摘要GydF4y2Ba
气道树突状细胞(DC)是肺免疫应答的关键调节因子。然而,关于人类肺部疾病中气道树突状细胞特征的信息有限。GydF4y2Ba
使用四色流式细胞术分析来自非吸烟对照组和结节病、特发性肺纤维化(IPF)和肺炎(存在或不存在免疫抑制)患者的支气管肺泡灌洗液(BALF)中的浆细胞样DC(PDC)和髓样DC(MDC)。GydF4y2Ba
与对照组相比,有免疫力的肺炎患者BALF中pDC计数显著增强。相反,免疫功能低下的肺炎患者BALF中的pDC计数甚至低于对照组。这种差异不能用气道中不同的趋化环境来解释;所有肺炎患者的特征是BALF中pDC吸引趋化因子CXC趋化因子配体10的浓度显著升高。IPF患者的DC亚型百分比正常。然而,IPF患者的MDC不如对照组成熟(CD83阳性)。结节病患者气道中CD1a阴性MDC的独特增加。此外,结节病患者MDC上共刺激分子的表达发生改变(CD80表达增加,CD86表达减少)。GydF4y2Ba
这些数据表明,人类肺部炎症性疾病与气道树突状细胞的不同表型和募集有关。GydF4y2Ba
树突状细胞(dc)是专业的抗原提呈细胞,具有启动和调节特异性免疫反应的独特能力GydF4y2Ba1.GydF4y2Ba. 在肺部,它们在气道内和周围形成高度敏感的哨兵网络。通过不断地从气道向肺淋巴结报告抗原信息,它们能够上调或下调肺部的免疫反应GydF4y2Ba2.GydF4y2Ba. 人类树突状细胞通过大量表达主要组织相容性复合物II类(人类白细胞抗原(HLA)DR)和缺乏淋巴细胞、自然杀伤细胞、单核细胞和粒细胞谱系标记来鉴定。它们目前被分为两个发育和功能不同的亚群:CD11c阳性髓样DC(MDC)和CD123阳性浆细胞样DC(PDC)GydF4y2Ba2.GydF4y2Ba. CD1a阳性DC已被确定为人支气管肺泡灌洗液(BAL)中MDC的一个亚组GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba. 这些CD1a阳性DC在其细胞因子谱和指导T细胞分化的能力方面似乎不同于CD1a阴性MDCGydF4y2Ba4.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba.GydF4y2Ba
根据动物模型,气道树突状细胞在哮喘等疾病中发挥关键作用GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba. 然而,有关树突状细胞在人肺中作用的信息有限。目前可用的研究描述了哮喘患者的DCGydF4y2Ba3.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba–GydF4y2Ba9GydF4y2Ba,毛细支气管炎GydF4y2Ba10GydF4y2Ba和慢性阻塞性肺疾病(COPD)GydF4y2Ba11GydF4y2Ba相比之下,缺乏关于人类肺部其他炎症性疾病中气道树突状细胞及其与健康对照的关系的信息。只有关于结节病患者淋巴结中树突状细胞存在的报道GydF4y2Ba12GydF4y2Ba和肺部肺炎患者的肺部薄壁组织GydF4y2Ba13GydF4y2Ba,GydF4y2Ba14GydF4y2Ba.在哮喘患者中,最近已经建立了一种综合的流式细胞术方法,用于量化和表征人类BALF中的DCSGydF4y2Ba3.GydF4y2Ba. 使用这种方法,本研究首次描述了结节病、特发性肺纤维化(IPF)、肺炎患者和健康对照者气道DC的表型。GydF4y2Ba
方法GydF4y2Ba
参与者GydF4y2Ba
