文摘gydF4y2Ba
葡糖氨基葡聚糖(GAG)是至关重要的细胞外基质分子调节组织灵活性,一个参数,减少气道患者的哮喘和慢性阻塞性肺病(COPD)。我们研究了呕吐的表达及其新陈代谢酶主要人类气管平滑肌细胞(ASMC)获得健康的捐赠者(控制)和哮喘或慢性阻塞性肺病患者。gydF4y2Ba
总GAG合成评估(gydF4y2Ba3gydF4y2BaH]葡萄糖胺合并。呕吐是孤立的,纯化,分离的电泳和特征使用特定GAG-degrading酶。分泌透明质酸(HA)的ASMC哮喘或慢性阻塞性肺病患者明显减少与控制。rt - pcr和免疫印迹分析显示,这种减少,显著减少的表达HA synthase-1和2和hyaluronidase-1显著增加。此外,HA受体CD44的表达明显减少,而受体HA-mediated能动性不是表现在哮喘或慢性阻塞性肺病。gydF4y2Ba
我们的结果表明,有一个减少的表达HA在哮喘和慢性阻塞性肺病与协同监管的HA新陈代谢酶调节这些肺部疾病的病理气道重塑。gydF4y2Ba
最近的报告在哮喘和慢性阻塞性肺疾病(COPD)的病理研究提供了明确的证据表明,这两种疾病不能完全解释的基础上对免疫反应,而故障的结构形成细胞和体内平衡的干扰细胞外基质(ECM)分子对这两种疾病的病理学和作出了重大贡献反映气道重塑gydF4y2Ba1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba2gydF4y2Ba。组织改造了结构性变化发生在肺在航空公司由于长期慢性炎症,包括定性或定量细胞密度的变化和ECM的肺上皮细胞的组成、基底膜和黏膜下层。因此,这一修改在ECM影响气道阻力,遵从性和弹性,最终导致肺功能的丧失gydF4y2Ba1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba2gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
最近的研究清楚地表明气道平滑肌细胞的突出贡献(ASMC)哮喘和慢性阻塞性肺病的病理gydF4y2Ba1gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba5gydF4y2Ba。此外,临床研究已经证明,减少ASMC在哮喘患者通过热传导改善生活质量和减少症状和气道炎症从长远来看gydF4y2Ba6gydF4y2Ba,gydF4y2Ba7gydF4y2Ba,从而支持在这个病理ASMC的杰出的作用。气道平滑肌增生包是一个杰出的病理学的广大中航空公司在哮喘和慢性阻塞性肺病的小型航空公司gydF4y2Ba2gydF4y2Ba。此外,我们曾表明ECM-associated葡糖氨基葡聚糖(GAG)发挥核心作用在调节ASMC促有丝分裂的刺激的反应gydF4y2Ba8gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
呕吐是必不可少的成分ECM的肺癌和拥有重要的功能属性。在人类中,七个呕吐已确定:硫酸软骨素(CS),硫酸dermatan (DS), CSC,肝素、硫酸乙酰肝素(HS)、透明质酸(HA)和硫酸角质素(KS)。这些插科打诨的功能各不相同的器官内。发现在人类肺癌、KS顶端表面的纤毛上皮细胞,c和d由上皮和粘膜下腺体细胞分泌,和海关在ECM的气管组织部分gydF4y2Ba9gydF4y2Ba。HA和代谢的酶也内生肺部环境,和HA孤立肺的哺乳动物(羊、豚鼠和大鼠)gydF4y2Ba10gydF4y2Ba和人类的肺实质和胸膜gydF4y2Ba11gydF4y2Ba。在肺部,HA含量是15 - 150 mg·ggydF4y2Ba−1gydF4y2Ba干重(物种特异性),主要是局部peri-bronchial和inter-alveolar / peri-alveolar组织gydF4y2Ba12gydF4y2Ba。HA在人类肺部分泌物的数量被发现∼66 ng·毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba值范围34 - 423 ng·毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba13gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
哈是一个线性多糖链,二糖重复单位组成gydF4y2BaNgydF4y2Ba乙酰-gydF4y2BadgydF4y2Ba-glucosamine-β(1,4)-gydF4y2BadgydF4y2Ba-glucuronic acid-β(1,3),它既存在于高分子量(1 - 6×10gydF4y2Ba6gydF4y2BaDa)和多分散的低分子质量形式(0.1 - -0.5×10gydF4y2Ba6gydF4y2BaDa),后者在炎症条件下心态占据主导地位gydF4y2Ba14gydF4y2Ba。HA的聚合是由一个或多个的作用三个ΗΑ合成酶(称为HAS1、HAS2 HAS3)gydF4y2Ba15gydF4y2Ba通过加入糖苷剩余工资的减少链肢体。HA是由透明质酸酶代谢(HYAL),主要由HYAL1 HYAL2,存在于各种组织,包括肺gydF4y2Ba13gydF4y2Ba。HA的影响主要是对通过与HA受体CD44的互动,这是主要的HA信号受体介导gydF4y2Ba16gydF4y2Ba,而且HA-mediated受体的能动性(RHAMM)gydF4y2Ba17gydF4y2Ba。肺成纤维细胞表达的受体gydF4y2Ba18gydF4y2Ba、平滑肌和内皮细胞的正常组织gydF4y2Ba19gydF4y2Ba。在迁移和增殖HA具有不同的生物功能gydF4y2Ba8gydF4y2Ba、胚胎发育、组织形态发生,细胞生长、分化和排卵gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba,以及在疾病进展gydF4y2Ba21gydF4y2Ba。然而,报告HA在慢性炎症性肺疾病的功能作用是相互矛盾的。这可能归因于这样一个事实,大多数研究的表达在慢性炎症性肺疾病阻碍缺乏健康肺组织被用作基本的控制条件。gydF4y2Ba
