人类间充质干细胞介导的抗菌效应分泌的抗菌肽LL-37一部分

文摘

最近的体内研究表明,间充质干细胞(msc)可能有益治疗脓毒症引起的细菌感染。msc在这些研究管理改善生存和加强细菌的间隙。本研究的主要目的是测试假设人类msc具有内在的抗菌性。我们研究人类msc来源于骨髓的影响革兰氏阴性细菌生长的(大肠杆菌和铜绿假单胞菌)和革兰氏阳性(金黄色葡萄球菌)的细菌。msc以及他们的条件培养基(CM)表现出显著的抑制细菌生长相比,控制媒介或正常的人类肺成纤维细胞(NHLF)。分析主要抗菌肽的表达表明的因素之一负责MSC厘米对革兰氏阴性细菌的抗菌活性是人类抗菌肽抗菌肽,hCAP-18 / LL-37。蛋白质和蛋白质表达数据显示的表达LL-37在msc增加细菌的挑战。使用一个体内小鼠模型E。杆菌肺炎、气管内的msc管理减少细菌生长(克隆形成单位)在肺匀浆和支气管肺泡灌洗(BAL)流体,与管理同时msc与中和抗体LL-37导致细菌清除率下降。此外,球从MSC-treated老鼠更大的抗菌活性与球相比,磷酸缓冲盐(PBS)治疗的老鼠。人类骨骨髓来源msc具有直接的抗菌活性,介导的一部分人类抗菌肽的分泌hCAP-18 / LL-37。

我ntroduction

先天免疫系统提供了对微生物感染的第一道防线。负责细菌的主要效应分子杀死包括抗菌蛋白质和多肽,组成一个多元化的集团,包括溶菌酶、乳铁蛋白、分泌leucoprotease抑制剂,和defensins能够杀死微生物(1]。主要的抗菌肽的抗菌肽家族是一个家庭在哺乳动物2]。肽属于抗菌肽家族结构性产物或诱导刺激(3,4]。抗菌肽以及大多数的已知抗菌肽对杀菌剂的活动通过破坏细菌细胞膜的完整性(5]。在人类中,抗菌肽的抗菌肽家族是由4 kDa肽,hCAP-18 / LL-37,这主要是由噬菌作用的白细胞、上皮细胞在骨髓中表达的也是6由间充质干细胞(msc)[]和7]。LL-37具有广泛的生物活性,包括直接杀死微生物,趋化性、趋化因子诱导和调节炎症反应、血管生成、抗凋亡,艾滋病在水平DNA细胞内转移,和伤口愈合的影响8,9]。

msc是多能成体干细胞在骨髓中发现和其他解剖利基市场,具有分化成多种细胞类型的能力如成骨细胞、脂肪细胞,在体外条件下内层(10,11]。骨髓(BM)派生msc驻留在正弦曲线和功能作为造血干细胞的支持细胞,可能提供一些抵御微生物入侵。虽然已是不争,msc toll样受体(TLR)受体(12- - - - - -15和参与炎症反应16),对他们的先天免疫系统的作用。

急性肺损伤(ALI)是危重患者急性呼吸衰竭的主要原因。阿里的细菌性肺炎是最常见的原因(17]。最近的研究表明,BM-derived msc减少肺损伤实验模型的脂多糖(LPS)全身阿里在鼠标18,19),在一个vivo-perfused人类肺(交货20.]。此外,其他体外和体内研究提供了有益的证据msc治疗有限合伙人或bacteria-induced脓毒症。在两个盲肠的结扎后脓毒症小鼠模型和穿刺(CLP),增长值msc降低血液中总细菌数和腹水21,22]。这些生存利益部分解释了msc的免疫调节特性,但实际增强细菌清除机制不明确识别。尽管最近的一份刊物梅等。23]表明,细菌在MSC-treated间隙的改善脓毒性小鼠CLP后可以部分解释为增强宿主免疫细胞的吞噬功能,它还不知道是否人类BM-derived msc具有直接的抗菌活性。

