液吞咽祖细胞在肺缺氧3周后肺部累积
与常氧小鼠的缺氧小鼠的总肺组织中CXCR4,CXCR7和CXCL12的表达显着增加(1.08±0.19,0.55±0.25,0.2±0.25,0.23±0.02和0.45±0.03,所有P <0.05)(无花果。1A-D.).这与缺氧的肺动脉内皮细胞和平滑肌细胞中CXCL12和肺动脉内皮细胞中CXCR4和CXCR7的强免疫染色有关。此外,慢性常压缺氧与重塑肺动脉周围血管周围CXCR4+细胞和c-kit+细胞的聚集有关(图1 e-l).我们使用造血和肥大细胞标记检查了这些细胞的来源。c-kit的双重免疫染色,分别结合Sca-1和CXCR4,证实了这些细胞的造血来源。大部分积累的细胞FcϵRIα和肥大细胞胰蛋白酶均为阴性。c-kit和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的双免疫荧光显示,在肺动脉病变周围观察到的一些c-kit+细胞可能共同表达α-SMA,表明这些细胞可能分化为肌成纤维细胞(图2).
缺氧3周后,CXCL12,CXCR4和CXCR7表达和血管出血祖细胞聚集在肺中。A-D)CXCL12的过表达及其两种受体CXCR4和CXCR7在缺氧(H)小鼠中的总肺蛋白提取物与蛋白质印迹测量的常氧(N)小鼠相比。*:P <0.05;***:P <0.001。表达朝向β-肌动蛋白归一化。N = 3在对照组中与缺氧组N = 5。e - l)免疫组化分析e, f) CXCL12及其受体g, h) CXCR4和i, j) CXCR7, k, l)血管周围c-kit+和CXCR4+细胞的聚集。常氧(e, g, i, k)和缺氧(f,h, j, l)小鼠肺。比例尺= 50 μm。
缺氧时肺血管中造血c-kit+祖细胞的特征。低氧性肺动脉高压小鼠肺内有c-kit+细胞聚集。大多数c-kit+细胞共同表达祖造血标记物a) CXCR4和b) Sca-1。肥大细胞c-kit的双免疫荧光染色(c) tryptase和d) FcϵRIα显示,大多数c-kit+细胞对这两种标志物均为阴性。e)部分细胞c-kit和α-SMA双染色阳性,提示细胞可能分化为肌成纤维细胞(箭头)。比例尺= 50 μm。
AMD3100和CCX771对缺氧诱导的pH值的影响
分血器
我们证实缺氧小鼠的红细胞压积值在第21天和第35天显著高于正常缺氧对照组小鼠(61.7±1.2)与46.0±1.4,p < 0.0001)。AMD3100和CCX771治疗对缺氧动物的红细胞压积值没有影响(数据未显示)。
血流动力学与右心室肥厚
预防策略
然后,我们试图阐明抑制CXCR4/CXCR7是否可以防止ph。与常氧小鼠相比,缺氧小鼠的RVSP显著增加(28.6±0.6 mmHg)与22.7±0.5毫米汞柱,p < 0.001)。AMD3100处理小鼠的RVSP(25.0±0.5 mmHg)明显低于缺氧组小鼠(p<0.001),但仍显著高于缺氧组小鼠(p = 0.02),说明AMD3100具有显著但部分的作用。单独CCX771对缺氧诱导的PH(28.3±0.4 mmHg)无影响,而AMD3100联合CCX771诱导的RSVP明显低于缺氧小鼠的RVSP(23.4±0.6 mmHg, p<0.0001),表明AMD3100和CCX771具有协同作用。因此,AMD3100和CCX771联合治疗的RSVP与常氧小鼠的RVSP无显著性差异(p = 0.46) (无花果。3A).