在目前的研究中,我们使用主要ASMC从健康肺组织(控制)和哮喘或慢性阻塞性肺病患者。我们研究了HA的表达在这些主要细胞,并报告有减少的表达HA ASMC的哮喘和慢性阻塞性肺病患者与控制。这种减少与减少的表达HAS1和HAS2 HYAL1基因和蛋白质水平的表达增加。此外,我们发现RHAMM表示只有ASMC的控制。gydF4y2Ba
材料和方法gydF4y2Ba
细胞培养gydF4y2Ba
ASMC的主要文化建立了从解剖气道肌肉束从孤立的支气管获得10个对照组(器官捐赠者),或从轻度到中度哮喘患者支气管活检11和6个COPD患者,如前所述gydF4y2Ba22gydF4y2Ba。通知书面同意从每个病人获得批准的人类伦理委员会是由悉尼悉尼大学和中央区域卫生服务(悉尼,澳大利亚)。可用的患者的临床特征,包括年龄、性别、诊断、用力呼气量在1 s和医疗在抽样之前,如表1所示gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba。所有患者纳入本研究后被诊断出患有哮喘或慢性阻塞性肺病的全球倡议哮喘(吉娜)和慢性阻塞性肺疾病的全球倡议(黄金)标准定义。gydF4y2Ba
患者的临床特征gydF4y2Ba
ASMC被数和播种密度100000细胞·厘米gydF4y2Ba2gydF4y2Ba在175厘米gydF4y2Ba2gydF4y2Ba烧瓶GAG提取,在25厘米gydF4y2Ba2gydF4y2Ba烧瓶信使rna提取和细胞计数。ASMC的特征是积极为α-smooth肌细胞肌动蛋白免疫染色,calponin,如前所述gydF4y2Ba1gydF4y2Ba。ASMC是生长在杜尔贝科修改鹰中补充5%胎牛血清(FCS), 1%基本媒介维生素、8毫米稳定下来gydF4y2BalgydF4y2Ba谷氨酰胺和10毫米消息灵通的缓冲区(GIBCO BRL;生活技术,悉尼,澳大利亚)。对所有实验,细胞之间使用通道4到9;细胞融合增长到80%,血清剥夺实验前的24小时中含有0.1% FCS。除非另有说明,细胞经常刺激和5% FCS孵化24 h。化验进行样品前刺激(0 h(孵化),样品12 h和24 h后刺激FCS为5%。在存在检测不到发炎0.1% FCS假定为在迹象条件,而刺激与5% FCS假定模拟炎症状态。对比描述之后要么ASMC之间不同的起源,或0.1%至5% FCS ASMC的特定类型。gydF4y2Ba
(gydF4y2Ba3gydF4y2BaH]葡萄糖胺合并gydF4y2Ba
来衡量gydF4y2Ba新创gydF4y2BaGAG合成、subconfluent ASMC在孵化中含有0.1%或5% FCS的(gydF4y2Ba3gydF4y2BaµCi·H]氨基葡萄糖(0.5毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba;Amersham生物科学,小都,英国)24 h。公司的gydF4y2Ba3gydF4y2BaH]氨基葡萄糖呕吐是测量如前所述gydF4y2Ba23gydF4y2Ba。总之,培养基收集和细胞被洗两次冰冷的PBS和细胞溶解与200年μL里帕缓冲区(1%诺乃清洁剂p 40, 1%钠脱氧胆酸盐,0.1%十二烷基硫酸钠(SDS), 0.15 M氯化钠,0.01磷酸钠,pH值7.2)。细胞层(细胞和沉积ECM)和细胞培养基分别收集。样本与0.1 KU链霉蛋白酶消化(gydF4y2Ba链霉菌属将gydF4y2Ba;Calbiochem、苜蓿、瑞士)和总GAG沉淀通过添加乙醇的混合物(最终浓度80%)含有1.3%(重量/体积)醋酸钠(隔夜在4°C)。这之后,样本离心机10000×gydF4y2BaggydF4y2Ba15分钟。颗粒的溶解在0.5 M氢氧化钠和总插科打诨合成计算的基础上(gydF4y2Ba3gydF4y2BaH]氨基葡萄糖纳入插科打诨。gydF4y2Ba
分离、纯化、分离和描述的插科打诨gydF4y2Ba
细胞培养基(20毫升)分开收集细胞层,这是洗两次10毫升的冰冷的PBS和收获刮。呕吐是分离和纯化,培养基和细胞层,如前所述gydF4y2Ba24gydF4y2Ba。总之,脂质提取四卷的氯仿:甲醇(1:2)。有机溶剂被离心去除(3200×gydF4y2BaggydF4y2Ba20分钟4°C)和颗粒与10毫升乙醇洗,离心机(3200×gydF4y2BaggydF4y2Ba20分钟4°C)和干(4 h, 40°C)。1毫升的0.1米的颗粒是resuspended Tris-HCl缓冲区(pH值8.0),包含CaCl 1毫米gydF4y2Ba2gydF4y2Ba和蛋白质消化骨链霉蛋白酶(0.1gydF4y2Ba美国将gydF4y2Ba;Calbiochem) (72 h, 60°C)通过添加等量的链霉蛋白酶在24小时间隔。链霉蛋白酶解得预热(30分钟、60°C)消除任何糖苷酶的活动。DNA消化是通过孵化400 KU DNase我(EC 3.1.21.1;Calbiochem) (16 h, 37°C)。调整后的CaClgydF4y2Ba2gydF4y2Ba浓度为1毫米,反应是停在0.1 KU链霉蛋白酶(60°C, 24 h)。样本然后与10毫米氢氧化钠滴定pH值10.0 - -11.0,和孵化(16 h, 45°C)在1 M NaBHgydF4y2Ba4gydF4y2Ba。样本中和50% (v / v)醋酸和提取的插科打诨的乙醇沉淀的四卷0.1的3 M CH的存在gydF4y2Ba3gydF4y2BaCOONa(一夜之间,4°C)。呕吐在离心(2000×中被发现gydF4y2BaggydF4y2Ba,20分钟)和颗粒溶解在重蒸馏的HgydF4y2Ba2gydF4y2BaO和储存在4°C。比色测定糖羰酸进行根据研究苦和缪尔gydF4y2Ba25gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
总插科打诨的分馏gydF4y2Ba
的呕吐是通过电泳分离醋酸纤维素膜如前所述gydF4y2Ba24gydF4y2Ba。总之,2μL插科打诨的解决方案,包含4μg糖醛酸,放置在原点从阴极侧(10毫米)醋酸纤维素的地带。电泳进行吡啶100毫米/ 470毫米甲酸(pH值3.0)7点mA恒流(70分钟,房间温度)。醋酸纤维素膜电泳之后,阿尔新蓝沾0.2% (w / v),在0.1%醋酸(v / v), 10分钟,用0.1%乙酸(v / v)为20分钟。染色的强度是由一个计算机辅助图像量化分析程序(美国伊士曼柯达公司,罗彻斯特,纽约)。gydF4y2Ba
