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文摘
背景我们以前报道,微泡(MVs)公布的人类间充质干细胞(MSC)的细胞自身一样有效大肠杆菌脂多糖和生活bacteria-induced急性肺损伤(ALI)小鼠模型。然而,目前尚不清楚MSC MV的生物效应是否可以应用到人类的阿里。
方法在当前的研究中,我们测试了MSC MVs的治疗效果的体外灌注人类细菌性肺炎模型。用人类供体肺不用于移植,我们灌输大肠杆菌细菌intrabronchially, 1小时后,管理MSC MVs到灌流液治疗。
结果6小时后,滴注法大肠杆菌细菌引起的炎症细胞,导致显著的炎症,肺蛋白渗透和肺部水肿的形成。MSC MV管理极大地增加肺泡液体间隙,降低蛋白质渗透率和数值降低了细菌负荷在受伤的肺泡。对细菌杀死有益的影响更为明显的msc预处理toll样受体3受体激动剂,polyinosinic: polycytidylic酸(聚(我:C)),之前MVs的隔离。孤立的人类肺泡巨噬细胞增加了与MSC MV治疗体外抗菌活性。虽然氧化和肺合规水平类似的伤害和治疗组之间,管理MSC MVs数值减少平均肺动脉压力在6小时。
结论总之,MSC MVs增加肺泡液体间隙和减少肺部蛋白渗透,与保利(我:C)预处理增强MVs灌注在体外抗菌活性的人类肺严重肺炎的细菌。
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- 肺炎
- 肺部水肿
来自Altmetric.com的统计
关键信息
关键问题是什么?
可以治疗效果间充质干细胞(MSC)的微泡,报道在临床前小急性肺损伤的动物模型,适用于人类的肺损伤模型?
底线是什么?
人类骨骨髓来源MSC微泡减少急性肺损伤的多个指标在体外灌注人类肺部受伤严重的细菌性肺炎。
为什么要读吗?
基于有前景的结果,进一步的研究是必要的在一个大的肺炎有或没有脓毒症动物模型提供额外的临床前数据可能的临床试验。
介绍
急性呼吸窘迫综合征由于细菌性肺炎或败血症仍然呼吸衰竭的常见原因在重症加护病房患者高死亡率尽管适当的使用抗生素和支持性护理。1 2新的治疗方法需要提高发病率和死亡率。多个临床研究证明重要的治疗潜力与间充质干细胞/基质细胞(MSC)对急性肺损伤(ALI)尽管有限移植率1% ~ 5%。3 45msc的治疗潜力似乎出现在部分分泌的生长因子如角质细胞生长因子(KGF),6抗炎产品,如铂族元素2或lipoxin A4,7 8antipermeability等因素而(Ang1),9日10如LL-37或Lipocalin-2和抗菌产品。11日12基于MSC的重大潜力,几个I和II期临床试验集中在安全正在进行中(NCT02097641,NCT01902082Clinicaltrials.gov)。13然而,仍然有一些问题与同种异体干细胞疗法如肿瘤形成和血液动力学的不稳定由于其物理性质。
最近,干细胞疗法,比如MSC的媒体(厘米)或细胞外囊泡,产生相当大的兴趣由于类似的治疗特性没有利用活细胞固有的挑战。Ionescu等14证明了MSC厘米减少肺部炎症和损伤后脂多糖(LPS)全身的阿里在一只老鼠。使用LPS-induced阿里的人类肺灌注体外,我们还发现,MSC厘米降低肺血管外的水,改善肺内皮屏障通透性和恢复部分肺泡液体间隙(AFC) KGF MSC分泌。6最近,我们证明了MSC-derived细胞外囊泡作为生物活性msc大肠杆菌有限合伙人在老鼠和bacteria-induced阿里通过信使rna的转移和微rna靶细胞,导致改善肺部水肿的决议和抗菌活性增加。15日16我们和其他调查人员还发现,msc预处理,例如聚(我:C),17一氧化碳,18缺氧19等等,可能是一个可行的方法来提高细胞的治疗特性及其释放微泡(MVs)。
