文摘
抗原的临床效用干扰素(IFN) -γ释放化验(干扰素释放)使用胸膜单核细胞,诊断肺结核(TB),需要澄清。
我们比较的诊断效用如果胸膜IFN-γ水平与几个胸膜抗原t细胞干扰素释放(早期分泌抗原滤液protein-10 (T-SPOT具体目标6和文化。®结核病,QuantiFERON®一样,黄金管),纯蛋白衍生物(产后抑郁症)和heparin-binding血凝素(HBHA))在78年南非结核病嫌疑犯。测试结果比较与临床评分参考标准。
74可评价的受试者48,7和19已定,分别可能和没有结核病。11(15%)的74个胸膜样本(9(19%)的48个明确的结核病例),总细胞数,为t细胞处理不足。在剩下的63个样本,敏感性,特异性,阳性预测值和阴性预测值不同的诊断方法如下。最大bioclinical得分:54岁,89年、92年和43%,分别;T-SPOT。®结核病:86、60、84和64%,分别;QuantiFERON®一样,黄金管:57岁的80年,87年和44%,分别;64年HBHA-specific干扰素释放:59,31日和27%,分别;PPD-specific干扰素释放:81,76和46%,分别;和胸膜液如果IFN-γ:97、100、100和94%,分别。
如果IFN-γ是最精确的测试区分从non-TB积液结核病高负担。抗原t细胞干扰素释放受到次优的准确性,不能孤立足够的单核细胞进行鉴定。
胸膜腔积液是常见的在发展中国家,在临床实践中各种目的,包括肺结核(TB)。每年,超过一百万例结核相关胸腔积液(TB-PE)在全球范围内发生1。结核病是失控在非洲和占很大一部分胸膜腔积液的设置2;因此,做一个准确的诊断变得至关重要。胸膜液涂片和文化有助于少数病例(∼30%)3。目前,检测腺苷脱氨酶(ADA),为结核病生物标志物,用于几个实验室,但是这个设备不是广泛使用在发展中国家负担沉重,它不是具体的结核病3,4。关闭胸膜活检具有良好的收益率(∼80%)但不太敏感,侵入性,相对昂贵,可能与并发症有关3。因此,经验抗结核治疗往往是管理。需要选择,快速诊断TB-PE和微创的方法,特别是在发展中国家。最近,候选生物标志物干扰素(IFN) -γ-inducible protein-10 (10-kDa辅助细胞(Th) 1型趋化因子相关联)5而如果IFN-γ水平6显示的承诺。后者显示在中间和低负担设置好歧视性的价值6。然而,数据的实用程序和性能结果胸膜液如果IFN-γ水平高结核患病率设置是有限的。
最近,外周血定量地区差异(RD) 1抗原(早期分泌抗原目标(计)6和文化滤液蛋白(CFP) -10)早期反应已成为建立敏感、具体和快速immunodiagnostic检测结核感染7- - - - - -9。然而,他们无法区分潜伏性感染和活跃的疾病8。相比之下,在该网站的活跃的胸膜10或肺11,12疾病,无性繁殖系地扩大抗原t细胞的频率超过10倍高于外周血,理论上不应该出现在non-TB胸膜腔积液。因此,我们假设,结核抗原反应可以从选择区分活动性胸膜结核诊断和歧视性的价值应该比如果IFN-γ,炎症的非特异性生物标志物。来自欧洲的最近的一个病例对照研究显示与T-SPOT诊断精度高。®结核病检测(英国牛津Immunotec,阿宾顿)13但总体数据的效用两个已知IFN-γ释放化验(干扰素释放),T-SPOT。®结核病和QuantiFERON®一样,黄金管(QFT-TB-GIT;Cellestis、卡内基、澳大利亚),包括进行比较,并诊断TB-PE是有限的13- - - - - -16。还有其他几个未解决的问题,包括最佳的细胞数量和胸膜液体体积要求,最佳分界点和效用在艾滋病毒感染率高的环境17。其他小说抗原,如heparin-binding血凝素(HBHA),证明是在外周血歧视性18,19,迄今为止没有被评估使用胸膜液淋巴细胞。