因此,这些研究的主要假设是人类msc可能通过分泌表达直接的抗菌活性的抗菌肽。我们对人类的影响msc在体外细菌生长。表达不同的抗菌肽研究使用逆转录聚合酶链反应(rt - pcr)、酶联免疫吸附试验(ELISA)和免疫组织化学。与生活刺激后大肠。杆菌人类msc一个候选人产生抗菌肽,LL-37,后来发现负责体外抗菌活性。以确定的分泌LL-37 msc将改变细菌清除体内,我们测试了BM-derived人类msc大肠杆菌在小鼠肺炎模型。与人类msc治疗,4小时后,导致的显著减少E。杆菌克隆形成单位(CFU)肺匀浆(lh)和支气管肺泡灌洗(BAL)液体。中和抗体的效果被LL-37证明人类msc具有抗菌活性,这是解释LL-37分泌的一部分。

米aterials和米治疗

化学药品和试剂

有限合伙人(E。杆菌从Sigma-Aldrich O55: B5)购买(密苏里州圣路易斯。鼠单克隆抗体对人类LL37 / CAP18克隆3这里和鼠标同形像IgG1抗体购自Hycult生物技术(荷兰),山羊Alexa-Fluor 488 -标记anti-mouse-IgG表达载体,合成人类LL-37 AnaSpec (CA)和胎牛血清(的边后卫)从HyClone实验室Inc .(犹他州)。

动物

C57BL / 6雄性老鼠(8 - 10周旧;杰克逊实验室)被用于实验。动物在动物设施维护加州大学旧金山分校。所有实验协议机构批准的动物保健和使用委员会加州大学旧金山分校。

细胞培养

同种异体BM-derived人类msc培养如前所述[20.]。简而言之,msc获得德克萨斯A&M大学健康科学中心的医学、再生医学研究所(寺庙,德克萨斯州),NIH存储库。细胞符合所有的标准定义的分类一样msc国际社会的细胞治疗(24]。此外,我们检测了细胞免疫荧光,发现它们是负CD45和CD19。抵达时,细胞解冻和扩大在组织培养瓶(BD猎鹰,比利时)密度500000细胞/ 150厘米²。细胞通过每3 - 4天-80%胰蛋白酶化达到70%时confluency和段落之间被用于实验5 - 10在我们之前的研究(20.]。每个通道之间,生存能力测量台盼蓝排斥。msc在α-Minimum基本培养基培养是没有核糖核苷或脱氧核苷含2毫米谷酰胺和16.5%的边后卫,没有抗生素。细胞培养在湿润孵化器有限公司5%₂在无菌条件下和37°C。每个实验之前,细胞使胰蛋白酶化,计算,用磷酸缓冲盐(PBS)洗净,resuspended在适当的介质(RPMI - 1640介质(RPMI) + 5%的边后卫的E。杆菌刺激,杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM) -H21和F-12火腿的(1:1),以防coculture与人类肺泡上皮的主要文化II型(ATII)细胞,和PBS当接种到小鼠)。每个实验做了一式三份,使用细胞从美国国立卫生研究院库至少有三个不同的捐赠者。正常成人肺成纤维细胞(NHLF;Lonza Inc .)、瑞士)被用作控制和生长在同样的条件下msc。

ATII上皮细胞分离出人类供体肺(4 - 8小时保存在4°C)如前所述[25]。人类镀ATII细胞胶原蛋白的主要文化I-coated 24-well Transwell板(0.4 -μm孔隙大小、聚四氟乙烯(PTFE)膜,配角,康宁公司,纽约)有限公司5%₂在37°C的浓度1×10⁶细胞/。细胞暴露在媒体,DMEM-H21 F-12火腿(1:1),10%的边后卫用抗生素72小时和48小时内没有的边后卫和抗生素。后120小时的隔离,II型细胞暴露在有限合伙人在100 ng / ml 24小时。实验与msc、同种异体msc(250000细胞/)被添加到或室底部Transwell板(有或没有细胞接触)同时与有限合伙人。

