文摘
阐明慢性嗜酸性肺炎的发病机理(CEP)的嗜酸性粒细胞凋亡支气管肺泡灌洗(BAL-Eos)与外周血嗜酸性粒细胞的CEP (PB-Eos) 6例。
嗜酸性粒细胞的存活率和两种类型的嗜酸性粒细胞凋亡细胞的比例进行检测时,发现和白介素5 (IL-5)的影响进行了评估。这些嗜酸性粒细胞的Fas表达在细胞凋亡中的作用也进行了研究。
的存活率BAL-Eos第三天文化显著高于PB-Eos (p < 0.01)。这是降低凋亡细胞的比例比在PB-Eos BAL-Eos;凋亡细胞的百分比在PB-Eos和BAL-Eos孵化24小时后分别为21.7±3.4%和10.6±1.7%。IL-5抑制细胞凋亡,增加PB-Eos和BAL-Eos的存活率。发现的凋亡特征BAL-Eos不同于PB-Eos至少在三个方面。首先,积极的Fas表达PB-Eos提高孵化24小时后,而BAL-Eos没有变化。其次,Fas的表达在PB-Eos被IL-5抑制(18.5±4.2% -8.3±3.2%,p < 0.05),而IL-5未能抑制Fas表达BAL-Eos (3.3±1.6% -3.6±1.0%)。最后,结合抗体PB-Eos Fas抗原诱导细胞凋亡,但不是BAL-Eos。
这些数据表明,Fas PB-Eos似乎参与了细胞凋亡,而BAL-Eos Fas-resistant在慢性嗜酸性肺炎。总之,细胞凋亡的嗜酸性粒细胞可能抑制促炎细胞因子如IL-5导致肺的积累。慢性嗜酸性粒细胞刺激的肺泡空间IL-5可能慢性嗜酸性疾病中起关键作用。
慢性嗜酸性肺炎(CEP)的特点是存在肺间质嗜酸性炎症反应,和大量嗜酸性粒细胞支气管肺泡灌洗(BAL-Eos)1。白介素(IL)的生产增加5似乎嗜酸性肺炎的重要病理生理特征之一2,3。有一些报告表明IL-5 BAL流体(BALF)和IL-5水平降低。决议后的肺嗜酸细胞增多症4,5。
外周血中嗜酸性粒细胞的可行性(PB-Eos)可以保持文化好几天,延长IL-5,和这些发现解释为暗示IL-5延迟凋亡,延长嗜酸性粒细胞的生存6。然而,精确的嗜酸性粒细胞和IL-5肺泡之间的交互空间并不完全理解。尽管一些研究已经进行嗜酸性粒细胞和细胞凋亡之间的关系7- - - - - -9,几乎没有比较细胞凋亡的嗜酸性粒细胞PB, CEP落下帷幕。其他报告显示,减少或抑制细胞凋亡的嗜酸性粒细胞在鼻息肉和支气管哮喘患者的支气管慢性特定的持久性是一个重要的机制嗜酸性粒细胞积累10,11。也怀疑,减少细胞凋亡也可能出现在CEP的肺实质。
本研究的目的是确定是否嗜酸性粒细胞凋亡抑制在CEP肺泡空间。以下评价:1)动力学PB -和BAL-Eos CEP的细胞凋亡;2)在这些细胞IL-5对细胞凋亡的影响;和3)的参与Fas表达。
材料和方法
病人
CEP的诊断是基于病人的历史,体检,射线照相功能,和肺组织中嗜酸性粒细胞增多和落下帷幕。如表1所示⇓6例CEP检查。所有的患者接受类固醇治疗获得PB-Eos BAL-Eos。
细胞分离
外周血白细胞从肝素化静脉血。嗜酸性粒细胞的分离进行了使用不连续密度Percoll列(法玛西亚,乌普萨拉,瑞典)和五个不同浓度,如前所述12。去除残留的中性粒细胞,单克隆抗体对CD - 16,间接的选拔程序使用imunomagnetic珠子(Dynal,奥斯陆,挪威)使用。在涉及肺段落下帷幕了。BALF离心机在每分钟1200转(rpm) 10分钟。落下帷幕也富含嗜酸性粒细胞的不连续密度Percoll列,和胎儿细胞悬浮在10%小牛血清RPMI 1640解决方案。在所有情况下,eosinophil-rich分数> 98%纯,生存能力> 99%。