在这项研究中,主要的目的是评估的诊断工具,在临床实践中,几种不同干扰素释放使用胸膜液t细胞在一个高负担结核病和艾滋病。我们前瞻性研究的性能比较结果如果胸膜IFN-γ水平对四个抗原干扰素释放,包括T-SPOT之间进行比较。®结核病和QFT-TB-GIT,使用胸膜液单核细胞。比较外周血反应也被评估。
方法
病人招募,描述和常规实验室检测
研究批准来自开普敦大学健康科学学院(南非开普敦)研究伦理委员会。获得知情同意,并给予辅导后,连续78例临床疑似TB-PE患者前瞻性Groote Schuur招募,萨默塞特和维多利亚医院在开普敦在12个月里(截至2008年4月30日)。所有患者和体检中取过历史,与常规调查包括艾滋病毒感染的检测,胸部x线摄影,微生物痰检查只要有可能,和愿望∼20毫升的胸膜液体(或最接近获得体积)生化、细胞学和详细的微生物评价。4名患者被排除在进一步分析(见图1⇓有关详细信息,包括汇总招聘);因此,74例可评价的样本。疾病的准确描述,多个封闭的胸膜活检进行。尽管提出,在16个病人活检并没有因为病人拒绝,禁忌症,液体或组织学的积极文化从另一个网站之前试图胸膜活检。
参考标准用于诊断结核病是文化的积极性结核分枝杆菌(使用胸膜液体或组织)和/或组织学暗示的结核病(干酪样坏死与抗酸的细菌,有或没有肉芽肿形成)。病人因此被称作1)明确结核病(会议参考标准),2)non-TB(没有微生物或组织学证据结核病,替代诊断,不治疗结核病和没有出现结核病超过6个月的随访),和3)可能的结核病(经验性抗结核治疗但不是会议定的标准结核病)。定,non-TB组用于敏感性和特异性的计算。实验室化验都是由一个有经验的技术员失明患者和临床细节。
抗原干扰素释放
四种不同干扰素释放。1)有关酶联免疫斑点反应IFN-γESAT-6 / CFP-10肽池进行根据制造商的指示(T-SPOT®TB),使用外周血细胞(250000·−1)和胸膜单核细胞(200000·−1),列举有关酶联免疫斑点读者使用。9名患者的数据显示,2×105细胞·好−1生产最优IFN-γ反应,而1×105细胞·好−1(149与ESAT-6 39 spot-forming细胞(证监会);p = 0.002;和108年与36 CFP-10证监会;p = 0.01)。使用4×105细胞·好−1没有显著增加现货数量。2)使用QFT-TB-GIT IFN-γ响应分析进行使用1毫升的血液和1×106胸膜单核细胞re-suspended在每个管1毫升的无血清培养基。数据从6个病人显示抗原反应明显高于当使用至少1×106胸膜单核细胞/管与1×105细胞(2.53与0.026 IU·毫升−1;p = 0.008);暂停胸膜细胞小卷(0.25和0.5毫升)对测量IFN-γ浓度没有影响。3)有关酶联免疫斑点反应IFN-γHBHA进行使用IFN-γ有关酶联免疫斑点板板(Mabtech, Nacka链,瑞典)。剂量反应实验表明优化IFN-γ分泌发生在HBHA剂量μg·100毫升−1使用外周单核细胞。甲基化HBHA抗原产生的文化分枝杆菌smegmatis3.38如前所述20.。有关酶联免疫斑点对纯蛋白衍生物的反应(4)IFN-γ产后抑郁症;μg·100毫升−1;史坦顿血清研究所,哥本哈根,丹麦)使用IFN-γ执行有关酶联免疫斑点板板。所有化验孵化了16 - 20 h。
如果测量IFN-γ
IFN-γ浓度测量中如果胸膜液上层清液使用QuantiFERON®酶联免疫试剂盒。
统计分析