细菌培养和抗菌化验

大肠杆菌应变K1,铜绿假单胞菌应变PA103,金黄色葡萄球菌纽曼应变被用于这些实验。用于通道的方法、存储、放大,并量化细菌前面描述的(26- - - - - -28]。对于每一个实验,大肠杆菌或金黄色葡萄球菌殖民地从冻结的股票被播种,铜绿假单胞菌殖民地被播种的选择性琼脂板保持在−4°C和一夜之间成长在液体Luria-Bertani 37°C(磅)中(马里兰州Difco BD)轻微的风潮。每个实验之前,细菌细胞被洗一次,resuspended在PBS和光学密度(OD在λ= 600海里)悬挂的测量。菌落数量计算如下方程:根据OD_600年= 1.0对应4×10⁸CFU /毫升大肠杆菌(26),OD_600年= 0.5对应5×10⁸为铜绿假单胞菌(28],OD_600年= 1.8对应2×10⁹CFU /毫升。

评估msc或其直接抑制细菌生长的条件培养基(CM)是由计数菌落。总之,msc 24-well板块(2×10⁵细胞每)RPMI 300 CFU补充5%的边后卫被感染大肠杆菌或金黄色葡萄球菌和6小时的湿润孵化有限公司₂孵化器,然后整除培养基被从每个好,连续用无菌PBS稀释,镀LB-agar板块(TEKnova,霍利斯特,CA)。殖民地被数隔夜孵化后37°C。

抗菌活性的MSC厘米(或合成LL-37)进行了测试,采用磁化率测试根据Andra et al。29日用细微的修改。短暂,MSC CM收集的井,在15000转10分钟和冷冻离心机−20°C(消除任何残留细菌生物)。实验前,样本在冰上融化,和整除(90μl)被转移到一个96孔板,接种100 CFU大肠杆菌、铜绿假单胞菌,或金黄色葡萄球菌(10μl PBS)和孵化16小时37°C。然后cfu计数如前所述。在的情况下铜绿假单胞菌,有选择性的假单胞菌马里兰州isolation-agar板块(Difco BD)代替LB-agar盘子。在其他实验中,样本preincubated anti-LL-37抗体(1μg /毫升)或鼠标同形像抗体控制2小时逆转录(RT) plate-shaker (200 rpm)。进行抗菌活性的鼠标BAL Bergsson et al。30.通过添加1×10]⁴大肠杆菌CFU - 90μl BAL样本和孵化37°C。2小时后,cfu计数。

RNA隔离和rt - pcr

RNA分离msc, NHLFs使用试剂盒RNAeasy工具包(试剂盒Inc, CA)。隔离后,RNA样本处理DNase我60分钟RT去除污染的DNA。RNA的质量评估与NanoDrop nd - 1000紫外可见分光光度计(NanoDrop技术,威明顿、德)根据制造商的指示。260/280和260/230 nm吸光度比值1.8 - -2.0表示一个纯粹的RNA样品。引物对LL-37 GAPDH和定制(欧陆坊MWG操纵子,阿拉巴马州)。序列如下:LL-37(向前5′- TAACCTCT ACCGCCTCCTGGACCTGGACC-3′;反向5′-GGACTCTG TCCTGGGTACAAGATTCCGC-3′), 3 -磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)(前5′-GTCAGTGGTGG ACCTGACCT-3′,反向5′-AGGGGTCTACATGGCAA CTG-3′)。的特异性PCR产品DNA测序证实了。rt - pcr是使用上标三世一步法rt - pcr系统与铂Taq DNA聚合酶协议从英杰公司根据制造商的指示的反应体积25μl。LL-37 cDNA放大,一个初始逆转录步骤(52°C 30分钟)之后,变性步骤(94°C 2分钟),然后由40周期的变性(20秒94°C),退火30秒(60°C),和延长30秒(68°C),其次是5分钟伸长的72°C。 To normalize loading of the PCR products,GAPDH作为内部控制基因扩增技术(RT 58°C 30分钟,变性94°C 2分钟,18个周期放大94°C的20秒,30秒64°C, 68°C为30秒,伸长68°C 5分钟)。由此产生的放大DNA产品运行在1.4%琼脂糖凝胶,和乐队可视化使用溴化乙锭。