评价嗜曙红细胞生存和凋亡
嗜酸性粒细胞的可行性被台盼蓝染料排除测试评估后3天37°C的孵化有限公司5%2包含孵化器。IL-5对嗜酸性粒细胞的影响生存也被评估。重组体人IL-5 (10 ng·毫升−1Gibco BRL大岛屿,美国纽约)被用于刺激。在某些情况下,动力学的可行性检查后1、3、5、7天的孵化。细胞凋亡的嗜酸性粒细胞是评估一个annexin-V FITC工具包(Immunotech、马赛Cedex、法国)根据Levi-Schaffer的方法et al。13。短暂,嗜酸性粒细胞培养24小时的存在与否IL-5 (10 ng·毫升−1)、收获和洗与磷酸盐在4000转离心3分钟。的细胞在490年resuspendedµL绑定缓冲(10毫米玫瑰,140毫米氯化钠,2.5毫米CaC12,pH值7.4),和1.25µg propidium碘和5µL annexin-V FITC解决方案增加了。10分钟后孵化在冰上,细胞样本分析使用FACScan流cytorneter(山景城,正欲、钙、美国)。
在Fas表达IL-5嗜酸性粒细胞的影响也被评估。PB-Eos和BAL-Eos培养24 h,然后收获细胞孵化与单克隆抗体对Fas(日本名古屋UB2, MBL) 30分钟。洗后,细胞分析使用FACScan流式细胞分析仪。
在某些情况下,PB-Eos和BAL-Eos培养24 h有或没有对Fas单克隆抗体(MBL CH11,名古屋,日本;300 ng·毫升−1Fas-induced诱导细胞凋亡。细胞凋亡是评估一个annexin-V FITC装备,如上所述。
统计分析
结果表示为平均值±标准偏差(sd)。两组之间的差异被Mann-Whitney测试评估。假定值< 0.05被认为有统计学意义。
结果
为了阐明PB-Eos的存活率和BAL-Eos,他们培养3天,生存能力是由台盼蓝染料排斥。图1⇓表明BAL-Eos的存活率显著高于PB-Eos与个别成对数据(p < 0.01)。IL-5的影响在两个细胞的存活率。可行的细胞的百分比IL-5-treated PB-Eos显著增加1.3±-21.7±5.8%,1.2%和IL-5-treated BAL-Eos也显著增加39.1±-81.0±14.5%(图1一10.9%⇓;分别为p < 0.05和p < 0.05)。这样survival-enhancing IL-5对两种类型的嗜酸性粒细胞的影响仍发现7天后孵化(无花果。1 b和c⇓)。作为IL-5嗜曙红细胞生存是剂量依赖性的影响出现ng·毫升−1在所有实验中,这个最佳剂量使用。
白介素(IL) 5效果的可行性从外周血嗜酸性粒细胞(PB-Eos)和嗜酸性粒细胞的支气管肺泡灌洗(BAL-Eos)。)PB-Eos和BAL-Eos慢性嗜酸性肺炎(CEP)患者培养有或没有IL-5 (10 ng·毫升−13天,收获。嗜酸性粒细胞的可行性被台盼蓝染料排除测试评估。数据代表个体配对数据在磷酸缓冲盐(PBS)线的六名病人。:PBS;□:IL-5。其他数据代表意味着±sd 6例。Time-courses b)的可行性PB-Eos和c) BAL-Eos(•)或没有IL-5(○)进行评估。代表数据从一个病人。数据代表一式三份的平均数±标准差的文化。*:p < 0.05;+:p < 0.01。
