抽象的
有临床证据表明,糖皮质激素可能对重症肺炎有用,但解释这些有益作用的致病机制尚不清楚。
本研究的目的是确定将糖皮质激素添加到严重肺炎的实验模型中对抗生素治疗的影响。
总共有15只Lagerwhite-Landrace仔猪96小时通风。插管后,含有75mL溶液假单胞菌铜绿假单胞菌(10.6.cfu·毫升-1)经支气管镜接种。接种12 h后随机分为3组:1)不处理;2)环丙沙星治疗;3)环丙沙星加甲强的松龙治疗。在整个研究过程中监测生理和实验室参数。测定血清和支气管肺泡灌洗(BAL)中的促炎细胞因子。进行肺组织病理学检查及血、肺、肺泡培养。
在研究结束时,接受抗生素加糖皮质激素的仔猪显示:1)白细胞介素-6的浓度降低;2)Bal和肺组织的全球细菌负担的降低。
综上所述,在本肺炎实验模型中,糖皮质激素与抗生素的联合可减轻局部炎症反应,降低肺部细菌负担。
需要机械通气的严重社区或医院收购肺炎的死亡率非常高1那2.此外,尽管抗微生物治疗和支持措施进展,但这率在过去几年中没有发生变化3.-5.这表明,其他因素也会导致不良结果。宿主炎症反应在细菌感染进化中的作用已被证明是至关重要的,免疫细胞释放细胞因子和其他炎症介质对清除入侵的病原体非常重要。然而,过度释放这些介质可能对宿主有害,特别是对肺有害。不同的临床研究表明,支气管肺泡灌洗液或血清中相关炎症细胞因子的浓度与肺炎严重程度有关6.那7..还表明,这些细胞因子的持续升高在严重肺炎和急性呼吸窘迫综合征(ARDS)中具有预后的影响7.-10.
糖皮质激素(GCs)可降低局部和全身炎症反应。这些化合物抑制白细胞和单核-巨噬细胞聚集到受影响的区域11,并影响肺炎炎症反应相关多种细胞因子的表达和活性,包括白细胞介素(IL)-1β、IL-6和肿瘤坏死因子(TNF)-α12.
不同的有争议的结果产生了关于在儿茶胺依赖性化脓性休克患者低至中等剂量下延长GC治疗的益处的强烈辩论13那14和急性肺损伤和ards15-17.此外,GC授权在严重时显示Pneumcystis jiroveci肺炎18.此外,Confalonieriet al。19报道在重症社区获得性肺炎(CAP)患者中,持续静脉滴注低剂量氢化可的松可提高生存率。
多种因素可能影响重症肺炎患者的炎症反应和预后,特别是接受机械通气的患者。从这个意义上说,重症肺炎动物模型的可用性可能会极大地提高对炎症反应机制的认识和对药理学干预效果的理解。此外,GCs对肺炎炎症反应的调节作用及其潜在的微生物学和组织病理学后果可能会得到更好的阐明。
马奎特et al。20.在通风仔猪中标准化了肺炎的动物模型。该模型非常类似于人类肺炎,并已被证明对评估与严重肺炎的诊断和治疗相关的不同方面非常有用21-27.用该动物模型复制了重症肺炎,并研究了高浓度接种后的炎症反应假单胞菌铜绿假单胞菌28,最致命的致病微生物,无论是帽和呼吸机相关的肺炎2那8.那29.
目前的作者假设,联合使用抗生素的GCs可能会降低局部和全身的炎症反应,从而对肺炎的严重程度产生有益的影响。
因此,本研究的目的是研究GC在抗生素治疗之外的潜在益处,在实验性肺炎模型中铜绿假单胞菌在通风的小猪。特别有趣的是确定GCs对炎症反应(局部肺和系统血清)以及对临床、微生物和组织病理学变量的影响。
方法
动物的准备
选取19头3月龄、体重20±2 kg的健康家猪,经气管插管麻醉。经中线骨盆切开术将耻骨上尿管置入膀胱内,行股动脉插管监测压力及采血,股静脉置管持续输液。将仔猪置于俯卧位,机械通气4 d。呼吸机参数包括潮气量(V.T.) 10 mL·kg-1,15呼吸呼吸频率·min-1,吸气时间33%,吸气氧分数(F我,o.2),呼气末正压为0,如前所述28.