细胞外囊泡,发布的大多数细胞类型,大致可分为液,MVs和凋亡机构主要基于它们的大小和起源。有趣的是,细胞外囊泡含有信使rna,蛋白质,微rna,表面受体和潜在的细胞器,它可能参与其功能。20 - 22然而,干细胞疗法是否如细胞外囊泡可以翻译大型动物甚至人类ALI模型是未知的。在当前的研究中,我们提出,MSC MVs可以有效地降低炎症和总细菌负荷严重肺炎模型体外灌注人类肺癌和预处理MSC与聚(我:C)将增强抗菌性的MVs发布。
方法
体外灌注人类肺癌和亚足联的测量
右或左肺灌注来自北方的加利福尼亚移植捐赠网络慢慢有DMEM无酚红+ 5%牛血清白蛋白,直到心输出量达到0.25升/分钟,然后通风(哈佛装置,潮汐容量300毫升,呼吸速率= 10 /分钟,部分灵感氧气(FiO)2)= 21%,呼气末正压通气(偷看)= 5而言不啻2O) (图1)。23亚足联率是衡量控制肺叶的蛋白质浓度变化支气管肺泡灌洗(BAL)流体在使用以下方程:30分钟亚足联(% / h) = 2 x (1 - (Ci / Cf))×100 (Ci和Cf = 5点蛋白质浓度和35分钟,分别)。如果0 <亚足联< 10% /小时,109集落形成单位(CFU)大肠杆菌细菌被灌输进下叶,和新鲜的人类血液(100毫升)添加到灌流液中。一小时后受伤,要么200µL MSC MV(1×) 400µL MSC MV(2×), 200µL toll样受体3 (TLR-3)受体激动剂polyinosinic: polycytidylic酸(聚(我:C)) MSC预处理MV,或200µL正常的人类肺成纤维细胞(NHLF) MV细胞控制以随机方式进行静脉注射。在6小时,亚足联的受伤的叶测量。
隔离MVs源自人类的msc
MVs是从人类骨骨髓来源的条件培养基分离msc、24从美国国立卫生研究院的存储库获得德州A&M大学健康科学中心,并使用超速离心法NHLFs。短暂,msc或NHLFs生长在T75瓶血压得到较好的控制,直到90% confluency然后挨饿α最低必要血清培养基(αMEM)或纤维母细胞基础培养基(FBM)补充0.5%牛白蛋白分数(MP生物医学LLC)。48小时后,条件培养基是收集并在3000转离心20分钟去除细胞碎片,然后在100 000克(贝克曼库尔特最适条件l - 100 xp离心器)来隔离MVs 1小时在4°C的两倍。最后沉积物在PBS和存储resuspended−80°C。10毫升的再悬浮相当于MVs发布的100万msc或NHLFs超过48小时。
TLR-3 MSC的启动
为了切换MSC对免疫调节的表现型,TLR-3受体激动剂,聚(我:C)(σ1µg /毫升,奥尔德里奇),与MSC培养1小时。17细胞被洗两次在PBS和血清饥饿隔离MVs前48小时。
MSC MV描述
MSC MVs贴上了PKH26(西格玛奥德里奇)分离出囊泡从碎片或对CD9-FITC抗体,控制IgG1 k-FITC, CD44-FITC或控制IgG2b k-FITC (eBioscience和BD生物科学)流式细胞术。BD FACSAria融合特殊订单(SORP)细胞分选仪(BD生物科学)与100 nm喷嘴和ND过滤器1使用。SSC的阈值是200。数据被天后分析软件(BD生物科学)。荧光检测中,我们使用一个586/15 525/50 PKH26带通滤波器和带通滤波器为异硫氰酸荧光素(FITC)标记抗体。一个清白的样本用于检测自发荧光和设置所有通道的光电倍增管。标准硅珠(远地点混合流式细胞分析仪,远地点流系统),类似的折射率的囊泡,使用MSC MVs门。MSC MVs也以扫描电子显微镜和通过使用NanoSight NS 300(莫尔文仪器)。