IL-5在嗜酸性粒细胞凋亡的影响进一步评估。PB-Eos和BAL-Eos培养IL-5 24 h的存在与否。凋亡细胞的百分比在PB-Eos和BAL-Eos分别为21.7±3.4%和10.6±1.7%,分别为(图2所示⇓),这表明BAL-Eos比PB-Eos抗细胞凋亡(p < 0.05)。也发现IL-5显著抑制细胞凋亡在两种类型的细胞。PB-Eos和BAL-Eos用IL-5培养时,凋亡的比例PB-Eos从21.7±3.4%下降到12.2±2.0%,和凋亡BAL-Eos从10.6±1.7%下降为5.2±1.1% (p < 0.05)(图2所示⇓)。
![图2. -](http://www.qdcxjkg.com/content/erj/17/2/190/F2.medium.gif)
白介素(IL) 5的影响从外周血嗜酸性粒细胞凋亡的(PB-Eos)和嗜酸性粒细胞的支气管肺泡灌洗(BAL-Eos)。从)外周血嗜酸性粒细胞(PB)和b)支气管肺泡灌洗(BAL)培养24小时。数据的平均数±标准差6例。*:p < 0.05;+:p < 0.05与PB-Eos处理磷酸缓冲盐。
虽然IL-5 PB - BAL-Eos抑制细胞凋亡,细胞凋亡机制的两种类型的嗜酸性粒细胞被认为是不同的在几个方面:在PB-Eos Fas抗原的表达显著增加从7.8±1.8%至18.5±4.2%,24小时的潜伏期(p < 0.05),而在BAL-Eos没有(从5.2±1.9%至3.3±1.6%)(图3所示⇓)。IL-5的影响对Fas表达eosinopilils孵化24小时后在这两种类型的嗜酸性粒细胞也是不同的。如图3所示⇓,PB-Eos明显抑制Fas表达的培养与IL-5(18.5±4.2%至8.3±3.2%,p < 0.05),而BAL-Eos不是抑制(图3 b⇓)。
![图3. -](http://www.qdcxjkg.com/content/erj/17/2/190/F3.medium.gif)
白介素(IL) 5对Fas表达的影响从外周血嗜酸性粒细胞(PB-Eos)和嗜酸性粒细胞的支气管肺泡灌洗(BAL-Eos)。嗜酸性粒细胞的)PB和b) BAL培养有或没有IL-5 (10 ng·毫升−1为24小时)。数据的平均数±标准差6例。*:p < 0.05;+:不重要。
此外,发现刺激显然anti-Fas抗体诱导细胞凋亡的PB-Eos但是BAL-Eos(图4所示⇓)。这些数据表明,PB-Eos与Fas抗原的细胞凋亡,但这在CEP Fas BAL-Eos没有什么关系。
![图4. -](http://www.qdcxjkg.com/content/erj/17/2/190/F4.medium.gif)
eosinphils anti-Fas抗体对细胞凋亡的影响,从外周血(PB-Eos)和嗜酸性粒细胞支气管肺泡灌洗(BAL-Eos)。:PB-Eos和□:BAL-Eos孵化了anti-Fas抗体(CH11: 300 ng·毫升−1为24小时)。数据来自两个具有代表性的例子(a)和b)所示)。数据是一式三份的平均数±标准差的文化。
讨论
动力学的差异之间的细胞凋亡PB-Eos和BAL-Eos CEP进行评估。的存活率BAL-Eos培养3天后明显高于PB-Eos。这也许是个人的结果减少比例比PB-Eos BAL-Eos凋亡细胞。IL-5抑制细胞凋亡在两种类型的细胞,延长他们的生存。Fas抗原似乎参与了细胞凋亡BAL-Eos PB-Eos但不是。