荧光免疫组织化学

LL-37的检测细胞培养的msc或NHLFs被播种在Lab-Tek二室的幻灯片(Nalge Nunc国际;热费希尔科学、PA)的密度5×10⁴细胞/厘米²。细胞24小时,然后刺激增长E。杆菌(300 cfu) 6小时。完成实验条件后,细胞单层洗两次冷PBS和固定在4%多聚甲醛30分钟。细胞被洗了三次与PBS 10分钟轻轻摇晃在室温下室。细胞被permeabilized 0.2% Triton x - 100 2分钟,用PBS 10分钟洗了三次,阻止了5% BSA为2小时。幻灯片是孵化的主要抗体稀释1:50的LL-37 5% BSA在一夜之间在4°C。幻灯片与PBS 10分钟洗了三次,然后暴露于二级抗体,山羊Alexa-Fluor 488 - anti-mouse-IgG的标签。洗后,幻灯片孵化了4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)(300μM西格玛奥德里奇)5分钟复染色细胞核。幻灯片与Vectashield安装安装介质。获得的图像是徕卡显微镜DM 1000。

蛋白质分析

MSC CM的SP-D水平测定酶联免疫试剂盒(Yamasa公司、日本)。β-defensin-2和β-defensin-3水平是衡量ELISA(凤凰制药公司,CA)。hCAP-18 / LL-37浓度在MSC厘米来衡量ELISA (Hycult生物技术、荷兰)。

大肠杆菌肺炎小鼠模型

老鼠与三溴乙醇和麻醉大肠杆菌1×10⁶菌落的数量30μl被灌输到肺。直接可视化的细节气管内的(IT)慢慢灌输我们之前的出版物中描述的方法(18,27]。4小时后,老鼠和异氟烷麻醉MSC (1×10⁶细胞在30μl PBS)或PBS气管内的。18小时后E。杆菌滴注法,小鼠牺牲巴尔斯。

大肠杆菌量化的LH和落下帷幕

小鼠安乐死在18小时后滴注法大肠杆菌。落下帷幕后完成的工作人员并没有老鼠把20量度导管进入气管通过1毫升的冷PBS刷新来回三次。整除落下帷幕的连续稀释和培养磅琼脂板在一夜之间在37°C。cfu计数。一组不同的肺,1毫升PBS添加和肺是在无菌条件下均质。匀浆是连续稀释和培养磅板块在一夜之间在37°C。细菌菌落数如前所述。

测量白细胞和中性粒细胞的落下帷幕

BAL白细胞和中性粒细胞被库尔特计数器测量(Z1系列;贝克曼库尔特)。细胞涂片也用cytospin离心机(热Shandon)和细胞可视化Wright-Giemsa染色(费舍尔科学)。白细胞计数的微分估计显微镜下通过计算100细胞/代表部分的幻灯片。

平衡细胞因子和蛋白质测量

BAL样本在1000转离心10分钟,和上层的收集和储存在−80°C。巨噬细胞炎性蛋白(MIP) 2,一只老鼠嗜中性粒细胞趋化因子,在球浮在表面的衡量ELISA(研发系统)。BAL标记的蛋白质浓度肺血管内皮和上皮通透性是衡量Bio-Rad蛋白质化验设备。

统计分析

所有实验群体进行至少三次在一式三份。结果表示为平均数±标准差如果数据是正态分布。比较两组是由一个未配对t测试。对比以上两组是由重复测量方差分析使用多重比较检验的Bonferroni调整Statview (SAS研究所Inc .)。的值p< . 05被认为是具有统计学意义。