治疗GAG-degrading酶的纯化聚糖gydF4y2Ba
Speed-vacuum干呕(5μg糖醛酸)孵化的最后一卷15μL下列之一。1)Heparinase:样品溶解在100毫米Tris-HCl CaCl缓冲区(pH值7.0)包含3毫米gydF4y2Ba2gydF4y2Ba和孵化(15 h, 30°C)与4×10gydF4y2Ba4gydF4y2Ba你肝素裂解酶(EC 4.2.2.7,gydF4y2Ba黄杆菌属肝素gydF4y2Ba;Seikagaku,日本东京)。2)Heparitinase:样品溶解如前所述孵化(16 h, 43°C)与4×10gydF4y2Ba−4gydF4y2BaU硫酸乙酰肝素裂解酶(heparitinase: EC 4.2.2.8,gydF4y2Baf .肝素gydF4y2Ba;Seikagaku)。3)Chondroitinase ABC:样品溶解在100毫米Tris-HCl缓冲区(pH值8.0)包含50毫米醋酸钠是孵化(16 h, 37°C)与2×10gydF4y2Ba4gydF4y2BaU软骨素ABC裂合酶(EC 4.2.2.4,gydF4y2Ba变形杆菌属寻常的gydF4y2Ba;Sigma-Aldrich化学,Steinheim,德国)。4)Chondroitinase B:样品溶解在100毫米Tris-HCl缓冲区(pH值7.4)孵化(16 h, 37°C)为0.1 U软骨素B裂合酶(gydF4y2Baf .肝素gydF4y2Ba;Sigma-Aldrich化学)。5)Keratanase:样品溶解在50 mM Tris-HCl缓冲区(pH值7.4)孵化(16 h, 37°C)为0.05 U硫酸角质素endo-β-gydF4y2BadgydF4y2Ba牛乳糖(EC 3.2.10.3,gydF4y2Ba假单胞菌gydF4y2Ba物种;Sigma-Aldrich化学)。6)透明质酸酶:样品溶解在20毫米醋酸钠与醋酸缓冲,pH值5.0,是孵化(14 h, 60°C) 4 U透明质酸盐裂合酶(EC 4.2.2.1,gydF4y2Ba链霉菌属hyalurolyticusgydF4y2Ba;Sigma-Aldrich化学)。孵化时间和酶浓度是完全降解所需标准的基质,如前所述gydF4y2Ba26gydF4y2Ba。基质与各自单独孵化缓冲区作为控制。消化是由醋酸纤维素膜电泳和量化评价的计算机辅助图像分析程序伊士曼柯达公司。gydF4y2Ba
测量的哈gydF4y2Ba
净初级ASMC的HA分泌gydF4y2Ba
细胞生长在24-well盘子,洗两次与培养基去除HA积累在细胞生长和孵化24 h。孵化时间,年底能整除的细胞培养基收集和测试数量HA的ELISA (Corgenix、威斯敏斯特有限公司、美国)。短暂,ELISA板涂有HA结合蛋白被孵化与样品或标准(1 h,室温)副本,与洗涤缓冲洗五次,孵化解决方案包含辣根peroxidase-conjugated HA-binding蛋白质(30分钟,房间温度),再洗五次,和孵化100μL衬底的解决方案。30分钟后,反应停止通过添加等量的硫酸(0.36 N),以及光密度测量在450海里(630 nm引用)。gydF4y2Ba
哈总插科打诨的相对数量gydF4y2Ba
总GAG分离和纯化细胞培养基和细胞层,如前所述,和HA的相对数量以整除包含0.1μg糖羰酸的ELISA (Corgenix、彼得伯勒、英国),如前所述。gydF4y2Ba
聚丙烯酰胺凝胶电泳gydF4y2Ba
总呕吐(4μg糖羰酸)分离和纯化ASMC的培养基或细胞层分析4%聚丙烯酰胺凝胶,如前所述gydF4y2Ba26gydF4y2Ba。29公顷225 kDa, CS和57 kDa被用作分子量标记。标记的分子质量以前由分析超速离心法gydF4y2Ba27gydF4y2Ba。凝胶是沾的溶液0.5% (w / v)阿尔新蓝,溶解在25% (v / v)异丙醇和1% (v / v)醋酸,12 h。同样的解决方案没有染料用于使脱色。gydF4y2Ba
rt - pcrgydF4y2Ba
从细胞RNA提取使用RNeasy(试剂盒、希尔登,德国)。总RNA进行逆转录使用moloney小鼠白血病virus-reverse转移酶(表达载体GmbH,生活技术,卡尔斯鲁厄,德国)。5μL反应混合物受到PCR扩增的50μL反应体积,包含25 pmol相关引物,200年μM三磷酸脱氧核苷酸(表达载体GmbH,生活技术),2毫米MgClgydF4y2Ba2gydF4y2Ba和一个单位1×Taq Taq DNA聚合酶的DNA聚合酶缓冲(WI Promega,麦迪逊,美国),在ptc - 100热控制器(MJ研究Inc .)、水城,妈,美国)。所有的引物序列和PCR条件如表2中列出gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba。PCR产品分析了2% (w / v) agrose凝胶。DNA乐队被呈现在ethidium bromide-stained凝胶在紫外线和量化的基础上β-actin mRNA表达,这是放大nonsaturating条件下使用伊士曼柯达公司的计算机辅助图像分析程序。gydF4y2Ba
引物序列gydF4y2Ba
免疫印迹分析gydF4y2Ba