使用伊文思蓝测量肺蛋白渗透
在时间T5小时,我们注入了400毫克的伊文思蓝(西格玛奥德里奇)灌流液。时刻T6.5小时,1毫升灌流液被删除了,然后2 L的PBS被用来冲肺。几块(1 - 2 g)控制和受伤的肺叶被收集和孵化与甲酰胺3天释放染料。我们测量伊文思蓝染料的浓度从每个样本计算肺蛋白渗透。
隔离和细菌杀死人类肺泡巨噬细胞的影响
人类肺泡巨噬细胞分离后用温生理盐水BAL和镀RPMI 1640媒体transwell板(200 000细胞/)与哈佛商学院洗两次后解决方案和刺激1µg /毫升有限合伙人有或没有90µL MSC MV。第二天,细胞培养与调理的107CFU的大肠杆菌细菌为90分钟。的菌落大肠杆菌在中被计算在内。
统计分析
结果表示为均值±SD或中位数25% - -75%百分位(差)。样本正态分布是否由达&皮尔逊或Shapiro-Wilk正常测试。对比几组是使用方差分析和Bonferroni调整如果克鲁斯卡尔-沃利斯检验正态分布或事后邓恩的测试如果不是紧随其后。我们使用软件GraphPad Prism 7.0摄氏度。
结果
基线人口统计学和临床数据供人类肺部
37供体肺的人口统计学和临床数据使用中列出表1。似乎没有MV相比治疗组之间的主要区别大肠杆菌损伤组的年龄、性别、氧气分压(PaO2)/ FiO2比值、肺缺血性时间和肺损伤评分。
MSC MV描述
扫描电镜显示,隔离技术产生了均匀球体粒子(在线人口补充图1)。NanoSight分析显示MSC MV平均尺寸是180±14 nm,浓度为4.7±0.2×108粒子每毫升。流式细胞术,我们贴上MSC MV PKH26量化只有膜结合囊泡和排除残骸。PKH26-labelled MSC MV的比例,我们发现43%±8% CD44是积极的。一个免疫球蛋白Ab被用作控制去除背景染色。CD9、只有0.1%±0.1%的积极PKH26 MSC MVs被贴上标签,表明大多数的MVs囊泡。然而,由于液之间存在明显的重叠和MVs大小而言,可能的外来体总数不足。MSC MV剂量选择最初是基于之前的研究使用MSC在体外灌注人类肺癌和我们的观察,MVs大约5——10×少的活细胞。23因此,我们管理200µL MSC MVs或公布的MVs 2000万MSC在48小时;之前的研究使用体外人类肺5 - 10百万msc用作治疗。
补充文件1
MSC MVs亚足联改善肺部受伤后大肠杆菌肺炎
政府的人MSC MVs(1×2×)或聚(我:C) MSC MVs的灌流液1小时后大肠杆菌全身的阿里显著增加亚足联在6小时247% (p < 0.001), 159% (p = 0.001)或180% (p < 0.001),分别。亚足联值也显著升高而控制肺叶144% (p < 0.001), 82% (p = 0.008)或97% (p < 0.001),分别提出恢复和改善。相比之下,政府的NHLF MVs没有好处,实际上与对照组相比显著降低亚足联(p = 0.002) (图2一个)。令人惊讶的是,没有剂量效应随着MSC MV×2×任何参数,表明有一个治疗MVs天花板。通过组织学、intrabronchial滴注法大肠杆菌描绘的细菌造成重大伤害的增加细胞结构和血液,水肿和间质增厚,这大大降低了政府的MSC MV(1×2×)或聚(我:C) MSC MVs (图2 b)。
补充文件2
保利(我:C) MSC MVs减少细菌数在受伤的肺泡