的抗凋亡作用IL-5已经在分子水平上研究14,15。IL-5已经ligand-specificα-receptor子单元和共同β(βc)子单元。后者被认为是最重要的信号分子参与传播抗凋亡信号。另一份报告得出的结论是,IL-5对细胞凋亡的抑制作用是由于bcl - 2表达上调16。虽然嗜酸性粒细胞凋亡被怀疑与Fas抗原,大多数报告得出结论,Fas和βc受体功能独立的7,14,17- - - - - -19。在目前的研究中,这是证明IL-5下调Fas表达在CEP PB-Eos。尽管IL-5的监管可能会间接影响Fas表达,这种效应可能的解释之一的存在异构CEP的嗜酸性粒细胞。以前的报告关于健康的捐赠者的嗜酸性粒细胞的Fas表达显示,嗜酸性粒细胞IL-5并不影响Fas表达18。另一份报告显示,嗜酸性粒细胞的Fas表达特应性皮炎(AD)患者并没有改变随着时间的推移,在文化、并不是IL-5调制的19。作者还发现,嗜酸性粒细胞PB的嗜酸性粒细胞患者与其他人类疾病如hypereosinophilic综合症,支气管哮喘,和木村氏病,也表现出显著的相关性IL-5刺激和Fas表达(数据未显示)。虽然需要进一步的研究证实,这是第一个描述显示的可能性IL-5和Fas表达之间的相关性在CEP的嗜酸性粒细胞。
之前显示,有可能的嗜酸性粒细胞功能异质性,通过研究嗜酸性粒细胞和嗜酸性粒细胞趋化因子的趋化反应嗜曙红细胞表面抗原的表达与hypereosinophilia人类疾病12,20.,21。在目前的研究中,细胞凋亡的嗜酸性粒细胞动力学CEP病人可能是异构的,至少比AD患者和健康的捐赠者。
更有趣的是,Fas抗原的表达在BAL-Eos显然没有改变文化,虽然它是增加PB-Eos(无花果。2和3⇑⇑)。如图4所示⇑外源添加anti-Fas抗体(CH11) BAL-Eos不诱导细胞凋亡,而它确实PB-Eos的诱导。Fas耐药性的机制还没有完全理解。目前的响应差异可能是由于启动BAL-Eos与一些细胞因子,特别是IL-5肺空间,导致细胞凋亡的改变的响应能力。在以前的报告,组织中嗜酸性粒细胞炎性网站并不总是接受Fas刺激后细胞凋亡10,11。在鼻息肉组织中,Fas观察嗜酸性粒细胞的阻力10。这项研究的作者强调,Fas阻力在慢性嗜酸性疾病病理生理意义。Vignolaet al。11也报道了细胞凋亡的嗜酸性粒细胞减少支气管哮喘患者的支气管。目前的研究结果表明,嗜酸性粒细胞在肺泡空间有一定抵抗Fas-induced细胞凋亡。需要进一步的调查,如信号转导的研究来阐明机制参与这种阻力。数量的PB-Eos CEP减少类固醇治疗后,患者在肺浸润的解析是有时延迟。这种延迟的决议可能是细胞凋亡的差异的结果PB-Eos BAL-Eos。
综上所述,本研究的结果表明,细胞凋亡的嗜酸性粒细胞支气管肺泡灌洗更耐比从外周血嗜酸性粒细胞慢性嗜酸性肺炎。嗜酸性粒细胞凋亡降低可能是由于促炎细胞因子表达的影响如interleukin-5肺嗜酸性粒细胞的过程中积累。从外周血嗜酸性粒细胞的细胞凋亡与细胞表面Fas抗原,而嗜酸性粒细胞从支气管肺泡灌洗。这种差异可能是由于慢性interleukin-5刺激导致急速免疫法interleukin-5嗜酸性粒细胞和嗜酸性粒细胞的Fas表达水平降低支气管肺泡灌洗的肺泡空间。连续interleukin-5刺激和嗜酸性粒细胞反应性的变化可能会发挥极其重要的作用在慢性嗜酸性疾病肺空间。还需要进一步的研究来证实这些数据和阐明底层机制。
- 收到了1999年11月3日。
- 接受2000年9月5日。
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