文摘
间质性肺病(ILD)与肺纤维化是一种重要的表现在系统性硬化症(硬皮病,SSc),这预示着预后不良。然而,预测生物标记的发展和严重性SSc-ILD尚未验证,和产生这种肺反应的发病的机制知之甚少。在这项研究中,我们将演示在两个不同的患者人群的水平chitotriosidase (Chit1)生物活性和蛋白质显著增加的循环和肺SSc患者相比人口匹配控制。我们还证明,患者与非肺参与患者相比,循环Chit1 ILD展示高水平的活动,与疾病的严重程度。小鼠建模表明,与野生型小鼠相比,bleomycin-induced肺纤维化在Chit1显著降低−−/老鼠和显著增强肺从Chit1 overexpressing转基因动物。体外研究也表明Chit1与TGF-β1增强纤维母细胞TGF-β受体1和2表达和TGF-β-induced Smad和MAPK / ERK激活。这些研究表明Chit1 SSc ILD的潜在生物标志物和治疗目标SSc-associated肺纤维化和证明Chit1增强TGF-β1影响通过增加受体表达和规范以及经典之中TGF-β1信号。
介绍
硬皮病、系统性硬化症(SSc)是一种多系统疾病,其特征是皮肤和内脏纤维化。近70%的患者SSc肺参与,这已经成为这个障碍患者死亡的主要原因(1)。许多这样的病人SSc-associated间质性肺病(SSc-ILD)正常的肺被替换为发炎纤维组织(2)。尽管42%的SSc-ILD将死于疾病进展的患者在10 y诊断(1自然历史的障碍相当),变量,一些患者经历加速肺功能丧失和其他人展现稳定性随时间或进展非常缓慢(3,4)。目前,没有办法预测哪些患者会进展和候选人更多的强化治疗和/或转诊肺移植,病人会更懒惰,可以免去这些干预固有的潜在的副作用。的开发和验证临床疾病进展的预测和可存取的测量会因此大有好处。不幸的是,生物标志物预测发生或SSc-ILD尚未验证。
TGF-β1是一个著名的监管机构的炎症,损伤,重塑和修复,已与众多疾病的发病机制,病理组织炎症和纤维化(5- - - - - -7)。符合SSc-ILD这些反应的重要性,努力针对定义角色TGF-β1的障碍。这些研究强调了TGF-β1-like分子签名SSc-ILD患者的成纤维细胞(8)。相比之下,增加纤维母细胞生产TGF-β1本身没有那样容易欣赏(9,10)。硬皮病成纤维细胞也展示夸张TGF-β1受体表达和信号在缺乏外源TGF-β1 (11- - - - - -13)这似乎是有关增强激活下游信号通路(8,14)或减少活动抑制SMADs (15)。然而,这些夸张的信号响应和生物标记物背后的机制,可用于评估他们没有适当的定义。
GH18基因家族包含绑定和分裂甲壳素的真正的几丁质酶。这些根一直留存在物种形成和发现人类从较低的生命形态。然而,他们的角色在哺乳动物生物学是神秘的,因为甲壳素(唯一已知的几丁质酶的底物)不用作营养更高的生命形式和甲壳素和几丁质合酶不存在于哺乳动物(16)。Chitotriosidase (Chit1,几丁质酶1)是最容易欣赏真正的几丁质酶在哺乳动物和人。它可以发现在正常个体的循环和已被证明是提高循环的戈谢病患者和其他疾病的特征是炎症和重塑(17- - - - - -20.)。动物实验也证明了重大变化在Chit1表达式的炎症,重构和纤维化(21,22)。然而,水平Chit1 SSc-ILD Chit1的角色,组织纤维化的发病机制和TGF-β1敏感性尚未完全解决。
我们假设Chit1是SSc-ILD生物标志物和治疗目标。解决前,我们量化循环Chit1活动相比,两组独立的SSc-ILD患者和疾病严重程度的这些值参数。解决Chit1纤维化的过程中所扮演的角色我们生成的空突变的小鼠Chit1和特征的影响肺部炎症和纤维化的突变模型。我们还利用体外研究定义Chit1 TGF-β1受体表达和信号的影响。我们的研究表明,Chit1活动增加患者的循环SSc-ILD和与疾病严重程度的客观指标。他们还证明Chit1的发病机制中起关键作用SSc-like纤维化肺疾病在老鼠身上。最后,他们提供机械的见解通过强调一种以前未被认识的能力Chit1增加TGF-β1受体表达和信号。
材料和方法
研究设计和主题
军团的病人年龄≥18 y, SSc的诊断基于现在的美国风湿病学院标准从纽黑文,CT,和芝加哥,IL,如前所述在我们的实验室和其他特征(23- - - - - -26)。患者排除基于以下标准:1)无法提供知情同意;2)重大nonvascular肺病;3)不稳定的心脏、血管或神经系统疾病在过去6个月;4)恶性肿瘤;5)怀孕;6)慢性感染;7)已知吸烟史。全面的临床资料,包括年龄、性别、种族和民族,并存病,药物,和生理障碍的比例预测用力肺活量(FVC)和扩散能力的一氧化碳(DLCO),收集。芝加哥军团额外scleroderma-specific变量如弥漫性皮肤疾病的存在与否,sci - 70状态和由Rodnan参与皮肤的严重程度得分也被评估。 A cohort of demographically matched normal controls was also recruited from the New Haven, CT, community. These human studies were performed with appropriate institutional approval.