细菌菌落测定球液体滴剂后109大肠杆菌细菌有或没有MV治疗6小时。虽然CFU的值中位数水平MSC MV 1×2×数值低于治疗组大肠杆菌损伤组,只有政府的聚(我:C) MSC MVs明显降低CFU计数相比大肠杆菌受伤组6小时事后邓恩的分析后克鲁斯卡尔-沃利斯检验(p = 0.007)。(图3一)。管理NHLF MVs没有显著的影响。灌流液中的细菌菌落计数也数值低的MSC MV 2×和聚(我:C) MSC MV组相比大肠杆菌集团在6小时但没有统计学意义(图3 b)。
当新人类肺泡巨噬细胞是cocultured孤立大肠杆菌细菌有或没有有限合伙人和/或MSC MVs,细菌由肺泡巨噬细胞吞噬作用与MSC MV治疗显著增加(p = 0.044) (图3 c)。
MSC MVs绝对中性粒细胞计数减少受伤的肺泡
落下帷幕后流体的绝对中性粒细胞计数大肠杆菌肺炎是数值低的MSC MV后政府(1×)或聚(我:C) MSC在6小时(平均9.1×10 MV6差为8.6×106-2.6×107为大肠杆菌中位数5.5×106差为3.9×106-9.1×106对于+ MSC MV 1 x,中位数7.2×106差为4.7×106-9.9×106+聚(我:C) MSC MV, n = 6尺11寸),整体p值为0.024 (图4一)。但是,没有一对比较显示统计学意义在邓恩的修正。也有绝对中性粒细胞计数无显著差异的灌流液(数据没有显示)。
MSC MV对肿瘤坏死因子(TNF)α在受伤的肺泡
我们测量了炎性细胞因子(TNFα)落下帷幕。虽然没有统计学意义,人类MSC MV 1×的政府大肠杆菌肺炎数值减少的水平TNFα(pg / ml) 72%(平均5285 409 3446 - 13的差大肠杆菌,中位数1454差+ MSC MV 1×681 - 8097, 3263 - 9285年的平均5105年,差2 + MSC MV x,中位数6123位差的1766 - 9152 +聚(我:C) MSC MV, n = 6尺11寸)。
讨论
可以总结这些研究的主要发现如下:(1)通过静脉注射的MSC MVs显著增加亚足联的速度和减少肺部蛋白渗透和数值降低CFU计数细菌和炎症后肺泡受伤严重大肠杆菌肺炎的灌注体外人工肺(图2,图3和5);(2)聚(我:C)预处理的msc显著增强的抗菌性质MVs受伤的小窝(发布图3);(3)增加抗菌效果的聚(我:C) MSC MVs与数值降低大量炎症细胞(中性粒细胞)在肺受伤(图4);(4)MSC MVs和聚(我:C) MSC MVs治疗组数值较低的中位数行动党,PVR水平6个小时(图6)。然而,MSC MVs和聚(我:C) MSC MVs没有改善气管压力,肺合规或氧化(图7);(5)新孤立的人类肺泡巨噬细胞增强抗菌性与MSC MV治疗(图3);和(6)更重要的是,临床治疗结果与MSC MVs看到老鼠明显在临床相关的人类肺损伤模型中,特别是在保利的影响(我:C) MSC MVs,使它可能可行的选择MSC治疗。
大多数细胞释放MVs,25可以生物活性介质的细胞间通信或通过直接作用于靶细胞。代谢途径最近,MVs源自MSC已报告对各种器官损伤模型起到治疗作用。29 30我们之前发现MSC MV显著降低小鼠的肺部水肿与有限合伙人或受伤大肠杆菌肺炎15日16人类和一个体外灌注肺的缺血/再灌注模型。31日然而,潜在的机制尚不完全清楚。在当前的研究中,MSC MVs和聚(我:C) MSC MVs改善亚足联在6小时后达到的水平大肠杆菌肺炎(图2)。我们之前证明MSC和/或MSC MVs通过增强KGF表达亚足联率增加;KGF从msc分泌调节的关键在肺泡上皮细胞钠通道(αENaC),增加液体吸收。6