分类变量和连续变量比较使用适当的参数和非参数测试。的McNemar检验法卡方测试被用来比较不同诊断检测的敏感性和特异性21。确定更新的测试在一个高负担的相对价值,一个回归模型被用来开发一个bioclinical得分22适合一个资源贫乏的设置。因此,确定更新的测试在一个高负担的相对价值,回归模型来确定独立变量与结核病的风险,考虑到研究的历史,体检和胸膜液生化数据(变量被认为是在分析包括年龄、种族、吸烟、艾滋病毒状况,先前的结核病史,细胞计数和胸膜液蛋白质含量)。Multi-colinearity评估,最终模型的变量导致了最适合,最省钱的和广泛使用在我们的环境中,被保留在最终的模型。最后bioclinical计分规则是由相对或分分配给每个变量包含在最终的多变量模型。报告的研究是使用诊断准确性的标准报告模板(标准)23。
结果
临床、人口数据和生化数据
有48个,19岁,七明确的结核病患者,分别non-TB和可能的结核病。涂片、胸水文化和活检(组织培养和组织学)在一个积极的,27岁和41的48个明确的结核病例,分别根据定义,在没有non-TB病例。没有可能的结核病例都是文化或活检阳性但基于临床怀疑结核病的治疗经验。non-TB组的积液是由于几个原因(两个淋巴瘤,两个骨髓增殖性疾病,九个腺或小细胞癌,三parapneumonic三由于其他原因)。21%(16 74)的患者没有胸膜活检(拒绝由四个病人,禁忌在两个病人,一个人肝脏活组织检查,和9的文化结果是积极的活组织检查完成之前(6痰培养积极的和三个胸膜液体文化积极))。所有学科的研究对象进行艾滋病毒检测,46.4%(56)26日是艾滋病毒阳性患者。临床、人口结构和生化数据列于表1⇓67年的结核病患者或non-TB组计算的敏感性和特异性。
在最后的多元逻辑回归模型中,只有年龄(< 42岁;比值比(或)3.89,95%可信区间(CI) 1.01 - -14.90;p = 0.04)和胸膜液蛋白质含量(> 53 g·L−1;或3.59,95%可信区间1.02 - -12.56;p = 0.04)分别与有关结核病的风险。这些变量纳入bioclinical得分时,有一个最大的敏感性和特异性的54个和89%,分别为(表2所示⇓)。
中位数(第25和第75百分位数)胸膜液细胞计数是1.75×106细胞·毫升−1(1.03×106和5.45×106细胞·毫升−1),平均体积的流体获得20毫升(10到25毫升)。的胸水ADA 96和69%的敏感性和特异性,分别对结核病的诊断和进一步的细节发表在其他地方24。
胸膜液的性能结果如果IFN-γ
中位数的值如果IFN-γ明显高于在结核病与non-TB积液(10.95与0.105 IU·毫升−1;p < 0.001)。在接收机操作曲线(ROC)派生0.31 IU·毫升的分界点−1敏感性,特异性,阳性预测值(PPV)以及阴性预测值(95% CI)如果IFN-γ是97%(85 - 99),100%(81 - 100),100%(90 - 100)和94%(73 - 99),分别。精度是98%(90 - 100)和中华民国是0.99下的面积。散点图和面积的ROC如果IFN-γ水平胸膜液体如图2所示⇓。可能的和明确的结核病例组合在一起时测定的敏感性为98%。
胸膜的性能结果与外周血T-SPOT。®结核病和QFT-TB-GIT
胸膜t细胞化验只能执行63年(85%)的74名患者因为细胞数量不足是孤立的11名患者胸膜液处理阶段(这组细胞计数的中位数是1.3×104细胞·毫升−1和胸膜的平均体积流体收到14毫升)。11个病人,9有明确的结核病;因此,9个(19%)的48个明确的结核病病例不适合t细胞处理。这63名可t细胞试验进行了胸膜液体。