R试验结果

人类msc抑制大肠杆菌细菌生长

测试人类msc对细菌生长的影响,我们用300 CFU感染msc大肠杆菌6小时。BM-derived msc显著抑制细菌生长与控制介质(RPMI)并与NHLFs(无花果。1)。

来确定观察到的抗菌效果与可溶性分泌相关因素,我们评估了CM通过孵化抑制细菌生长的能力大肠杆菌或与另一个革兰氏阴性细菌,铜绿假单胞菌。没有明显如果厘米的msc对细菌生长的影响与控制介质或厘米相比正常的人类肺成纤维细胞。然而,CM MSC先前刺激大肠杆菌显示明显的抗菌活性大肠杆菌(无花果。1 b),对铜绿假单胞菌(无花果。1 c)。这些结果表明,MSC对革兰氏阴性细菌抗菌活性的机理与分泌有关的产品,这是与先前的细菌诱导的挑战。

coculture实验中发现类似的抑制作用msc与革兰氏阳性细菌,金黄色葡萄球菌。MSC厘米后金黄色葡萄球菌刺激也保留了抗菌活性金黄色葡萄球菌(支持信息图S1A S1AB)。因为这次调查的主要目标是测试的角色直接抗菌性革兰氏阴性msc的感染,我们集中在对革兰氏阴性细菌的活动。

msc分泌人类抗菌肽抗菌肽,LL-37

调查潜在的候选人负责观察抗菌效果,我们分析了如果和细胞培养上清液大肠杆菌刺激msc对蛋白质和肽的存在与已知的抗菌活性。蛋白质含量由ELISA对人类β-defensins hBD-2 hBD-3, Lipocalin-2,和SP-D负面或显示非常低的水平,这是不足以引起一种抗菌效果(数据没有显示)。然而,通过rt - pcr、免疫荧光和ELISA, msc表达和分泌人类抗菌肽抗菌肽hCAP-18 / LL-37。通过rt - pcr,人类中,ll - 37越基线mRNA很低但显著增加与刺激大肠杆菌。正常的人类肺成纤维细胞也表达了LL-37但是下级(无花果。2)。通过免疫荧光(图2 b)和ELISA(无花果。2摄氏度),在人类中,ll - 37越分泌显著高于NHLFs msc与控制。msc刺激通过孵化大肠杆菌分泌显著更高层次的LL-37与NHLFs(无花果。2摄氏度)。

抗菌活性的合成LL-37

对合成LL-37仅表现出显著的抗菌效果E。杆菌和反对P。绿脓杆菌,当测试在同一介质(RPMI 5%的边后卫)和在相同的条件下MSC厘米。所需的浓度的影响与控制媒介相比变得明显从1 ng / ml,增加剂量依赖性的方式(图。3,3 b)。之前的实验表明,msc,以前刺激大肠杆菌,分泌LL-37 10 ng / ml(图的范围。2摄氏度)。

MSC CM的抗菌活性是由LL-37分泌

测试的效果LL-37分泌的抗菌效果MSC厘米,我们先前preincubated CM(刺激大肠杆菌与抑制性抗体),anti-LL-37 1μg /毫升的浓度,或鼠标同形像控制抗体2小时,然后培养CM 100 CFU大肠杆菌或P。绿脓杆菌额外的16个小时。预培养的anti-LL-37抗体删除了所有CM的抗菌效果对两菌株msc。相比之下,预培养用鼠标同形像控制免疫球蛋白抗体对抗菌活性没有显著影响,表明LL-37分泌(图的重要性。3 c,3 d)。

msc的体内抗菌作用的模型大肠杆菌肺炎

以确定msc是适用于体内的抗菌效果,我们用它感染C57BL / 6小鼠滴注法E。杆菌1×10⁶CFU。四个小时后E。杆菌滴注法,小鼠接受1×10⁶BM MSC或PBS气管内的。18小时后感染,LH和BM MSC BAL治疗组小鼠的样品出现大幅减少总细菌数(图。4,4 b)。总细菌数球在数量级小于lh的细菌计数。相比之下,老鼠收到NHLF没有展示任何细菌计数差异lh (NHLF 3.3±1.1, 3.9±1.7×104 CFU /毫升PBS,意味着CFU±SD)或BAL NHLF (9.6±14.9, 8.26±10.6×10³PBS CFU /毫升,意味着CFU±SD)而接受PBS组。