总蛋白提取准备从80% ASMC汇合的。10μg蛋白质溶解在Laemmli缓冲区,变性(95°C, 5分钟),在冰上冷却(5分钟),离心机(13000×gydF4y2BaggydF4y2Ba,50年代),并应用在4 - 15% sds - page电泳。蛋白质被转移到聚偏二氟乙烯膜(Bio-Rad实验室、大力神、钙、美国)在一夜之间转移50°C,由染色证实与Coomasie蓝色。与PBS薄膜被洗了三次,阻止了5%脱脂奶在PBS (4°C,一夜之间),和孵化的主要抗体(CD44: sc - 59909, RHAMM: sc - 16170, HYAL1: sc - 101340, HAS1: sc - 23145, HAS2: sc - 66916;从圣克鲁斯生物技术公司,圣克鲁斯,美国CA)一夜之间在4°C。膜被洗了三次(5分钟/次)阻断缓冲区和孵化二级抗体在室温下为90分钟(CD44: sc - 2005;RHAMM: sc - 2020;Hyal-1: sc - 2005;HAS1: sc - 2020;HAS2: sc - 2004;圣克鲁斯生物技术有限公司)。 Before bands were visualised the membranes were washed three times with PBS and then soaked in SuperSignal West Pico Chemilluminescent Substrate (cat 34077; Thomas Fisher Scientific Inc., Rockford, IL, USA). To visualise the protein bands the membranes were exposed to Bio-Max-ray films (Eastman Kodak).
蛋白质的测定gydF4y2Ba
整除的蛋白质含量测定细胞培养基标准布拉德福德化验(Bio-Rad、阿弟克公司、瑞士)使用牛血清白蛋白(Sigma-Aldrich化学)作为标准。gydF4y2Ba
统计分析gydF4y2Ba
计算机软件SPSS 16.0(美国SPSS Inc .,芝加哥,IL)是用于所有统计计算和分析。正态分布的数据是使用Kolmogorov-Smirnov检查分析。所有的参数数据进行分析重复测量的方差分析。如果重要,方差分析是紧随其后gydF4y2Ba事后gydF4y2Ba多个比较控制和其他组Dunett的测试。非参数数据进行分析与克鲁斯卡尔-沃利斯检验而弗里德曼的测试被用于相关样本。双尾水平的意义被用于所有统计计算。检查测量的重现性变异系数的因素。所有数据都表示为±gydF4y2Ba扫描电镜gydF4y2Ba的意思。差异被认为是具有统计学意义,p < 0.05, p < 0.01, p < 0.001。gydF4y2Ba
结果gydF4y2Ba
ASMC的描述gydF4y2Ba
在光学显微镜下,ASMC的控制,哮喘病患者和慢性阻塞性肺病患者似乎纺锤形,椭圆形的细胞核含有核仁中部,显示典型的“山和山谷”扩散模式在文化(数据没有显示)。所有细胞显示光滑均匀的染色阳性收缩蛋白α-smooth肌肉肌动蛋白和calponin,如前所述gydF4y2Ba1gydF4y2BaASMC,表明这些细胞。gydF4y2Ba
总ASMC咽分泌物和沉积gydF4y2Ba
测量总插科打诨的合成,gydF4y2Ba3gydF4y2BaH]葡萄糖胺合并显示,检测不到发炎下迹象条件(在存在0.1% FCS)没有显著差异的分泌和沉积总GAG ASMC在控制和哮喘或慢性阻塞性肺病患者(图1gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。然而,在炎症条件下(细胞刺激5% FCS),总插科打诨的分泌增加在所有三组(图1gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba),但这种影响只是重要的分泌插科打诨的控制ASMC(2150±250每分钟0.1% FCS计数gydF4y2Ba与gydF4y2Ba3151±625 cpm FCS为5%,p < 0.05;图1一个gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
总糖胺聚糖(GAG)分泌和沉积主要气道平滑肌细胞(ASMC)控制、哮喘和慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者。)Subconfluent(80%)主要ASMC孵化了0.1%(□)或5%(▓)胎牛血清(FCS)的存在gydF4y2Ba3gydF4y2BaµCi·H]氨基葡萄糖(0.5毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba为24小时)。总咽分泌和细胞外基质沉积被确定为每分钟计数。为每个病人的实验进行了一式三份。误差线代表的意思是±gydF4y2Ba扫描电镜gydF4y2Ba10个健康的捐赠者,11个患者哮喘和慢性阻塞性肺病患者6。gydF4y2Ba#gydF4y2Ba:p < 0.001与0.1% FCS;* *:p < 0.01与控制;* * *:与控制相比p < 0.001。b)代表在醋酸纤维素膜电泳淌度的分析呕吐(G1 G4)分离和纯化的主要ASMC两个健康的捐赠者,两个哮喘患者和两个慢性阻塞性肺病患者。总GAG分离和纯化后24 h刺激5% FCS从细胞培养基(左凝胶)或细胞层(右手凝胶)。迁移的商用标记由左边的箭头表示。HA:透明质酸;海关:硫酸乙酰肝素;DS: dermatan硫酸;CS:硫酸软骨素。 c) Quantitation of Alcian blue intensity using a computer-assisted analysis program. Error bars represent the mean±扫描电镜gydF4y2Ba一式三份的决定为每一个病人。* *:p < 0.01;* * *:p < 0.001。之间的统计差异显示控制和哮喘或慢性阻塞性肺病在细胞培养基和细胞层,分别。▒:控制;░:哮喘;□:慢性阻塞性肺病。gydF4y2Ba
此外,当刺激有5% FCS, ASMC哮喘或慢性阻塞性肺病患者咽分泌显著低于ASMC的控制(3240±475、2310±315和1980±325控制,哮喘和慢性阻塞性肺病,分别;为控制p < 0.01gydF4y2Ba与gydF4y2Ba哮喘和p < 0.05为控制gydF4y2Ba与gydF4y2Ba慢性阻塞性肺病(图1)gydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
识别ASMC的插科打诨gydF4y2Ba