商业干扰素释放(T-SPOT的性能结果。®结核病和QFT-TB-GIT) for pleural fluid (using mononuclear cells for both assays) and whole blood are shown in table 3⇓。的七个疑似结核病例(数据未显示),两个和三个积极的胸膜T-SPOT。®结核病和QFT-TB-GIT结果,分别。胸膜T-SPOT的散点图。®结核病和胸膜单核细胞衍生QFT-TB-GIT化验,包括面积中华民国,如图3所示⇓。总之,胸膜T-SPOT。®结核病检测,与胸膜单核细胞衍生QFT-TB-GIT化验,有更好的灵敏度(80与51%;p = 0.002, McNemar检验法卡方测试),但特异性较差(65与PPV)和94% (83与95%)。
为了提高检测的特异性,我们纠正胸膜抗原t细胞反应的外围抗原t细胞计数(胸膜RD-1点计数/外围点计数率)。这个比例,尽管高结核与non-TB患者相比(6.56与2.37),并不显著(p = 0.11)。根据中华民国(面积0.68的ROC),最优比率3.9分界点是ESAT-6-specific反应,产生的敏感性为64%,特异性75%,因此没有歧视性。
总共63名参与者有至少一个胸膜t细胞试验,和他们的结果分类的疾病状态表4所示⇓。不定数量的结果没有区别使用QFT-TB-GIT胸膜单核细胞衍生测定与胸膜T-SPOT相比。®结核病检测(四个60与6 61;Fisher精确检验,p = 0.40)。进行比较,53胸膜T-SPOT配对。®结核病和QFT-TB GIT化验,在结核病和non-TB主题,如表5所示⇓。
有适度的协议胸膜RD-1化验(56和结核病的53%与non-TB患者,分别)。Inter-assay一致性很差(表5所示⇑;κ= 0.21)。可能的和明确的结核病例组合在一起时,检测的灵敏度保持不变(85和81%与两个T-SPOT 53和50%,分别。®结核病和QFT-TB-GITcut-off points specified in table 3⇑)。
有关酶联免疫斑点反应胸膜HBHA和产后抑郁症
HBHA的性能结果和有关酶联免疫斑点反应,PPD-driven使用胸膜单核调用,如表3所示⇑一起,而数据的散点图面积中华民国f-h如图3⇑。总之,这两种抗原有可怜的歧视性的价值在使用胸膜单核细胞。
胸膜液体IFN-γ反应病人在感染艾滋病毒和免疫之间没有显著性差异(如果IFN-γ值(范围)10.87 (0.7 - -20.1)与12.4 (0.1 - -20.1)IU·毫升−1;QFT-TB-GIT 1.64 (0.0 - -13.2)与0.74 (0.0 - -14.0)IU·毫升−1;ESAT-6 292 (0 - 1250)与每10 420(0 - 1250)证监会6细胞;CFP-10 182 (0 - 1250)与每10 397(0 - 1250)证监会6细胞)。
讨论
在这项研究中我们前瞻性评估四种不同干扰素释放的临床诊断实用程序(有关酶联免疫斑点,RD-1 RD-1 ELISA, HBHA有关酶联免疫斑点)和产后抑郁症使用胸膜液单核细胞,这种比较对胸膜液体如果IFN-γ水平,在南非的疑似患者的结核病。比较研究不同RD-1干扰素释放,评价HBHA反应,迄今为止,还没有进行使用胸膜液淋巴细胞。干扰素释放,在技术上要求更多,也更昂贵,有效执行,在最好的情况下,错过15%的结核病例和错误诊断还有20%。相比之下,如果胸膜液体杰出,IFN-γ水平之间有一个高水平的准确性、结核病和non-TB胸腔积液。IFN-γ的优秀成果证实了其他研究来自非洲以外的地理区域(亚洲、欧洲和南美),已在最近的一项荟萃分析总结6,汇集IFN-γ的敏感性和特异性,如果胸膜液为89%和97%,分别为(个人研究和荟萃分析的结果了6)。我们确认这个发现在非洲艾滋病毒感染。总的来说,这些数据表明,一个医疗点测试将IFN-γ测试诊断的承诺TB-PE高负担的设置。然而,这种方法不允许药敏测定状态,因此,微生物调查在适当的病人可能仍然是必需的。因此,IFN-γ不一定取代的文化水平结核分枝杆菌,但可以作为一个辅助测试快速诊断和可能减少进一步的调查需要排除其他引起的胸腔积液。