我们还发现,聚(我:C) MSC MVs增强细菌杀死体内和体外MSC MVs (图3)和数值减少了大量中性粒细胞(图4受伤的肺泡。几个潜在的机制可能解释这些观察结果:(1)MSC和MSC MVs分泌或增强抗菌可溶性因子的表达式。Krasnodembskaya等发现,msc分泌LL-37已知抗菌肽,古普塔等11日12证明了msc增强生存和细菌间隙通过upregulation Lipocalin-2 msc的小鼠模型大肠杆菌肺炎;(2)Raffaghello等32证明了MSC抑制细胞凋亡的中性粒细胞的差别通过MSC对这些活性氧和Stat-3磷酸化;(3)多个组表明,MSC和MSC MVs增强肺泡巨噬细胞生存通过线粒体转移(通过隧道纳米管)和表型变化从促炎M1抗炎平方米。到三十五两个Nemeth等和梅等7 36发现msc调节巨噬细胞的吞噬活动,提高细菌间隙在盲肠的结扎和穿刺的脓毒症模型。此外,最近的研究表明,TLR-3激活与聚(我:C)可以增强免疫调节MSC的潜力,而地激活能减少它。17在一个小鼠模型大肠杆菌肺炎,我们发现,聚(我:C)预处理的MSC MV增强单核细胞/巨噬细胞表型M2的变化,表明通过减少炎症和细菌吞噬作用增加。16
MSC MVs和保利(我:C) MSC MVs都显著降低肺蛋白渗透(图5),这可能归因于其Ang1内容,与著名的抗炎蛋白,antipermeability和内皮保护特征。MSC和MSC MVs Ang1 mRNA的重要水平。在老鼠LPS-induced阿里,MSC或者MSC与人类Ang1基因转染减少肺血管损伤和炎症细胞进入肺的招聘。10最近,唐等37发现Ang1 MSC MV是重要的在减少炎症和肺水肿LPS-induced阿里老鼠。
我们的研究有一些局限性:(1)缺乏一个完整的淋巴系统,肺间质流体间隙,这可能是有关测量如果亚足联在更长时间内;(2)缺乏等免疫器官脾脏和肝脏,这可能参与损伤和/或修理;(3)肺损伤的时间短,这限制了评估MSC MVs的影响能否持续;和(4)有限样本容量的研究由于缺乏可用性的肺。
尽管限制,但目前的研究的重要性是在建立使用MVs可能成为可行的选择利用活细胞在阿里。隔离和存储的好处包括缓解,避免二甲亚砜为保存和需要骨髓移植设备,避免使用活的干细胞和tumourigenic潜力,这可能会导致血液动力学的不稳定性与政府和潜在修改MVs的预处理细胞增强治疗效果。然而,主要障碍仍在扩展MSC MVs以来的生产能力大约是5 - 10×小于细胞。考虑到典型的MSC剂量是500万细胞/公斤或5亿100公斤病人,未来与MSC MVs的临床试验可能需要隔离MVs释放每个病人50亿个细胞,这可能是禁止的。目前正在进行研究,以解决这一关键问题。
总之,我们的研究表明,MSC MVs是治疗严重的临床相关的人体模型大肠杆菌肺炎与基线的肺损伤。基于这些可喜的成果,进一步的研究是必要的在一个大动物和肺炎或败血症提供进一步的生物原理和额外的临床前数据可能的临床试验。
引用
脚注
贡献者JP:概念和设计,收集和汇编的数据,数据分析和解释,手稿写作。SK、霍奇金淋巴瘤,SH、JL赫兹和QH:收集和汇编的数据和数据分析和解释。老妈:金融支持,数据分析和解释和手稿写作。J-WL:概念和设计、金融支持、数据分析和解释,手稿写作和最终批准。
资金这项工作是由美国国立卫生研究院的国家心脏、肺、血液研究所授予号码hl - 113022 (J-W Lee博士),hl - 51856和hl - 131621 (M博士Matthay)。
相互竞争的利益没有宣布。
病人的同意不是必需的。
出处和同行评议不是委托;外部同行评议。
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