对106名因疑似结节病、间质性肺病或肺炎而转介到德国罗斯托克大学肺气科的患者进行BALF检查。在这些患者中,有35例符合目前结节病、IPF或肺炎的标准,并被纳入目前的研究。病人被诊断为结节病如果他们显示典型的临床和放射学(I或II阶段)结节病的迹象,没有证据表明在transbronchial肺活检标本或BALF结核病或其他肺部疾病,和一个增强的百分比(> 20)BALF的淋巴细胞CD4: CD8比率> 3。根据美国胸科学会/欧洲呼吸学会的共识标准诊断为IPF188bet官网地址GydF4y2Ba15GydF4y2Ba1)排除肺纤维化的其他原因;2) 肺功能测试中的气体交换受限和受损;3) 高分辨率计算机断层扫描显示双基底网状结构异常,与常见的间质性肺炎相一致;4)经支气管肺活检标本和支气管肺泡灌洗液未显示任何特征以支持替代诊断。患者根据以下标准被诊断为肺炎:1)14天内出现呼吸困难和/或咳嗽 支气管镜检查前天;2) 显示肺炎的放射学和临床体征;3)血清C反应蛋白水平升高(>5 μg·mLGydF4y2Ba−1.GydF4y2Ba)免疫抑制被定义为存在化疗诱导的中性粒细胞减少(<0.5×10)GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba中性粒细胞·mL血液GydF4y2Ba−1.GydF4y2Ba)和/或使用免疫抑制剂(皮质类固醇、环孢素或霉酚酸酯)治疗。作为对照,招募了12名健康非吸烟志愿者(纳入标准:无吸烟史、无呼吸道疾病史和无常规药物)。所有参与者都给出了书面知情同意书。这项研究得到罗斯托克当地伦理委员会的批准。GydF4y2Ba
支气管肺泡灌洗GydF4y2Ba
BAL使用柔性支气管镜进行(德国汉堡奥林巴斯)。支气管镜被楔入右中叶的一个亚段(对照组和结节病或IPF患者)或一个受影响的叶(肺炎患者),共100个 注入mL预热的无菌生理盐水。BALF通过轻轻抽吸恢复。GydF4y2Ba
流式细胞术和ELISAGydF4y2Ba
BALF样本通过两层无菌纱布过滤到无菌塑料瓶中,并离心10分钟 500倍时的最小值GydF4y2BaGGydF4y2Ba在4°C条件下,对上清液进行酶联免疫吸附试验(ELISA),并将细胞重新悬浮在PBS(pH 7.2). BALF差异细胞计数如前所述测定GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba. 如前所述,使用四色流式细胞仪分析新鲜分离的BALF细胞GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba,使用表中详述的抗体面板 1.GydF4y2Ba⇓GydF4y2Ba.BALF中的DCS的特异性术语对图1中的每种疾病和对照进行了详细描述GydF4y2Ba⇓GydF4y2Ba.GydF4y2Ba使用适当的同型对照抗体在直方图图中量化表面分子,以区分特异性和非特异性抗体染色(数据未显示)。CC趋化因子配体(CCL)20和CXC趋化因子配体(CXCL)根据制造商(美国明尼苏达州明尼阿波利斯研发系统公司)的说明,使用ELISA在BALF上清液中测量10种浓度。GydF4y2Ba
统计分析GydF4y2Ba
大多数参数为非正态分布。因此,使用Spearman相关系数进行相关分析,并使用Mann–Whitney U检验对各组间的BALF参数进行比较。p值<0.05被认为是显著的。CD1a阴性MDC的百分比通过从CD11c阳性DC的百分比中减去CD1a阳性DC的百分比来计算。GydF4y2Ba
结果GydF4y2Ba
患者特征GydF4y2Ba
参与者的人数、年龄和性别以及BALF特征详见表 2.GydF4y2Ba⇓GydF4y2Ba.结节病1例(原吸烟者),IPF 4例(原吸烟者2例,现吸烟者2例),肺炎亚组免疫抑制2例(原吸烟者),肺炎亚组无免疫抑制2例(现吸烟者),吸烟史阳性。吸烟史阳性的患者均无COPD迹象。亚组分析显示,对照组和患者之间观察到的DC特征差异不受患者吸烟史的影响(数据未显示)。在10例结节病患者中,6例(60%)为I期,4例(40%)为II期。经支气管活检标本显示7例(70%)患者出现非干酪样上皮细胞肉芽肿。在结节病患者的差异细胞计数或DC特征方面,I期和II期之间没有观察到差异(数据未显示)。在所有的IPF患者中,经支气管活检标本没有产生具体的发现。在一名患者中,进行了开放肺活检,确诊为通常的间质性肺炎。GydF4y2Ba