支气管接种
动物接种75 mL含106.菌落形成单位(CFU)·mL-1致病铜绿假单胞菌ATCC 27853,易受环丙沙星(最小抑制浓度0.5μg·mL-1).输注15 mL经支气管镜通道均匀分布于各肺各叶。
研究设计
为了确定GCS对不同临床,微生物和组织病理学变量以及炎症参数的影响,在接种后,将动物随机分为三组12小时铜绿假单胞菌。第一组由五只动物单独接受血清(对照组)。第二组包括接受五只动物注射。每12小时(CIP组)和第三组每12小时(CIP组)和第三组接受氯氟沙星(200mg)注射。每12小时加入环丙沙星(200mg)加上GCS(注射。甲基己酮0.5mg·kg-1每12 h;CIP + GC组)。按照本研究方案,各组仔猪机械通气84 h28.前12小时死亡的仔猪被排除在研究之外。
端点
对三组动物在不同时间点的临床、血流动力学和生化数据、呼吸力学、血清和BAL液中的炎症介质(TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8和c反应蛋白(CRP))、肺组织病理病变的类型和程度以及定量细菌学研究进行评估。研究设计的概要显示在图1中⇓.
![图。1-](http://www.qdcxjkg.com/content/erj/32/4/1037/F1.medium.gif)
通风仔猪中的测定和不同干预措施的示意图。GC:糖皮质激素;BAL:支气管肺泡灌洗。
研究者知道特定的药物分配,但生化、生物学、微生物学和组织病理学研究是盲目进行的。
抽样和程序
心率,血压,体温,机械通风参数(气道压力,静态肺顺应性30.和F我,o.2、动脉血气(IL-1306;在0、2、6、12、24、36、48、60、72、84和96 h监测血清电解质(钠、钾)和乳酸浓度。分别于0、24、48、72和96 h获得血液生化指标(葡萄糖、肌酐、尿素、胆红素、天冬氨酸转氨酶和丙氨酸转氨酶)和血细胞计数。
经支气管镜通道灌注5份20毫升的无菌生理盐水(0.9% NaCl),然后于0 h(前一分钟)用手抽吸铜绿假单胞菌接种)在右中叶。
炎症参数
C-反应蛋白
使用CRP试剂盒(Biosystems SA, Barcelona, Spain)定量测定血清和BAL液中的CRP。
血液和BAL流体中的细胞因子
采用ELISA法测定猪血清和BAL上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8水平(R&D Systems Inc., Minneapolis, MN, USA)。
在插管时和研究结束时测定BAL细胞因子和CRP水平。分别于插管时及插管后24、48、72、96 h检测血清细胞因子和CRP。
牺牲和后验尸学习
第4天在全身麻醉下处死注射。氯化钾输注。
肺标本的集合
死后,动物保持机械通风到标本收集的时间。肺部通过宫颈癌中线切口无菌地暴露。在宏观上更具保存和更多涉及的肺裂片中进行了BAL。将BAL样本加工用于细胞因子测量和定量细菌培养物。此后,至少一种肺组织标本(3厘米3.)从上述肺叶(保存较完好且受累较重)中取出,同时肺部保持充气状态。标本分成两部分进行细菌学和病理学研究。
细菌学研究
立即进行血液培养和定量BAL和肺组织培养物后验尸随着机械通气留下的动物。
如其他地方所述,处理BAL和肺组织标本的定量细菌培养物31根据推荐的实验室方法32.