的醋酸纤维素膜电泳4μg糖羰酸总插科打诨的孤立的细胞培养基的控制公司,24小时与5% FCS刺激后,导致四个不同人口插科打诨,分配G1、G2、G3、G4(图1 bgydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba),迁移与流动一样哈,HS,分别DS和CS。酶处理与特定GAG-degrading酶(表3所示gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)证实,G1哈,G2 HS, G3 DS和G4 CSA和/或CSC。亦发现了相同的插科打诨ASMC的细胞培养基从哮喘和慢性阻塞性肺病患者获得(图1 bgydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba)表明没有质的差异的本质总咽分泌ASMC的控制和哮喘或慢性阻塞性肺病患者。然而,定量的阿尔新蓝染色使用计算机辅助图像分析程序表明HA分泌显著减少ASMC的细胞培养基相比,哮喘和慢性阻塞性肺病患者控制(图1 cgydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
酶治疗糖胺聚糖(GAG)降解酶总插科打诨的主气道平滑肌细胞分离和纯化gydF4y2Ba#gydF4y2Ba
我们进一步分析了呕吐存入ASMC的细胞层健康肺组织和哮喘或慢性阻塞性肺病患者。三个不同的插科打诨数量被确定,以酶治疗哈,HS和DS(图1 bgydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba表3,gydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba)。定量的阿尔新蓝染色的强度表明,HA的数量在ASMC的细胞层沉积显著降低哮喘和慢性阻塞性肺病与控制(图1 cgydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
减少分泌HA ASMC的哮喘和慢性阻塞性肺病患者gydF4y2Ba
由于HA是最丰富的咽分泌或由所有三组主ASMC存放,因为有迹象表明阿尔新蓝染色的醋酸纤维素膜HA减少哮喘和慢性阻塞性肺病,我们进一步测量HA分泌的净额ASMC 12和24小时后的孵化ELISA。与控制相比,ASMC哮喘或慢性阻塞性肺病患者分泌显著降低大量的HA后12 h(3.7±0.25, 1.6±0.17, 1.5±0.25μg哈·1000个细胞gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba分别控制,哮喘和慢性阻塞性肺病;p < 0.01)(图2gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)和24小时的潜伏期(5.1±0.35,3.8±0.30,2.7±0.25μg哈·1000个细胞gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba分别控制,哮喘和慢性阻塞性肺病;p < 0.02和p < 0.01哮喘和慢性阻塞性肺病)(图2gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
针对疾病的分泌和相对数量的透明质酸(HA)由人类气管平滑肌细胞。a)的分泌量公顷用ELISA测定整除的细胞培养基12 h(▓)和24 h后(□)。b) HA的相对量是由ELISA整除的总糖胺聚糖(GAG)包含0.1μg糖羰酸在细胞培养基(▪)和细胞层(░)。决定对每个病人进行了一式三份。误差线代表的意思是±gydF4y2Ba扫描电镜gydF4y2Ba10个健康的捐赠者,11个哮喘患者和6个慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者。* *:p < 0.01;* * *:p < 0.001。之间的统计差异显示控制和哮喘或慢性阻塞性肺病。gydF4y2Ba
0.1公顷的相对含量μg总分泌的糖醛酸或沉积呕吐也用ELISA测定。我们观察到的数量哈以咽分泌显著低于哮喘(6.32±0.8 ng / 0.1μg糖羰酸,p < 0.01)和慢性阻塞性肺病(7.57±1.8 ng / 0.1μg糖羰酸,p < 0.02)和控制(11.77±1.5 ng / 0.1μg糖羰酸)(图2 bgydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba)。此外,HA的数量,以呕吐沉积在细胞层显著低于哮喘(4.55±0.6 ng / 0.1μg糖羰酸,p < 0.01)和慢性阻塞性肺病(6.12±1.4 ng / 0.1μg糖羰酸,p < 0.02),与控制(9.72±1.2 ng / 0.1μg糖羰酸)(图2 bgydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
基因和蛋白质表达HYAL1 HAS1和HAS2减少而表达的增加哮喘和慢性阻塞性肺病gydF4y2Ba
由于HA分泌和沉积减少哮喘和慢性阻塞性肺病,我们试图进一步调查的表达HA新陈代谢酶通过rt - pcr。如图3所示gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba、不同的表达gydF4y2BaHas1gydF4y2Ba,gydF4y2BaHas2gydF4y2Ba和gydF4y2BaHas3gydF4y2Ba。由图像分析定量PCR结果程序显示的表达gydF4y2BaHas1gydF4y2Ba显著降低ASMC的哮喘病人0,12或24小时(p < 0.05)或慢性阻塞性肺病患者经过24小时的潜伏期(p < 0.05),与控件(图3 bgydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。gydF4y2BaHas2gydF4y2BaASMC mRNA表达也显著减少哮喘或慢性阻塞性肺病患者(p < 0.05),与控制(图3 cgydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。没有明显差异gydF4y2BaHas3gydF4y2BaASMC之间表达不同的起源(图3 dgydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。免疫印迹实验使用HAS1抗体和HAS2表明酶的蛋白表达降低哮喘和慢性阻塞性肺病与控制(图3 egydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba),确认的结果rt - pcr分析。gydF4y2Ba