测量Chit1活动
Chit1酶活性被评估为描述Hollak et al。(27),小修改。短暂,Chit1活动是由孵化μl血浆或血清200μl 22μmol / l fluorogenic衬底4-methylumbelliferylβ-d- N, N′, N′′-triacetylchitotrioside (Sigma-Aldrich、圣路易斯、钼)McIlvain缓冲区(100更易与l / l柠檬酸和200更易磷酸钠(pH值5.2))为30分钟37°C。的反应是停止通过混合2毫升0.3 mol / l glycine-NaOH缓冲区(pH值10.6)在室温下。Chit1产生荧光分子4-methylumbelliferone底物水解,是用荧光计量化(激发在366 nm,排放在446海里),相比之下,一个标准的校准曲线。Chit1活动表示为nanomoles孵化的底物水解每小时每毫升血浆或血清。肺Chit1活动使用相同的测量分析和20μl小鼠支气管肺泡larvage (BAL)流体。
量化的IL-13
等离子体IL-13蛋白质测定使用Luminex技术我们之前的描述(24)。
本地化的SSc Chit1表达式
免疫组织化学(包含IHC)进行本地化Chit1蛋白质使用多克隆兔反Chit1 Abs获得圣克鲁斯生物技术(圣克鲁斯,CA)和落实(马里兰州),被我们的实验室(28- - - - - -30.)。肺移植组织从SSc-ILD和nonfibrotic控制患者从匹兹堡大学获得。Chit1-expressing细胞数在六个随机选择大功率领域。这些值是平均意味着SSc-ILD±SE计算与正常的肺。
测量Chit1蛋白表达ELISA和免疫印迹
落下帷幕或肺部溶解产物Chit1被评估ELISA使用anti-Chit1兔多克隆免疫球蛋白捕获和生物素化的anti-Chit1紧随其后HRP-labeled链霉亲和素(Amersham生物科学/通用电气医疗集团生命科学,皮斯卡塔韦,NJ)检测。人类和小鼠anti-Chit1兔多克隆Abs得到落实。落下帷幕,免疫印迹进行评估的组织或细胞溶解产物根据程序建立在我们的实验室(28)。
测量Chit1 mRNA的表达
实时rt - pcr用于评估小鼠肺部的信使rna编码Chit1水平使用Chit1特定引物:5′-TGACTCTGCTGATGGTCCAG-3′(意义)和5′-TAGGCTGTTCAGCTCCTGGT-3′(反义)。
生成和表征Chit1-null (Chit1−−/老鼠)
针对向量是由取代∼6 kb的基因组区域包括外显子1 - 5和部分Chit1新霉素抗性基因的启动子盒,确保完全中断Chit1蛋白表达(补充图1 A - c)。目标向量被转染到胚胎干细胞,筛选了合适的重组和注入C57BL / 6胚泡。由此产生嵌合体动物被饲养来生成零动物纯合子。rt - pcr和免疫印迹分析证实,Chit1 mRNA和蛋白表达在Chit1完全废除−−/老鼠(数据未显示)。的Chit1−−/老鼠的总值和肥沃的正常出现在物理和显微镜检查。综述了所有动物协议和批准的机构在耶鲁大学动物保健和使用委员会。
代Chit1转基因小鼠
Lung-specific,诱导Chit1 overexpressing转基因小鼠(Tg)生成使用CC10启动子,反向四环素反式激活因子,和人类Chit1 cDNA根据先前建立的方法在我们的实验室(28)。用于生成的构造Chit1 Tg老鼠见补充图1 d。Chit1 Tg老鼠也是可行的,肥沃的,正常出现在物理和总值光显微镜检查。
博来霉素管理
Sex-matched 2-mo-old野生型(WT), Chit1−−/,Chit1 Tg(≥5老鼠/组)小鼠暴露在PBS和博来霉素溶液(0.035 U /公斤;Teva肠外的药品,欧文,CA)通过ip管理每隔一天28 d (31日)。他们牺牲后1 d最后注入和肺部。在选定的实验博来霉素通过单个管理气管内的注入(2.5 U /公斤)和老鼠牺牲和评估14 d后。
描述的角色在IL-13-induced Chit1反应
定义的角色Chit1 IL-13-induced肺的病理反应,我们Chit1繁殖−−/老鼠老鼠CC10 / IL-13 Tg(在我们实验室先前生成的)(32相比)和Tg老鼠的肺表型与WT零Chit1位点。
评估的炎症和纤维化