在17例肺炎患者中,10患者满足了免疫抑制的目前标准。所有免疫抑制患者患者在症状之前直接接受了泼尼松龙。两名患者接受了肾移植的免疫抑制治疗(两种情况下,两种情况下的泼尼松龙,环孢菌素和霉酚酸酯Mofetil),另外8名患者用于以下血液疾病:多发性骨髓瘤(n = 2),急性或慢性骨髓性白血病(n = 3), acute or chronic lymphoblastic leukaemia (n = 2), and B-cell non-Hodgkin’s lymphoma (n = 1). Four of the haematological patients suffered from neutropenia following aggressive chemotherapy (which included prednisolone), and the other four were treated with prednisolone and cyclosporin after allogeneic stem cell transplantation and did not suffer from neutropenia. In all immunocompetent patients with pneumonia (n = 7), there was circumstantial evidence for a bacterial origin of the infection; bronchial secretions were purulent, and the patients responded promptly to antibiotic treatment. Microbiological evaluation of the BALF from this group yielded positive results in three out of seven cases (including肺炎支原体GydF4y2Ba,GydF4y2Ba肺炎衣原体GydF4y2Ba和GydF4y2Ba嗜肺军团菌GydF4y2Ba).免疫抑制患者表现为支气管肺炎或非典型浸润。对这组BALF的微生物学评价在10例中有7例产生了阳性结果(包括GydF4y2Ba铜绿假单胞菌GydF4y2Ba,GydF4y2Ba烟曲霉GydF4y2Ba,GydF4y2Ba白色念珠菌GydF4y2Ba和GydF4y2BaPneumocystis jiroveciGydF4y2Ba).GydF4y2Ba
BALF中的树突状细胞亚群GydF4y2Ba
CD1a阳性DC在所有研究的BALF中共同表达CD11c(数据未显示)。结节病患者和健康对照组之间的pDC和mDC总百分比没有差异。然而,结节病患者中CD1a阴性mDC的数量与对照组相比显著增加(表1) 3.GydF4y2Ba⇓GydF4y2Ba;无花果。 2⇓GydF4y2Ba)BALF中的DC亚群在IPF患者和对照组之间没有显著差异(表1) 3.GydF4y2Ba⇓GydF4y2Ba;无花果。 2⇓GydF4y2Ba).免疫功能正常的肺炎患者的特征是BALF pDC数量独特增加,pDC:mDC比率显著增加。相反,与对照组相比,免疫功能低下的肺炎患者BALF PDC数量减少(表1) 3.GydF4y2Ba⇓GydF4y2Ba;无花果。 2⇓GydF4y2Ba).免疫抑制患者中BALF MDC数量的降低可归因于CD1A阳性子集的降低(图2GydF4y2Ba⇓GydF4y2Ba).GydF4y2Ba
DC表面标记GydF4y2Ba