![图3 -](http://www.qdcxjkg.com/content/erj/37/6/1392/F3.medium.gif)
AMD3100、CCX771及其联合应用对缺氧性肺动脉高压血流动力学和右心室肥厚的影响a)不同治疗组的右心室收缩压(RVSP)。b)右心室(RV)与左心室(LV) +中隔(S)重量(RV/LV+S)之比。#:P <0.0001;¶:P <0.02;**:P <0.01;***:P <0.001。
缺氧诱导的pH与右心室的显着肥大相关,与常氧对照相比,由RV /(LV + S)比率定义(0.41±0.02与0.29±0.01,p < 0.0001)。与AMD3100对缺氧小鼠RVSP的有益作用一致,AMD3100对缺氧小鼠的RV/(LV+S)比值也显著降低(0.35±0.01)。单用CCX771对缺氧诱导的右心室肥厚无影响(0.41±0.02),而AMD3100和CCX771联合治疗与常氧小鼠相比无统计学意义(0.33±0.02,p = 0.14) (无花果。3B.).
治疗策略
成年小鼠缺氧5周后RVSP显著升高(28.8±0.5 mmHg)与22.7±0.4 mmHg,p <0.0001)和右心室肥大(0.39±0.03与0.29±0.04,p<0.0001))。相比之下,在PH确定的小鼠中,给予AMD3100、CCX771或两者均2周,对RVSP和RV/(LV+S)比值均无显著影响(数据未显示)。
CXCR4和CXCR7拮抗作用对缺氧诱导的肺血管重塑的影响
然后我们研究了CXCR4和CXCR7拮抗对小鼠肺血管重构的影响。低氧小鼠肺小动脉<30 μm、30 ~ 50 μm、50 ~ 75 μm和75 ~ 100 μm的中层厚度明显高于正常小鼠。缺氧组小鼠肺小动脉<30 μm、30 ~ 50 μm、50 ~ 75 μm和75 ~ 100 μm的中层厚度较正常缺氧组小鼠明显减少,但较正常缺氧组小鼠仍增加。CCX771单独治疗对缺氧诱导的肺动脉增厚无显著影响。然而,与缺氧对照小鼠和单独使用AMD3100或CCX771治疗的缺氧小鼠相比,联合使用AMD3100和CCX771治疗的缺氧小鼠的中间厚度显著降低。AMD3100联合CCX771治疗缺氧小鼠的中厚度与正常小鼠的中厚度(图4).
![图4 -](http://www.qdcxjkg.com/content/erj/37/6/1392/F4.medium.gif)
AMD3100、CCX771及其组合对内壁厚度的影响。每只小鼠(n = 3)取30条肺动脉,分为<30 μm、30 ~ 50 μm、50 ~ 75 μm和75 ~ 100 μm四组。每条条形代表肺小动脉内壁厚度与外径的平均比率,测量≥30条动脉从3张幻灯片。*: p < 0.05与控制;#:P <0.05与第21天缺氧。
CXCR4和CXCR7拮抗作用对缺氧诱导的血管外C-kit +祖细胞积累的影响
缺氧诱导的肺血管重塑与c-kit+/FcϵRIα-/tryptase-祖细胞的显著聚集有关,与正常缺氧时肺动脉外膜中少数c-kit+/FcϵRIα+/tryptase+肥大细胞不同(3.8±0.1)与0.6±0.1细胞·动脉−1, p < 0.0001)。
鉴于CXCL12是在缺氧期间动员的祖细胞的整体组分,并且C-kit +细胞在具有缺氧诱导的pH的成人小鼠的肺中增加,我们下次评估如果通过抑制可以降低血管血管c-kit +细胞数CXCR4 / CXCR7路径。与缺氧小鼠相比,AMD3100疗法显着降低了C-kit +细胞的数量(1.8±0.1细胞·动脉−1,P <0.0001),但它保持显着高于常氧小鼠(P <0.0001)。组合AMD3100和CCX771处理(1.0±0.1个细胞·动脉−1)与单独的AMD3100(P <0.0001)和常氧小鼠相比,最有效地减少缺氧诱导的C-kit +祖细胞积累(P = 0.016)(图5).