最近的两个低负担国家的初步研究(欧洲和日本)建议RD-1-based商业干扰素释放,使用胸膜单核细胞,出现承诺作为TB-PE诊断工具13,14。在过去的几个月里,两个高负担国家的病例对照研究(南非)和使用QFT-TB-GIT已经出版15,16。都表明,QFT-TB-GIT测定敏感度欠佳(分别为27岁,57%)。然而,T-SPOT。®结核病测试,认为更敏感7在这些研究中,没有评估。此外,细节优化和实验室协议的原理尚不清楚,总细胞数的QFT-TB-GIT化验没有控制,胸膜活检并没有或有限的自由裁量权进行算子,从而限制病人分类的准确性。在最近的研究中,进行了初步的实验来确定最佳的细胞数量和抗原浓度,除非拒绝或禁忌,再次行胸膜活检和RD-1商业平台进行评估。
总的来说,T-SPOT。®结核病检测比QFT-TB-GIT试验更敏感,观察外周血符合相似7有关酶联免疫斑点通常被认为是一个,大概是因为更敏感技术9。虽然QFT-TB-GIT PPV很高,它错过了几乎一半的结核病例。相比之下,使用胸膜液如果IFN-γ水平,炎症的非特异性Th1标记,实现了更高的PPV。因此,干扰素释放的特异性是次优尽管TB-specific抗原的使用。我们如何解释这些结果?一种可能性是血液的易位RD-1-specific t细胞,通过发炎或胸膜“漏”,在受试者non-TB胸膜炎(无活动性结核病)伴随的高频率的外围抗原t细胞,因此潜伏结核感染(LTBI)。六个non-TB患者比预期更高的频率抗原t细胞在胸膜空间也有高频的外围抗原t细胞,因此LTBI。有关酶联免疫斑点更容易我们假定,这种效果,因为它是一个更敏感的技术。其他解释为穷人特异性包括瞬态接触结核分枝杆菌在当时的状态的持久性,生物胸膜空间,或双病理学(活动性结核病和恶性肿瘤),尽管在后续(6 - 12个月),我们发现没有与其它诊断结核病的临床证据。补偿外围的频率抗原t细胞或总胸膜单核细胞(胸膜RD-1点计数/外围点计数率)没有显著提高检测的特异性。在这个补偿,我们推断,在活跃的胸膜结核的情况下会有更大比例的抗原细胞,因此比例高,和在LTBI会有更少的情况下这样的细胞,因此比例很低。调整分界点提高了灵敏度特异性但妥协。
相比之下,如果胸膜液体IFN-γ对胸膜结核是高度敏感的和具体的。这个强大的,结核分枝杆菌简况,compartment-specific, Th1反应不是non-mycobacterial或肿瘤抗原的特征。因此,我们相信,基于本文提供的数据和从其他研究6,如果IFN-γ应该作为一个歧视性的诊断工具在临床实践中。现在需要进一步的研究来开发用户友好的格式来衡量如果IFN-γ水平胸膜液体。
最佳的细胞数量和胸膜液体体积需要执行胸膜t细胞化验尚不清楚17。因此,一个额外的我们的研究的目的是阐明这个方面。我们表明,获得足够的细胞数量执行干扰素释放试验的一个重要的现实限制。在大多数情况下,< 10毫升的胸膜液体超过足够的所需的实验。但是,在某些情况下,积液是纤维蛋白的或眼窝内壁,有限体积的胸膜液体获得(< 20毫升)或流体pauci-cellular,从而限制孤立的细胞的数量。额外的因素,可能在高负担更频繁的设置,可能调制可行的细胞的数量获得包括以下:胸膜液体分配不均的细胞,细胞在处理过程中损失,lymphocyte-poor neutrophil-predominant积液,过度的碎片和退化细胞复杂的积液,pauci-cellular HIV阳性个体中胸膜炎症(六的八细胞数量不足,患者进行测试,有高级艾滋病)。