控制装置BALF DCs上的表面标记表达如表所示 4.GydF4y2Ba⇓GydF4y2Ba. 血液DC抗原(BDCA)-3和-4标记物对BALF中的MDC或PDC没有特异性,在对照组中也没有特异性(表1) 4.GydF4y2Ba⇓GydF4y2Ba)也不适用于任何患者组(数据未显示)。CD80、CD86和CD83在对照组的PDC上弱表达(表1) 4.GydF4y2Ba⇓GydF4y2Ba)和患者(数据未显示)。由于大多数患者和对照组的PDC数量较低,因此无法可靠地对其进行量化。在患者中,表面标记物分析包括PDC和MDC上的CD40、CD80、CD83和CD86,以及MDC上的BDCA-1和-3。然而,免疫抑制组BALF中的表面分子无法可靠分析,因为大多数患者的PDC和MDC数量非常少。因此,在分析中省略了这些数据。CD40(在PDC和MDC上)和BDCA-3在MDC上的表达在可分析组之间没有差异(数据未显示)。结节病患者MDC上CD80表达增加。相反,MDC的CD83和CD86水平显著降低(图。 3.GydF4y2Ba⇓GydF4y2Ba).IPF的特征是CD83表达降低,而CD80、CD86和BDCA-1表达正常(图3)GydF4y2Ba⇓GydF4y2Ba).无免疫抑制的肺炎与DC表面分子的显著正常表达相关(图3)GydF4y2Ba⇓GydF4y2Ba).GydF4y2Ba
BALF中的趋化因子GydF4y2Ba
为了阐明DC募集的机制,我们测量了对照组和患者BALF上清中DC吸引趋化因子CCL20和CXCL10的浓度(图4)GydF4y2Ba⇓GydF4y2Ba).对照组BALF上清中均未检测到这两种趋化因子。在IPF和肺炎(有或没有免疫抑制)患者中,CCL20水平升高。IPF患者与肺炎患者的CCL20水平无显著差异(图4)GydF4y2Ba⇓GydF4y2Ba)相反,趋化因子CXCL10在肺炎患者中特异性和强烈升高。值得注意的是,CXCL10浓度的增加并未受到免疫抑制的显著影响(图。 4.GydF4y2Ba⇓GydF4y2Ba)然而,只有在免疫功能正常的肺炎患者中,而在免疫抑制患者中,CXCL10浓度与BALF中pDC百分比之间存在正相关趋势(r = 0.63;p = 0.12).GydF4y2Ba
讨论GydF4y2Ba
本研究是第一个描述患者在患有结节病,IPF和肺炎的患者中的通风DC的分布和表面标记表达,并将这些调查结果与健康对照的患者进行比较。利用综合流式细胞识标方法,用于分析人类BALF中的DC子集GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba,在这些疾病中发现了不同的气道DC表型。此外,在气道中发现了dc吸引趋化因子的差异表达。因此,本研究为人类肺部炎症性疾病中气道树突状细胞的特征和募集提供了新的见解。由于大多数BALF样本中DC计数较低,本研究无法获得关于气道DC表达的额外表面分子的信息,这些信息对进一步表征其功能非常重要。因此,为了揭示这些树突状细胞的功能特性,还需要进一步的研究。GydF4y2Ba
目前关于肺树突状细胞病理生理学的知识主要来源于动物研究GydF4y2Ba2.GydF4y2Ba.尽管最近在人肺匀浆中DC的表征方面取得了一些进展GydF4y2Ba16GydF4y2Ba,GydF4y2Ba17GydF4y2Ba肺实质GydF4y2Ba18GydF4y2Ba–GydF4y2Ba20GydF4y2Ba目前,人类气道树突状细胞的具体特征尚不清楚。目前对人类肺部疾病中气道DCs的研究是在哮喘、毛细支气管炎和COPD患者中进行的GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba10GydF4y2Ba,GydF4y2Ba11GydF4y2Ba.在本研究中,分析了结节病、IPF和肺炎患者气道树突状细胞的发生率和表型,并将这些结果与健康志愿者的结果进行了比较。部分患者(25%)这些患者中,但没有一个对照组有阳性吸烟史,这可能会影响两组之间的可比性。然而,亚组分析表明,观察到的DC表型差异并非由吸烟引起的。GydF4y2Ba