评价体内MSC在18个小时BAL治疗细胞计数和蛋白质涌入

总BAL细胞绝对计数和嗜中性粒细胞计数在大英博物馆也显著降低MSC-treated组相比,接受pbs老鼠(图。5,5 b),这表明细菌间隙MSC-treated落下帷幕的老鼠不主要取决于免疫细胞的招募。MIP-2,落下帷幕的中性粒细胞趋化因子水平也显著降低小鼠采用msc,相比之下,接受pbs组(图。5度)。BAL蛋白质水平、肺血管内皮和上皮通透性的标志,显著降低小鼠被msc与PBS(无花果。5 d)。在不同的实验中,NHLF-treated老鼠没有任何区别接受pbs组在任何这些参数(数据没有显示)。

LL-37活动中和消除msc体内的抗菌效果

msc一起管理中和anti-LL-37 Ab(10μg),但不是鼠标控制免疫球蛋白(10μg),导致细菌数量增加近10倍lh和拜尔(无花果。6,6 b),与MSC-treated组相比,表明LL-37活动所需msc观察到体内的抗菌效果。

独自在单独的实验中,管理中和anti-LL-37抗体(10μg)改变不了老鼠BAL的细菌生长水平(支持信息图S2A)与接受pbs的老鼠相比,表明anti-LL-37抗体不干扰内源性鼠标抗菌蛋白的抗菌活性,包括潜在的鼠标cathelin有关抗菌肽(抽筋)。

确认体内抗菌作用与msc分泌溶性产品,我们执行一个额外的调查鼠标BAL的抗菌活性。落下帷幕的老鼠的上层清液处理msc、孵化时1×10⁵CFU的E。杆菌2小时,抑制细菌增长49%,接受pbs的球浮在表面的老鼠相比,表明抗菌因子的存在(图。6摄氏度)。BAL上层清液的抗菌效果是显著降低小鼠接受msc一起anti-LL-37抗体(图。6摄氏度),而同形像免疫球蛋白g没有任何影响(数据没有显示)。

落下帷幕后,鼠标的抗菌活性的管理anti-LL37 Ab体内仅显示相比没有区别BAL从接受pbs老鼠(支持信息图开通),提供了额外的证据表明抗体用于我们的实验并没有消除内源性鼠标抗菌肽的活性。

Coculture msc与人类ATII细胞

因为总BAL MSC-treated组的细胞数量显著降低,另一个可能的来源的抗菌肽和蛋白质在球可能是肺泡上皮细胞。因此,我们测试了msc是否可能有任何影响抗菌肽的生产人类ATII细胞的主要文化。我们一起cocultured msc与人类Transwell ATII细胞系统(无花果。7一个)有或没有接触的有限合伙人(100 ng / ml 24小时)。厘米的ELISA LL-37单独显示,上皮细胞产生大量LL-37很低,和人类中,ll - 37越没有区别由msc单独或与ATII coculture(有或没有细胞接触;无花果。7 b),这表明msc LL-37的主要来源。此外,CM的抗菌活性降低60%E。杆菌CFU只有在coculture ATII msc(不接触)一起与ATII细胞单独或与LPS刺激相比,控制介质(无花果。7 c)。

Discussion

本研究的主要发现是(a)人类BM-derived msc能直接抑制细菌生长,厘米和活动是守恒的,指示分泌可溶性因子的存在;(b) msc生产和分泌大量的抗菌肽,人类抗菌肽hCAP-18 / LL-37,抑制细菌生长E。杆菌和P。绿脓杆菌体外;(c)的表达LL-37由msc诱导E。杆菌暴露在信使rna和蛋白质含量;(d),并在小鼠模型E。杆菌肺炎,它MSC管理导致细菌数量显著减少球和lh 18小时后感染,这是依赖LL-37活动。这些结果说明msc可以参与宿主防御通过分泌的抗菌肽。