通过计算从保存较好的肺叶和受累较重的肺叶(包括肺泡液和肺组织)采集的不同细菌计数样本的中位数来评估总体细菌负担。
病理学研究
肺组织按标准方法处理。根据先前公布的标准对肺炎病灶进行分级33在以下的年级。0:没有肺炎;1:脓性黏液堵塞;2:毛细支气管炎;3:肺炎(实变同时伴有多形核白细胞、纤维蛋白渗出物和细胞碎片进入肺泡间隙的显著积累);4:合流性肺炎(沿不同次叶延伸);5:脓肿性肺炎(细胞坏死与细胞结构破坏共存)。肺炎仅限于后三种类型。根据观察到的最差的类别对每个标本进行分类。
统计分析
所有数据均表示为平均值±sd或者意味着±SEM,作为适当的。使用CHI方向测试进行比较定性或分类变量。使用单向ANOVA测试进行比较三组之间的定量变量。使用弗里德曼非参数测试比较时间的定量变量。P值<0.05被认为是统计学意义(所有双尾)。
机构委员会批准
所有动物都是按照布宜诺斯艾利斯大学(阿根廷布宜诺斯艾利斯)医院(Clínicas " José de San Martín ")的道德委员会和调查指导方针以及实验室动物护理和使用指南进行治疗的34.
结果
在排除4只在随机化前12小时死亡的动物后,共对15只动物进行了研究。
接种后临床血液动力学变化和呼吸力学铜绿假单胞菌(在随机化之前)
由于接种的结果铜绿假单胞菌,在研究的动物中观察到一系列临床,血液动力学,肺部力学和煤气交换改变(n = 15)。如图2所示⇓,观察到早期体温和心率升高,在12小时显著。动脉血氧饱和度(P.啊,一个2)/F我,o.2在12小时后值显著下降,反映了肺气体交换的显著损害。接种后的静态柔度值也有所下降,但差异未达到统计学意义。平均动脉压未见变化。
![图2-](http://www.qdcxjkg.com/content/erj/32/4/1037/F2.medium.gif)
a)温度,b)心率,c)动脉氧张力(P.啊,一个2)/吸气氧含量(F我,o.2), d)后12 h的静态顺应性假单胞菌铜绿假单胞菌对所有仔猪进行接种研究(n = 15)。数据用平均值±表示sd.p值来自弗里德曼配对测试。a)和c)p <0.001;b)p = 0.001;d)p = 0.09。
特定治疗的结果
如上所述,接种后12小时铜绿假单胞菌,这些动物被随机分为三组。当两组进行比较时,在连续的生理测量中没有观察到显著的变化。然而,在实验室参数方面,CIP+GC组的血糖水平(96 h)和白细胞计数(84和96 h)均升高(表1)⇓).其余的实验结果没有发现差异(数据未显示)。
呼吸力学和气体交换
与对照组和CIP组相反,CIP+GC组的动物在静态顺应性方面表现出了进步(图3)⇓).气的交换,体现在P.啊,一个2/F我,o.2对照组和CIP组的比例均受损。相比之下,CIP+GC组的动物表现出了离散性的改善P.啊,一个2/F我,o.2比例尽管与其他两组的差异没有达到统计学意义(图3⇓).所有组的pH值、碳酸氢盐和乳酸值都保持在正常范围内(数据未显示)。
![图3-](http://www.qdcxjkg.com/content/erj/32/4/1037/F3.medium.gif)
a)动脉氧气张力(P.啊,一个2)/吸气氧张力(F我,o.2)比例和B)研究的三组仔猪中的静态顺应性测量。结果表示为12至96小时的变化百分比假单胞菌铜绿假单胞菌接种。使用ANOVA测试获得p值。CIP:CiProfloxacin组;CIP + GC:CiProfloxacin Plus Glucocorcoids组。a)p = 0.32;b)p = 0.01。
肺和全身炎症反应
在基线下,在BAL流体中任何不同细胞因子的浓度中没有观察到差异(图4⇓).在研究结束时,观察到不同细胞因子水平的增加,在对照组中浓度最高,而CIP组中这些细胞因子的水平始终低于对照组。有趣的是,CIP+GC组中细胞因子水平最低,IL-6浓度差异有统计学意义(图4)⇓).BAL液中CRP浓度遵循同样的模式,在基线时较低且均匀,对照组96 h时显著升高,CIP组中度升高,CIP+GC组升高最低(图4)⇓).