在哮喘患者中,最近有研究表明BALF中所有cd1a阳性的DCs都共同表达CD11c,因此得出结论,cd1a阳性的DCs代表了人类mDCs的一个子集GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba.此外,显示出具有人类血液中的MDC(BDCA-3)和PDCs(BDCA-4)的两个BDCA(BDCA-3和-4)GydF4y2Ba21GydF4y2Ba,对于人类BALF中的相应亚群而言,不是特异性的GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba在本研究的对照组和患者中,CD11c在所有CD1a阳性DC上的共表达以及BDCA-3和-4的非特异性表达与先前的数据相似GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba因此,目前对健康志愿者和结节病、IPF和肺炎患者的观察证实了先前对哮喘患者研究的三个一般发现:1)CD1a阳性DC代表气道MDC的一个子集;2)BDCA-3也通过气道PDC表达,因此不是气道MDC的特异性标记物;3)BDCA-4也由气道MDC表达,因此不是气道PDC的特异性标记物。GydF4y2Ba
因此,人气道中的MDC可分为CD1a阳性和阴性MDC。CD1a阳性和阴性单核细胞衍生DC的细胞因子谱和T细胞刺激能力明显不同的证据证实了这一分类GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba.1996年范·哈斯特的研究GydF4y2Ba等GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba假设cd1a阳性和cd1a阴性辅助细胞在人类BALF中代表不同的功能实体,尽管所描述的cd1a阴性细胞群体可能包含DCs和单核细胞。因此,为了确定这些DCs在人类气道中的作用,还需要对来自人类BALF的纯化cd1a阳性和阴性DCs进行功能分析。然而,范·哈斯特的研究GydF4y2Ba等GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba研究表明,来自人BALF的CD1a阴性辅助细胞是细胞因子白细胞介素-1和-6以及肿瘤坏死因子(TNF)-α的有效产生者,而CD1a阳性细胞则不是。在结节病患者中,观察到气道内CD1a阴性mDC数的特异性增加。有趣的是,结节病与白细胞介素-1和-6以及TNF-α的产生增加有关GydF4y2Ba22GydF4y2Ba,GydF4y2Ba23GydF4y2Ba因此,观察到的CD1a阴性MDC的增加可能有助于这种细胞因子分布。免疫组化数据支持CD1a阴性MDC参与结节病发病机制的假设,显示人类上皮样细胞肉芽肿中的所有DC(在与肿瘤相关的结节病反应和结节病患者的肉芽肿中)CD1a阴性GydF4y2Ba24GydF4y2Ba. 值得注意的是,结节病患者的肺泡巨噬细胞可表达共刺激分子(如CD86和CD80),而健康对照组的巨噬细胞几乎不表达共刺激分子。鉴于肺泡巨噬细胞上HLA-DR的表达,这些数据表明肺泡巨噬细胞可以在结节病患者中获得抗原呈递能力GydF4y2Ba25GydF4y2Ba因此,DC和巨噬细胞在结节病发病机制中的相对作用仍有待阐明GydF4y2Ba26GydF4y2Ba. 值得注意的是,观察到结节病患者气道树突状细胞表达的CD80多于CD86,而此前有报道称结节病患者的巨噬细胞表达的CD86多于CD80GydF4y2Ba25GydF4y2Ba.这些发现点指向Sarcoizosis病变中的呼吸道DC和肺泡巨噬细胞的不同抗原呈现性质。GydF4y2Ba