因此,对于成功的t细胞进行化验,是至关重要的足够数量的胸膜液体。与以前的报告15,使精确的量化细胞用于实验的数量,我们洗胸膜单核细胞无血清培养系统,re-incubated媒体。这一个额外的好处,减少不确定的结果由于高负控制好/管的读数。只有适度inter-assay协议/一致性,这可能反映了不同的技术(ELISA与ELISPOT),细胞数量和抗原鸡尾酒使用(QFT-TB-GIT额外肽抗原,结核病7.7)。在这项研究中3级容器中的所有样本处理实验室。然而,这并不总是可能的在资源贫乏的环境中安全措施可能符合当地政策法规。
有意义的评估相对临床价值的新的和已建立的测试,我们比较实用简单的bioclinical得分,通过回归分析,生成和相关资源贫乏的环境中25,26。我们也调查了艾滋病毒状况对性能测试结果的影响。所有测试执行同样在艾滋病毒阳性和消极的病人。
有关酶联免疫斑点试验中我们还测试了一个新颖的抗原,HBHA毒性因子,介导绑定的结核分枝杆菌肺泡上皮细胞和其抗原性依赖c端域的甲基化,这是缺席重组HBHA形式19。HBHA回应最近被发现是一个敏感的标志结核感染18,27。因此,我们使用m . smegmatis与质粒向量electroporated生成甲基化结核分枝杆菌HBHA20.,28,29日。人类结核性胸水最近被发现含有anti-HBHA抗体滴定度高30.的效用,但抗原HBHA反应诊断TB-PE是未知的。我们发现一般不良反应较RD-1甲基化HBHA抗原。原因尚不清楚,但可能与胸膜改变流体调节t细胞在TB-PE概要文件31日,这是众所周知的,减弱HBHA反应32,包括提出这种抗原的能力区分潜伏性和活动性结核病18。的微分效应m . smegmatis与结核分枝杆菌甲基化HBHA IFN-γ反应,如果有的话,还不清楚。
调查者偏见在我们的研究是通过几个步骤最小化,保证研究的有效性,包括连续招聘与普遍应用和预先确定入选标准,一个有经验的操作人员盲法临床细节,侵入性程序以确保准确分类的病人和控制子组,并使用一个预先确定的参考标准。然而,我们的研究结果可能是generalisable只设置高结核/艾滋病毒负担。因此,需要进一步和更大规模的研究来评估是否结果是不同的在低负担设置使用确定的截止点,和IFN-γ-related胸膜化验艾滋病病毒感染的影响。高背景LTBI和可能的瞬态感染可能在很大程度上影响t细胞non-TB组的试验结果。
总之,如果IFN-γ是最精确的测试来区分从non-TB积液结核病高负担。这分类群未经选择的病人从一个高负担,抗原t细胞干扰素释放受到次优的准确性,不能孤立足够的单核细胞进行鉴定。
支持声明
k . Dheda支持南非国家研究基金会(SARChI),南非医学研究理事会、欧盟第七框架计划和欧洲和发展中国家临床试验伙伴关系(EDCTP)、开普敦和伦敦大学大学合作倡议。a Zumla在收到资金从欧盟第七框架计划和EDCTP,从全面的生物医学研究中心和国家卫生研究所(英国伦敦),以及从EuropeAID(比利时布鲁塞尔)。
感兴趣的语句
没有宣布。
确认
作者感谢p . Govender h . Khalfey a . Aboo。卡尔(所有部门的医学,Groote Schuur医院,开普敦,南非),r . van Zyl-Smit(医学部门,萨默塞特医院,开普敦),注册护士c·库珀和m .艾萨克斯(医学部门,Groote Schuur医院)为促进病人招聘。我们也感谢美国扎内蒂(生物医学科学部门,萨萨里大学,萨萨里,意大利)和g泼(微生物学研究所圣心天主教大学,罗马,意大利)的pMV 3-38的礼物。
- 收到了2009年1月13日。
- 接受2009年4月7日。
- ©人期刊有限公司