a)白细胞介素(IL)-1β,b)IL-6,C)IL-8,D)肿瘤坏死因子(TNF)-α和e)C-反应蛋白(CRP)在基线的肿瘤坏死因子(CRP)的价值在研究的研究结束时(96小时)在三组仔猪(▪:控制;▒:环丙沙星;□:环丙沙星加糖皮质激素)。数据用平均值±表示SEM..在基线时,三组的值总是相同的(p>0.1)。96 h后,方差分析的p值如下:A) p = 0.40;B) p = 0.03;C) p = 0.19;D) p = 0.30;和e) p = 0.41。
与在BAL流体中观察到的相反,在血清中评估的细胞因子的动态上没有观察到一致的图案(图5⇓).24 h后观察各组血清IL-8水平的差异(p = 0.04)。
![图5 -](http://www.qdcxjkg.com/content/erj/32/4/1037/F5.medium.gif)
a)白细胞介素(IL)-1β, b) IL-6, c) IL-8, d)肿瘤坏死因子(TNF)-α和e) c反应蛋白(CRP)在整个研究中被显示为环丙沙星组(•);环丙沙星加糖皮质激素组(▴)及对照组(□)。数据用平均值±表示SEM..每24 h采用方差分析比较三组间的差异。*: p < 0.05。
微生物学
微生物学研究结果见表2⇓.在对照组中,Bal和肺部培养证明铜绿假单胞菌在所有评估的样本中。相比之下,在治疗组(CIP和CIP+GC)中,铜绿假单胞菌在5只动物中只有2只从BAL液中分离出来。肺组织培养显示有铜绿假单胞菌除了每组的一只小猪外,所有的小猪都是如此。CIP+GC组BAL和肺培养的总细菌负荷均显著降低(p = 0.03和p = 0.01;图6⇓).
![图6 -](http://www.qdcxjkg.com/content/erj/32/4/1037/F6.medium.gif)
a)支气管肺泡灌洗(BAL);表示为log菌落形成单位(cfu)·mL-1)和b)在肺组织中(用log cfu·g表示-1).CIP:CIPROFLOXACIN;GC:糖皮质激素。使用ANOVA测试获得p值。a)p = 0.03;b)p = 0.01。
除了一个对照动物外,血液培养物在所有仔猪中都是阴性的,患有阳性培养物铜绿假单胞菌.
讨论
本研究的结果在动物模型的肺炎由于铜绿假单胞菌提示在靶向抗生素治疗中加入系统性GC可减少肺相关炎症反应和细菌肺负担。
最近的临床证据表明,低剂量氢化可的松可降低重症CAP的死亡率19那35.GCs可能通过抵消严重肺部感染中炎症介质的过度释放而发挥有益作用。在本研究中,环丙沙星和GC对仔猪肺中IL-6的浓度有抑制作用。这种衰减比只接受靶向抗生素的动物更明显。CIP+GC组BAL中的炎症介质水平与接种细菌前的基线水平相当,提示GC具有有效的抗炎作用,特别是在IL-6方面。在本模型中没有观察到严重脓毒症的迹象,这可能证明了缺乏重要的全身炎症反应。
用环丙沙星和GC处理的动物不仅具有减毒的局部炎症反应;值得注意的是,它们还具有比其他两组动物的较低的BAL和肺部细菌计数,建议在两个化合物相关时更有效的细菌根除能力。实际上,减少0.5 log cfu·ml-1和0.8 log cfu·g-1与仅用环丙沙星治疗的动物相比,CIP+GC组动物的平均BAL和肺组织细菌负荷有所增加。虽然这两组动物的数量少,排除了统计学上的比较,但从临床角度来看,这种减少可能是显著的。事实上,对其他类型呼吸道感染的人体研究表明,细菌负荷和肺部炎症反应均有相应的降低36.