来自动物模型的证据表明mDCs是肺免疫反应的有效诱导物GydF4y2Ba27GydF4y2Ba而PDC抑制这些反应GydF4y2Ba28GydF4y2Ba. 由此产生的概念是,mDC和pDC是拮抗剂,具有促炎性mDC特性和耐受性pDC特性GydF4y2Ba29GydF4y2Ba最近的报告表明急性上呼吸道感染GydF4y2Ba30GydF4y2Ba急性过敏性气道炎症GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba31GydF4y2Ba与PDC大量流入人体气道有关。这与目前的观察结果一致,即免疫功能正常的肺炎患者气道pDC数量显著增加。相比之下,更为慢性的炎症性疾病,如结节病和IPF,其特征是气道中pDC数量正常。因此,人类PDC似乎特别吸引急性炎症部位。GydF4y2Ba
有几个潜在的刺激因素可以解释这种现象。一方面,人类pDCs可以被病毒或细菌抗原招募和激活GydF4y2Ba32GydF4y2Ba.在目前的研究中,具有免疫能力的肺炎患者显示了疾病的细菌来源的证据。此外,在这些患者中不能排除伴随的病毒感染。因此,pDC数量的强烈增加可能是由于呼吸道中细菌和病毒抗原的释放。另一方面,pdc大量流入呼吸道也可能是由于吸引pdc的趋化因子在支气管内释放。确实,在肺炎患者的气道中发现了强而特异的CXCL10水平升高。CXCL10是趋化因子受体CXCR3的配体,在人类pDCs上强烈表达,已被描述为pDCs的关键趋化因子GydF4y2Ba33GydF4y2Ba,GydF4y2Ba34GydF4y2Ba. 因此,增加支气管内CXCL10浓度可将循环PDC招募到气道中。值得注意的是,一些研究表明,在没有感染的情况下,PDC大量流入气道GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba31GydF4y2Ba因此可以想象,pDC进入气道的主要原因是趋化因子(如CXCL10)的分泌,而不是细菌或病毒抗原的释放。GydF4y2Ba
目前研究的另一个值得注意的结果是免疫肺炎患者中的气道PDC和CD1A阳性MDC数量的强烈降低。值得注意的是,这些患者显示了CCL20的内核浓度,MDC的有效的趋化因子GydF4y2Ba11GydF4y2BaCXCL10是一种pDCs的强效趋化因子GydF4y2Ba33GydF4y2Ba,GydF4y2Ba34GydF4y2Ba,与免疫功能正常的肺炎患者的观察结果相似。这些数据表明,免疫功能低下的肺炎患者并不缺乏吸引DC进入气道的刺激物。因此,免疫抑制更可能损害DC的存活或DC对趋化刺激的反应能力。值得注意的是,免疫功能低下患者的基础疾病存在很大的异质性,但100%的病例使用泼尼松龙治疗。因此,在免疫抑制组中观察到的效果似乎与治疗有关,而不是与潜在疾病有关。这与证明免疫抑制剂(如皮质类固醇)影响气道树突状细胞数量和成熟的报告一致GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba35GydF4y2Ba.PDC比MDC受影响更大的发现可能是因为PDC比MDC更容易接受免疫抑制治疗GydF4y2Ba36GydF4y2Ba. 综上所述,目前的数据表明,免疫功能低下的肺炎患者气道pDC计数非常低,这一现象并不是由于肺炎相关的趋化刺激减少所致。鉴于PDC在肺固有和适应性防御机制中的关键作用GydF4y2Ba32GydF4y2Ba,我们可以推测,气道中积累pDCs的能力降低导致免疫抑制患者呼吸道感染易感性增加。GydF4y2Ba
总之,本研究提供了证据,证明人类肺部炎症性疾病与气道树突状细胞的差异表型和募集有关。有必要开展研究,以确定这些树突状细胞在人类肺部疾病发病机制中的作用。GydF4y2Ba
致谢GydF4y2Ba
作者感谢P.Thamm、J.Brandt、B.Voigt和G.Fastnacht提供的出色技术援助。GydF4y2Ba
脚注GydF4y2Ba
编辑评论见第823页。GydF4y2Ba
- 收到GydF4y2Ba2007年3月26日。GydF4y2Ba
- 认可的GydF4y2Ba2007年6月27日。GydF4y2Ba
- ©ers Journals LtdGydF4y2Ba
参考文献GydF4y2Ba
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