血管病变附近的C-KIT +细胞浸润分析。CXCR4和CXCR7拮抗作用对血吸虫C-kit +祖细胞缺氧诱导血管累积的影响。#:P <0.0001。
讨论
我们分析了两种主要趋化因子受体对缺氧诱导的pH的募集血液祖细胞募集的拮抗作用的影响。我们证明AMD3100,CXCR4的拮抗剂及其与CCX771的组合,CXCR7,至少部分地预防慢性缺氧诱导的肺血管重塑,pH和右心室肥大。这些效应与缺氧诱导的pH相关的血管外C-kit +出血祖细胞显着降低。
缺氧是诱发高原人群PH或PH合并慢性阻塞性肺疾病、间质性肺疾病等慢性呼吸系统疾病的主要刺激因素。急性缺氧可导致选择性肺小动脉血管收缩,而慢性缺氧可导致肺血管床的形态和功能改变[20.].缺氧是CXCR4/CXCL12通路的有效激活剂。值得注意的是,通过CXCR4作用的CXCL12是调节造血干细胞和祖细胞贩运的主要趋化因子。最近,有研究表明CXCL12在调动和招募bm来源的CXCR4+促血管生成细胞到缺氧组织中起着关键作用。CXCL12可通过CXCR4作用于血管内皮[21[上调和激活粘合分子以促进与循环细胞的稳定相互作用[22].此外,募集的CXCR4 +细胞可能产生血管生成细胞因子,促进常驻血管细胞的增殖和分化[11].在我们目前的研究中,我们在成人缺氧动物中延伸,最近在新生动物中获得的数据,证明了可能导致肺动脉患有肺动脉患者C-kit +血液吞噬祖细胞累积的缺氧诱导的血管内的血管内的数据23,24].年轻的et al。[24表明在肺发育过程中抑制CXCL12/CXCR4轴既抑制又逆转新生PH小鼠肺血管重构,这与干细胞肺表达降低有关。然而,本研究缺乏对祖细胞的精确鉴定和计数。c-kit+细胞计数是在整个图像上进行的,而不是在重塑的血管附近。此外,没有标记物用于排除同样表达c-kit的肥大细胞。定位于实质的c-kit+细胞可能是肥大细胞,共同表达FcϵRIα或胰酶。我们毫不含糊地表明,抑制CXCL12 / CXCR4轴降低肺血管重塑的数量以及招募肺c - kit + / FcϵRIα-和c - kit + /类胰蛋白酶-细胞PH值的实验模型,通过直接计算这些细胞附近的改建讲小动脉大小。
我们还将研究扩展到RDC1 / CXCR7的作用,另一个最近鉴定的CXCL12的受体的作用[12,13].事实上,一些报告表明CXCR7在缺氧反应中发挥作用[25,26].CXCR7可能与CXCR4复杂,形成增强CXCL12信令的异二聚体[14].已经证明CXCR7调节若干重要的生物过程,包括动物模型中的细胞存活,细胞粘附和肿瘤发育[15].然而,CXCR7信号转导的机制尚不完全清楚。迄今为止,CXCL12/CXCR7相互作用尚未被证明能激活g蛋白介导的信号转导,有人推测CXCR7可能会从细胞外环境中清除分泌的CXCL12,从而帮助维持已定义的CXCL12梯度[27].虽然AMD3100只有局部效果,CCX771对缺氧诱导的C-kit +祖细胞积累和pH没有影响,但我们表明CXCR4和CXCR7拮抗剂可能具有协同作用,并预防血管面积中的缺氧诱导的血吞噬祖细胞积聚和pH。这些结果可以通过这些途径的几个最近描述的特征来解释。Kalatskaya.et al。[28[主要称为CXCR4的AMD3100,主要称为CXCR4的竞争性配体,也是CXCR7的浓度浓度的变构配体,该浓度通常由研究人员使用在体外研究。因此,AMD3100除了对CXCR4/CXCL12相互作用产生负作用外,还可能正向调节CXCL12效应并与CXCR7结合。这一机制可能参与了我们观察到的两种受体联合拮抗的协同作用。此外,AMD3100向CXCR7招募β-阻止素,但阻止β-阻止素向CXCR4招募。这可能解释了在AMD3100单药治疗的情况下,造血c-kit+细胞聚集的两倍减少和血管重构的部分改善。这也解释了为什么AMD3100联合CCX771治疗后,这些参数完全相反。