特异表达的透明质酸合成酶(已经)气道平滑肌细胞(ASMC)。一)代表mRNA的表达gydF4y2BaHas1gydF4y2Ba,gydF4y2BaHas2gydF4y2Ba,gydF4y2BaHas3gydF4y2Ba和gydF4y2Baβ肌动蛋白gydF4y2BaASMC刺激5%胎牛血清在24小时。光密度b)的比率gydF4y2BaHas1 /β-actingydF4y2Bac)gydF4y2BaHas2 /β-actingydF4y2Ba和d)gydF4y2BaHas3 /β-actingydF4y2Ba。c和d的表达很低),乘以10的值。▪:控制;▓:哮喘;□:慢性阻塞性肺病(COPD)。*:p < 0.05;* * *:p < 0.001。之间的统计差异显示在每个时间点控制和哮喘或慢性阻塞性肺病。误差线代表均值±gydF4y2Ba扫描电镜gydF4y2Ba一式三份决定的gydF4y2Ba有/β-actingydF4y2Ba比例计算从公司成立10健康的捐赠者,11哮喘和六名慢性阻塞性肺病患者。e)代表gydF4y2BaHAS1gydF4y2Ba和gydF4y2BaHAS2gydF4y2Ba通过免疫印迹蛋白质含量调查。Glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶(GAPDH)作为加载控制。gydF4y2Ba
Hyal1gydF4y2Ba,gydF4y2BaHyal2gydF4y2Ba和gydF4y2BaHyal3gydF4y2Ba也表达了ASMC的所有三组(图。4gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。定量PCR结果显示的表达gydF4y2BaHyal1gydF4y2Ba(图4 bgydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba从哮喘)是增加ASMC 24小时(p < 0.05)和慢性阻塞性肺病患者0,12和24小时(p < 0.01),与控制。的表达没有明显差异gydF4y2BaHyal2gydF4y2Ba(图4 cgydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)或gydF4y2BaHyal3gydF4y2Ba(图4 dgydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)ASMC之间不同的起源。免疫印迹实验使用抗体gydF4y2BaHYAL1gydF4y2Ba表明蛋白质的表达这种酶是诱导哮喘和慢性阻塞性肺病与控制(图4 egydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba),确认的结果rt - pcr分析。gydF4y2Ba
透明质酸酶的特异表达(Hyal)气道平滑肌细胞(ASMC)。一)代表mRNA的表达gydF4y2BaHyal1gydF4y2Ba,gydF4y2BaHyal2gydF4y2Ba,gydF4y2BaHyal3gydF4y2Ba和gydF4y2Baβ肌动蛋白gydF4y2Ba在ASMC刺激5%胎牛血清超过24小时。光密度b)的比率gydF4y2BaHyal1 /β-actingydF4y2Bac)gydF4y2BaHyal2 /β-actingydF4y2Ba和d)gydF4y2BaHyal3 /β-actingydF4y2Ba。▪:控制;▓:哮喘;□:慢性阻塞性肺病(COPD)。*:p < 0.05;* * *:p < 0.001。之间的统计差异显示在每个时间点控制和哮喘或慢性阻塞性肺病。误差线代表均值±gydF4y2Ba扫描电镜gydF4y2Ba一式三份决定的gydF4y2BaHyal /β-actingydF4y2Ba比例计算从公司成立10健康的捐赠者,11哮喘和六名慢性阻塞性肺病患者。e)代表gydF4y2BaHYAL1gydF4y2Ba通过免疫印迹蛋白质含量调查。Glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶(GAPDH)作为加载控制。gydF4y2Ba
HA在哮喘和慢性阻塞性肺病分子质量低于控制gydF4y2Ba
我们进一步调查如果HYAL1的微分表达式,HAS1和HAS2 ASMC导致哮喘或慢性阻塞性肺病患者HA的不同分子质量与控制。我们执行页面分析4μg总插科打诨的分离和纯化ASMC GAG相比不同的起源和已知的分子质量(图5所示gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。HA的迁移与透明质酸酶治疗后被确认的样品之前页面(数据未显示)。我们发现HA孤立的细胞层控制ASMC与5% FCS刺激后24 h,迁移后的平均分子质量> 700 kDa,而HA的哮喘和慢性阻塞性肺病ASMC表现出较低的平均分子质量250 kDa(图5所示gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。类似的结果哈孤立的细胞培养基。这些结果表明,哮喘和慢性阻塞性肺病与HA的存在肺中分子质量低于HA在健康的肺。gydF4y2Ba
测定分子量的透明质酸(HA) 4%的页面在细胞层和细胞培养基。代表结果页面后总粘多糖(GAG)对应于4μg糖羰酸。凝胶与阿尔新蓝染色和HA的迁移,由透明质酸酶治疗,由黑色的箭头表示。插科打诨的灰色箭头表示迁移与已知的分子质量。巷1:控制;巷2:哮喘;巷3:慢性阻塞性肺疾病。gydF4y2Ba
针对疾病的基因和蛋白质表达HA受体CD44, ASMC RHAMMgydF4y2Ba