抗菌肽,如LL-37或宿主防御肽内源性肽抗菌性,先天免疫系统的重要部分。尽管有证据表明,合成或原生LL-37有力的抗菌活性体外对多种病原体包括病毒(31日)、真菌(32),革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌(5,31日,33),很少有研究建立的重要性人类中,ll - 37越生物体内抗菌活性。勃兰登堡et al。34]报道了抗菌活性感染性脑膜炎患者的脑脊液,主要由LL-37介导。这一发现进一步支持rCRAMP的表达(一只老鼠模拟LL-37)在大鼠神经胶质细胞与细菌刺激后上层清液及其抗菌活性。在随后的研究中(35),这些研究者报道抗菌活性的老鼠脑膜细胞培养上清液对各种革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌。使用核,作者证明rCRAMP是负责抗菌效果的主要因素。Bergsson et al。30.]演示的潜在相关性LL-37落下帷幕的囊性纤维化患者的抗菌活性(CF)。尽管人类中,ll - 37越高,对微生物活性CF肺因为复杂的形成与葡糖氨基葡聚糖(笑话)。GAG裂解酶和食盐水可以打破这些复合物,解放LL-37和恢复抗菌效果。

尽管LL-37分泌以前在骨髓中发现(6)和BM MSC (7),为抗菌活性LL-37 msc的潜在作用尚未研究。以往的研究强调LL-37作为化学引诱物的作用干细胞。Coffelt et al。7)表明,LL-37增加了msc的迁移通过其甲酰肽受体,FPLR1。在另一项研究中,Tomchuck et al。14)报道,LL-37可以TLR4受体的配体在msc和刺激他们的迁移,甚至改变他们的免疫调节特性。从这些研究中,两个重要的msc描述与他们的抗菌性能潜力:(a) msc TLR和FPLR受体,其为病原体识别的分子模式是必要的,建议msc的可能性可能参与先天免疫反应;(b) LL-37,通过一个浓度梯度,可以激活msc和诱发他们的迁移对感染源。

在我们的实验中,我们发现LL-37表达BM-derived MSC被调节E。杆菌刺激。与生活接触后E。杆菌6小时,upregulation LL-37的msc被发现在mRNA(无花果。2)和蛋白质含量,证实了免疫荧光(图2 b)和ELISA(无花果。2摄氏度)。如果LL-37和水平E。杆菌刺激MSC厘米的范围在2.7±1.2和7±1 ng / ml(平均数±标准差),分别。Coffelt et al。7]之前报道的人类中,ll - 37越140 - 150 pg / ml的厘米如果骨髓MSC来自三个不同的捐赠者。我们发现在CM中更高浓度的LL-37如果msc、可以用细胞培养条件的差异来解释。无论如何,LL-37 msc分泌的一般属性和似乎并不取决于捐赠者的状况。

更重要的是,这些结果与MSC CM的抗菌活性的增加E。杆菌和P。绿脓杆菌(无花果。1 b,1 c)。合成LL-37,从1 ng / ml的剂量和溶解在同一介质(RPMI, 5%的边后卫),显示抗菌活性存在剂量依赖的相关性对革兰氏阴性细菌(无花果。3,3 b)。预培养的MSC厘米中和anti-LL37 Ab显著降低抗菌活性的样品(无花果。3 b),提供一个直接联系LL-37分泌和MSC CM的抗菌效果。我们还证明了msc能抑制革兰氏阳性细菌的生长,金黄色葡萄球菌,这一效应是由一种分泌可溶性产品(支持信息图S1A,印地)。这些数据与最近的研究在协议克鲁斯et al。36),调查人员发现,体外人工肺肥大细胞表现出直接的抗菌活性年代。肺炎,这活动是contact-independent和部分介导LL-37的释放。