因此,我们的研究表明,阻断CXCL12/CXCR4轴不足以完全防止低氧PH和相关的祖细胞积聚,但联合CXCR4/CXCR7拮抗能够维持RVSP、RV/(LV+S)比、肺动脉中膜厚度、以及血管周围造血c-kit+祖细胞计数。Mazzinghiet al。[29已经表明,CXCl12 / CXCR4相互作用负责肾多能祖细胞募集,但也需要CXCL12 / CXCR7相互作用来进行转诊迁移。在我们的研究中,我们确定CXCR4由血杂化C-kit +和内皮细胞和CXCR7主要由内皮细胞表达。可以假设内皮和平滑肌细胞表达的CXCL12作用于内皮细胞(作为旁静脉和自分泌分泌)表达的CXCR7,并诱导内皮细胞的激活,从而增加祖细胞的粘附性和颅骨迁移。显示BM衍生的细胞在缺氧条件下分化为α-SMA +细胞中的α-SMA +细胞,并选择性耗尽含有克氏酸克膦酸或氯化钆的脂质体的连续静脉内注射循环间充质前体预防肺患者重塑[30.,提示这些细胞可能具有功能相关性。
研究祖细胞的命运不在本研究的范围内,值得进一步调查细化动力学研究,以及CXCR4,CXCR7和C-KIT拮抗剂的作用机制的研究。我们不能排除与CXCR4和CXCR7拮抗剂的有益治疗不仅可以通过减少血管内区域的血管祖细胞的积累而且对慢性缺氧中描述的炎症反应的潜在影响,这可能会促进祖细胞的招募.
总之,我们的数据表明,通过CXCR4和CXCR4和CXCR7拮抗作用的重组肺动脉血液肺动脉血管肺动脉血管血管+祖细胞的动员和归巢。此外,这些对C-kit +细胞积累的影响与预防pH和肺血管重塑有关。这是第一项研究证明AMD3100和CCX771的组合减少了缺氧诱导的pH中的血管内C-kit +祖细胞的数量。本研究提供了重要的病理生理学洞察血液生理症患者对成年慢性缺氧诱导的血管改造中的血吞噬C-kit +祖细胞的作用,并且可能对人pH具有重要意义。
致谢
我们要感谢ChemoCentryx公司(Mountain View, CA, USA)赠送CXCR7拮抗剂CCX771。我们也感谢A. Huertas (Faculté de médecine, Université Paris-Sud, Kremlin-Bicêtre, INSERM U999, Hypertension Artérielle Pulmonaire, Physiopathologie et Innovation Thérapeutique, Marie Lannelongue外科中心,Le Plessis-Robinson和国家中心Référence de l'Hypertension Artérielle Pulmonaire,服务de Pneumologie et Réanimation respiratory, Hôpital Antoine Béclère, AP-HP, Clamart, France)提供手稿的评论阅读,以及共聚焦成像的Plate-forme d’imagerie Cellulaire Pitié Salpêtrière。
脚注
支持声明
这项研究得到了Ministère de l’enseignement Supérieur et de la Recherche (GIS-HTAP)和Legs Poix, Chancellerie des Universités de Paris的部分资助。N. Gambaryan得到了Société de Pneumologie de Langue Française的资助。F. Perros获得欧洲呼吸学会(ltrf171)长期研究金的支持。188bet官网地址蒙塔尼是由法国HTAPfrance协会资助的。
感兴趣的语句
D. Montani, G. Simonneau和M. Humbert的兴趣声明可以在www.www.qdcxjkg.com/site/misc/statements.xhtml.
- 已收到2010年3月23日。
- 接受2010年9月18日。
- ©ers 2011.