此外,我们研究了ASMC HA受体的转录。rt - pcr分析显示,gydF4y2BaCD44gydF4y2Ba被ASMC持续表达的不同的起源(图。6 cgydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。定量PCR结果显示的表达gydF4y2BaCD44gydF4y2Ba减少细胞的哮喘病人24小时之后,这个结果有统计学显著性(p < 0.01),治疗5% FCS (p < 0.05,图6 agydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。ASMC在慢性阻塞性肺病患者gydF4y2BaCD44gydF4y2Ba12 h后mRNA水平显著降低(p < 0.02),治疗24小时5% FCS(图6gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。免疫印迹实验证实了rt - pcr分析结果。如图6所示gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba哮喘和慢性阻塞性肺病,CD44蛋白表达降低与控制。gydF4y2Ba
特异表达的透明质酸(HA)由气管平滑肌细胞受体(ASMC)。光密度的比率)gydF4y2BaCD44 /β-actingydF4y2BaHA-mediated能动性和b)受体(gydF4y2BaRhammgydF4y2Ba)gydF4y2Ba/β-actingydF4y2Ba。▪:控制;▓:哮喘;□:慢性阻塞性肺病(COPD)。误差线代表均值±gydF4y2Ba扫描电镜gydF4y2BaASMC的一式三份决定10捐助者、11哮喘和六名慢性阻塞性肺病患者。*:p < 0.05;* *:p < 0.01;* * *:p < 0.001。之间的统计差异显示在每个时间点控制和哮喘或慢性阻塞性肺病。c)代表mRNA的表达gydF4y2BaCD44gydF4y2Ba,gydF4y2BaRhammgydF4y2Ba和gydF4y2Baβ肌动蛋白gydF4y2Ba公司与5%胎牛血清刺激后在24小时。d)代表gydF4y2BaCD44gydF4y2Ba和gydF4y2BaRHAMMgydF4y2Ba通过免疫印迹蛋白质含量调查。Glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶(GAPDH)作为加载控制。gydF4y2Ba
信使rna编码的rt - pcr分析gydF4y2BaRhammgydF4y2Ba透露,这是表示只有通过控制ASMC(图6 cgydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba)。的表达gydF4y2BaRhammgydF4y2Ba控制在24 h (ASMC显著增加5% FCS治疗了近五倍(p < 0.01;图6 bgydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba)。有趣的是,ASMC的哮喘或慢性阻塞性肺病患者没有表达gydF4y2BaRhammgydF4y2Ba在任何时间点调查(图6 cgydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba)。这些结果也证实了免疫印迹实验。如图6所示gydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba,RHAMM蛋白不表达ASMC从哮喘和慢性阻塞性肺病患者。gydF4y2Ba
讨论gydF4y2Ba
哮喘和COPD的发病机制包括慢性气道炎症和气道重塑。改造过程的主要功能包括:纤维化sub-epithelial地区和附近的间质组织的航空公司;肌细胞肥大和增生;myofibroblast增生;粘液化生;血管异常;和气道壁增厚gydF4y2Ba2gydF4y2Ba。然而,一些与哮喘和COPD气道重构的问题仍有待澄清。这些包括所涉及的分子和细胞活动的序列,每个方面的贡献的改造过程的临床症状、病理和气道重塑的可能性代表一个愈合和修复反应方面的发病机理。此外,精确的贡献个人的ECM分子气道重构产生的哮喘或慢性阻塞性肺病表型没有充分定义的。在此,我们试图澄清后,我们提出了数据微分周转率HA在超导公司不同的起源,采用健康肺组织为基本控制条件。ASMC从哮喘或慢性阻塞性肺病患者分泌降低大量分散的哈,这是与减少相关基因和蛋白质表达HAS1和HAS2 HYAL1基因和蛋白质表达的增加、减少的基因和蛋白质表达CD44和缺乏HA受体RHAMM,相比与ASMC正常肺组织。低水平的HA ASMC涉及减少tissue-water内容和灵活性,这可能有助于扩展支气管狭窄和刚度的航空公司在哮喘和慢性阻塞性肺病。gydF4y2Ba
肝素、dermatan和CS,以及哈,在场ASMC的控制和哮喘或慢性阻塞性肺病患者。这些结果与肝素的出现的报道协议,软骨素和DS在气管组织部分gydF4y2Ba9gydF4y2Ba和HA的人类肺gydF4y2Ba11gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba13gydF4y2Ba。然而,我们观察到总GAG合成减少ASMC的哮喘和慢性阻塞性肺病患者相比控制。这可能归因于净HA含量的减少或降低HA浓度相对于总GAG ASMC病变。的分泌减少或沉积HA显然是由于HA合成减少和增加公顷退化,因为rt - pcr分析和免疫印迹显示显著减少的表达HAS1 HAS2和显著增加表达HYAL1 ASMC哮喘和慢性阻塞性肺病的患者比控制。我们的研究结果提供的证据表明,减少水平的HA与哮喘和慢性阻塞性肺病。gydF4y2Ba
怎么能减少HA水平有助于哮喘和COPD的发病机制?事实上,有相当多的证据表明,HA具有多向性的肺保护作用。HA拥有独特能力,链接和保留水分子在inter-fibrillar空间gydF4y2Ba通过gydF4y2Ba渗透压和流动阻力,从而有利于非晶的结构胶态矩阵融合在一起的细胞和结缔组织纤维gydF4y2Ba10gydF4y2Ba。这提供了HA与水合物的能力和控制溶质运输和microcirculatory交往,由于其影响孔隙体积,水力传导性和大分子扩散gydF4y2Ba28gydF4y2Ba。HA的其他生理功能包括筛和排斥的与蛋白质交互作用(屏障效应),ECM的稳定结构通过静电相互作用,润滑通过其流变特性,增加弹性蛋白降解的黏膜纤毛的清除和预防gydF4y2Ba10gydF4y2Ba。此外,健康的肺HA刺激睫毛的间隙,在顶端表面保持稳态酶,结合和稳定肺表面活性剂分子gydF4y2Ba29日gydF4y2Ba。HA企稳在ECM蛋白聚糖gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba,有利于组织修复gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba迁移,抑制,多形核白细胞和单核细胞的趋化性和聚合gydF4y2Ba31日gydF4y2Ba的肺弹性蛋白,防止弹性蛋白酶降解机制的保护涂层gydF4y2Ba32gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