扩展我们的体外研究中,我们被感染C57BL / 6雄性老鼠E。杆菌(1×10⁶小鼠CFU /)。IT管理的msc在感染后4小时与总细胞数减少,蛋白质和MIP-2球相比的水平E。杆菌来华的鼠标(图。5- - - - - -5 d),反映出msc的免疫调节特性(18- - - - - -22]。MSC政府也导致细菌清除率增加反映在较低的细菌菌落数在lh和拜尔(无花果。4,4 b)。为了测试LL-37分泌的作用,我们一起管理msc与中和抗体LL-37追随者E。杆菌感染。的应用抑制性抗体废除了细菌间隙(图的改善。6,6 b),导致BAL中性粒细胞计数增加,类似于接受pbs的动物。在不同的实验中,当anti-LL37 Abs在msc缺席的情况下,细菌生长持平而接受pbs老鼠(支持信息图S2A),这表明抗体用于这些实验是人类特定的肽和没有中和小鼠内源性抗菌肽的功能活动(抽筋),这是一个鼠标呼吸道分泌物的正常组成部分。MSC管理细菌生长的好处并不是复制的IT管理正常的人类肺成纤维细胞。这些数据表明,LL-37 MSC可能是重要的活动感染后,可能直接或与其他抗菌药物因素在肺,如肺collectins SP-A SP-D,抑制细菌生长。减少在MIP-2 BAL以及减少的中性粒细胞数量(无花果。5- - - - - -5度)可能反映了细菌减少负担或免疫调节性能的msc。类似的结果在LL-37抗菌性研究中报道了Cirioni et al。37]。在他们的实验中,作者描述的有利影响LL-37治疗模型的有限合伙人,E。杆菌在老鼠身上,CLP-induced败血症。他们认为保护作用LL-37其杀菌活性,能够降低血浆内毒素水平和细胞因子在脓毒性的动物。在后续研究中(38),同一组仅显示LL-37给定的系统,提供了防止致命的P。绿脓杆菌感染cyclophosphamide-treated粒细胞减少性老鼠。在我们的实验结果证明的好处msc的抗菌和免疫抑制特性大肠杆菌肺炎。

目前的研究也有一些局限性。作为抑制性抗体LL-37只是部分减少了msc在球的抗菌活性(图6摄氏度),很可能还有其他抗菌素的因素可能是诱导msc。虽然我们检测抗菌效果和释放LL-37 ATII细胞(图。7),我们没有研究的贡献LL-37 ATII急性炎症反应的细胞。有趣的是,一项研究Tjabringa et al。39]表明,LL-37,除了其抗菌活动,可能导致激活先天免疫的气道上皮细胞通过ERK1/2激活和引发释放增加,表明LL-37发挥监管作用抗菌和气道上皮细胞的炎症反应。体内模型中,我们没有探索msc是否改变了其他的抗菌活性细胞,如中性粒细胞和巨噬细胞。

Conclusion

总之,人类msc参与先天免疫反应对革兰氏阴性细菌分泌的抗菌肽,LL-37。这种肽的分泌与先前的细菌刺激和诱导体外和体内抗菌作用。因此,人类同种异体msc可能是有益的细菌感染,因为他们的抗菌性以及免疫调节的影响。

一个cknowledgements

我们感谢Eric Soupen博士,他的帮助与PCR实验。我们也感谢Bihn Diep博士,苏小,医学博士蒋禄卡Samarani,医学博士吉姆,霍华德,医学博士,Ph.D., Sandra Brady, and Jason Abbot for their advice and technical assistance. This work was supported by NHLBI 51856, 51,854 and NIAID A1053194 (M.A.M.), NHLBI 093026 (J.W.L.), and NHLBI HL092059 (N.G.). Some of the materials employed in this work were provided by the Texas A&M Health Science Center College of Medicine Institute for Regenerative Medicine at Scott & White through a grant from NCRR of the NIH, Grant P40RR017447.

Disclosure的P这种不Conflicts的我兴趣的

作者指出任何潜在的利益冲突。

References

作者指出