同时施用环丙沙星和GC的有益效果也提出了肺样品组织病理学分析中的目前的研究结果。用环丙沙星和GC处理的动物在用环氟苯甲酸处理的动物中,仅评价的30%的裂片中显示出肺炎。此外,肺炎,定义为脓肿或融合的肺炎,其在CIP + GC组中的肺活组织检查中存在于60%的肺活检中,而用环丙沙星处理的动物30%。同样,虽然差异没有统计学意义,但可能由于所研究的少量动物,这些结果可能具有临床意义。
Meduriet al。37在一个在体外研究表明某些细菌菌株,如铜绿假单胞菌细菌暴露在这些细胞因子下会增强它们的生长和毒性。gc可以恢复过度炎症产生的吞噬细胞受损的能力。将人单核细胞(U937)细胞暴露于浓度逐渐升高的脂多糖(LPSs)可增强不同种类细菌的胞内存活和复制,包括铜绿假单胞菌37.更重要的是,当暴露于甲基己酮醇的甲基羟基甲醇的渐进浓度时,先前用LPS刺激的U937细胞能够以浓度依赖性方式抑制细菌复制。最后,通过用甲基己酮酮处理这种细胞,减少了LPS活化细胞中TNF-α,IL-1β和IL-6的mRNA水平37.
这些研究加强了严重肺炎的动物模型中的目前研究结果,并提示通过GC的给药可能对吞噬细胞通过过度炎症反应来消除细菌的损伤能力。
必须考虑一些方法论考虑因素,以便对结果进行适当的评估。动物模型不能反映严重肺炎发病机制的所有物理病理学方面,一种动态过程,涉及广泛的病原体和与有利于细菌生长的宿主防御的复杂相互作用38.此外,在先前健康的动物中外源性给予高细菌接种并不一定反映肺炎发展的复杂性。
此外,由于GC治疗和反弹效应引起的潜在有害的副作用以及它们的逐渐变细在炎症过程的演变中的反弹效应是激烈的辩论的重要事项14那16那39-41.从这个意义上说,在发热反应迟钝的情况下未能识别或延迟识别感染是一种严重的威胁。此外,在使用GCs作为辅助治疗时,还必须考虑其他不良事件,如高血糖和神经肌病。在这方面,严格的感染监测规划和确定最佳的GC使用剂量可以有所帮助。在本研究中,在接受GCs的动物中观察到白细胞计数增加和血糖水平升高。然而,在使用类固醇剂量时没有观察到其他显著的副作用。
最后,目前的作者认识到机械通气可能确实改变炎症反应。众所周知,机械通风具有很高的安全性V.T.可加重急性肺损伤或ARDS患者的肺损伤。在没有预先存在肺损伤的患者中,通气的效果并不是很明显42.当然,在本研究中不能排除机械通气对观察到的炎症反应有一定的影响。然而,这一因素的潜在影响可能部分抵消了这一事实,即比较的三组动物使用相同的通风设置。
总之,在通风仔猪的肺炎的目前实验模型中,向有针对性的抗生素治疗添加糖皮质激素减少了局部炎症反应并降低了肺部细菌负担,并且可能改善肺炎的组织病理学严重程度。这些效应可能与临床观点有益。进一步的研究是阐明哪些患者可能从糖皮质激素中受益,而且还需要有什么最佳的剂量和治疗持续时间,以获得炎症反应的有益和有害影响之间的适当平衡。
支持声明
这项工作得到了西班牙肺科和胸外科学会(SEPAR)、Mutual Mèdica de Catalunya i Balears (MMCB)、Fondo de Investigación Sanitaria (FIS) PI 050136、FIS PI 030113、CIBERes和IDIBAPS的支持。
兴趣表
没有宣布。
- 收到了2008年1月19日。
- 公认2008年5月9日。
- ©ers Journals Ltd