HA的生物功能指向支气管组织的保护作用,这与我们的观察HA却降低了ASMC的哮喘和慢性阻塞性肺病患者。在这种背景下,HA阻止急性支气管狭窄引起的人类嗜中性粒细胞弹性蛋白酶在羊gydF4y2Ba33gydF4y2Ba,单剂量吸入HA提出预防运动性哮喘患者的支气管收缩gydF4y2Ba12gydF4y2Ba。此外,在慢性阻塞性肺病患者gydF4y2Ba34gydF4y2Ba或elastase-induced肺气肿gydF4y2Ba35gydF4y2Ba、治疗与HA有有益的影响。感兴趣的是另外两个插科打诨,肝素和商品,也被报道在哮喘治疗的机制是有益的行动,不是抗凝产权直接相关gydF4y2Ba36gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
与HA肺生理保护作用,它也被报道说:血清HA水平没有差异患者哮喘或喘息与正常对照组相比gydF4y2Ba37gydF4y2Ba;吸入低分子质量公顷(0.15×10gydF4y2Ba6gydF4y2BakDa)没有显著预防运动性哮喘患者的支气管收缩gydF4y2Ba38gydF4y2Ba;有肺分泌物的HA含量的增加哮喘gydF4y2Ba39gydF4y2Ba和慢性阻塞性肺病gydF4y2Ba13gydF4y2Ba病人gydF4y2Ba。gydF4y2Ba然而,这些显然是矛盾的报告可能解释如下:1)血清HA水平不一定反映肺中HA含量;2)是高分子量HA对受益人的影响;3)低分子质量-0.5公顷(0.3×10gydF4y2Ba6gydF4y2Ba在炎症条件下kDa)占主导地位gydF4y2Ba14gydF4y2Ba;4)肺分泌物的HA含量的增加哮喘和慢性阻塞性肺病患者可能反映了增强的退化和后续secreation哈,增加表达的结果gydF4y2BaHyal2gydF4y2Ba在慢性阻塞性肺病患者gydF4y2Ba13gydF4y2Ba和gydF4y2BaHyal1gydF4y2Ba在ASMC这里报告。gydF4y2Ba
HA的理由保护作用的高分子量的肺进一步支持的报告,HA低分子质量高但不抑制肺泡的功能gydF4y2Ba40gydF4y2Ba和腹膜巨噬细胞gydF4y2Ba41gydF4y2Ba活性氧引起的,杯状细胞化生在正常人类支气管上皮细胞与HA相关解聚gydF4y2Ba42gydF4y2Ba。此外,HA低但不高的分子质量延长生存的嗜酸性粒细胞,刺激的合成factor-β转变增长gydF4y2Ba1gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba43gydF4y2Ba,诱导表达的细胞因子,趋化因子,诱导巨噬细胞一氧化氮合酶gydF4y2Ba44gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
对HA的大小,我们观察到ASMC哮喘或慢性阻塞性肺病患者表达HA的低分子质量与控制。这可能是由于:1)表达在基因和蛋白质水平的增加HYAL1在哮喘和慢性阻塞性肺病;2)HAS1的表达式和HAS2因为它已经表明,催化率和HA的最终产品分子量不同的三个亚型gydF4y2Ba45gydF4y2Ba。HAS1是最活跃的,并产生公顷0.2 - -2.0×10gydF4y2Ba6gydF4y2BakDa,同时HAS2产生出哈碎片,但催化地更活跃。最后,HAS3产生较小的HA碎片不大于0.1×10gydF4y2Ba6gydF4y2BakDa,可能参与激活信号转导gydF4y2Ba46gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
公顷的大范围的功能在不同的细胞类型是通过其受体介导,CD44和RHAMMgydF4y2Ba16gydF4y2Ba,gydF4y2Ba17gydF4y2Ba。我们的数据表明,CD44在ASMC减少哮喘或慢性阻塞性肺病患者与控制相比,虽然RHAMM不表达的基因或蛋白质水平。已经表明,CD44是主要的细胞表面透明质酸受体和需要清晰透明质酸在肺损伤产生的降解产物gydF4y2Ba47gydF4y2Ba。因此,它可能会假定CD44的表达我们在哮喘和慢性阻塞性肺病报告可能与受损的间隙有关肺的低分子量的透明质酸,导致持续的炎症。gydF4y2Ba
哈哈还结合RHAMM,控制HA对细胞迁移的影响,扩散和能动性,显然gydF4y2Ba通过gydF4y2Ba与细胞骨架RHAMM交互gydF4y2Ba48gydF4y2Ba,gydF4y2Ba49gydF4y2Ba。还有待阐明如果缺乏RHAMM哮喘和慢性阻塞性肺病与HA在肺功能受损有关,这可能会导致病理生理变化导致的疾病。gydF4y2Ba
总之,现有的文献和本文提供的结果,使用健康肺组织作为基本控制条件,表明高分子量的HA是参与肺功能的生理方面,虽然是支离破碎的哈,由于HAS1表达降低,HAS2 HYAL1表达的增加,导致哮喘和慢性阻塞性肺病病理炎症过程。gydF4y2Ba
支持声明gydF4y2Ba
本研究支持格兰特将军秘书处的研究和技术的希腊(03ΕΔ950)和瑞士国家基金会(3200 b0-105737/1)。gydF4y2Ba
感兴趣的语句gydF4y2Ba
没有宣布。gydF4y2Ba
确认gydF4y2Ba
我们想感谢c . Pourzitaki她宝贵的协助执行的统计分析数据。gydF4y2Ba
- 收到了gydF4y2Ba2008年5月8日。gydF4y2Ba
- 接受gydF4y2Ba2009年2月24日。gydF4y2Ba
- ©人期刊有限公司gydF4y2Ba
引用gydF4y2Ba
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