落下帷幕进行和恢复细胞的数量和微分所描述被评估为我们实验室(33)。肺部固定压力和评估)在耶鲁大学医学院的研究病理学实验室。组织学上使用马洛里的三色的污渍和纤维化是评估使用生化反应Sircol胶原蛋白量化描述由我们实验室(33)。
评价TGF-β1受体表达
MRC-5人类成纤维细胞孵化表示一段时间的媒介有10% FCS的rChit1 rTGF-β1,单独和组合,或其缓冲控制。孵化后所需的时间,TGF-β受体(TGFR) 1和TGFR2信使rna和蛋白质被实时rt - pcr和免疫印迹分析评估,分别由我们实验室(如前所述34,35)。以下引物被用于实时rt - pcr: 5′-GGTCTTGCCCATCTTCACAT-3′(意义)和5′-CACTCTGTGGTTTGGAGCAA-3′(反义)TGFR1和5′-GGGGAAACAATACTGGCTGA-3′(意义)和5′-GAGCTCTTGAGGTCCCTGTG-3′TGFR2(反义)。Anti-rabbit多克隆anti-TGFR1(微孔,泰梅库拉,CA)和TGFR2(细胞信号技术,丹弗斯,MA)用于免疫印迹评估。
评价TGF-β1信号
规范和经典之中TGF-β1信号通路被评估使用双重记者化验(SABiosciences,弗雷德里克,MD)和免疫印迹评估。规范化Smad-activating通路,Smad-responsive萤火虫荧光素酶构建持续表达Renilla荧光素酶被转染NIH3T3成纤维细胞。与rChit1和rTGF-β1刺激后,单独或结合,Smad激活是评估通过测量双荧光素酶的活动。典中的通路MAPK / ERK1/2和Akt激活使用免疫印迹评估如前所述评估(36)。
统计分析
正常的数据是使用D 'Agostino-Pearson综合评估正常测试。正态分布数据表示为±SEM手段和评估重要性的一个学生t测试或方差分析,适当的。分类变量使用Fisher精确检验进行比较。数据不是正态分布进行评估的意义使用克鲁斯卡尔-沃利斯检验了邓恩为多个比较或Mann-Whitney事后测试U测试了两组比较。非参数两个变量之间的相关性被斯皮尔曼等级测试评估。广义线性模型是用于多变量分析。
补充材料
补充表I和II是耶鲁大学和芝加哥军团的人口特征。补充表3显示了p值多元分析。补充图1是针对结构的示意图说明用于Chit1的生成−−/和Chit1 Tg老鼠。
结果
病人的特点
定义患者Chit1 SSc的规定,我们已经评估军团从纽黑文(以下称为耶鲁)和芝加哥。因为Chit1是暴露于香烟烟雾中引起的,我们执行一组初始的探索性分析控制吸烟的患者和没有历史。在这项研究中,我们发现,就像之前报道(37),循环Chit1活动明显高于血浆的吸烟者即使没有任何已知的肺病(数据没有显示)。因为我们感兴趣是否Chit1反映肺纤维化,而不是如何吸烟混淆这些结果,患者一个已知的历史活动之前或香烟烟雾暴露被排除在本研究之外。在耶鲁大学的人群中,我们比较健康的个人和SSc-ILD患者肺动脉高压被排除在外,他们天真的治疗。在这一群人,没有明显差异在年龄、种族、或性别的病人和对照组(补充表1)。然而,普遍的特性与SSc-ILD如食管反流的存在和减少预测百分比FVC和DLCO显著增加患者SSc-ILD(补充表1)。在芝加哥的人群中,我们比较SSc病人并没有证据ILD基于射线照相和/或肺功能测试。在这两种比较,没有明显差异的年龄,种族,性别,年龄疾病发病和严重程度之间的皮肤参与SSc患者和没有ILD(补充表2)。正如所料,在这群ILD患者更可能有肺功能异常(补充表2)。
Chit1活动SSc-ILD患者的循环
确定Chit1活动增加患者的循环SSc我们应用荧光方法血浆样本耶鲁组和正常对照组。显示与控制样本相比,适度水平的Chit1活动,等离子Chit1活动的水平更高SSc-ILD患者(8.1±3.34和15.5±2.4,p= 0.0009;图1一个)。这表明Chit1可能是有用的在这个病人疾病的生物标志物。
包含IHC Chit1表达式的分析肺
包含IHC Chit1生产下一个网站是用来定义SSc-ILD患者。这些研究显示很少Chit1-expressing肺细胞控制,以及数量显著增加患者的肺部终末期SSc-ILD(2.0±0.37和18.5±2.35,p< 0.0001;图1 b)。与以前的报告(一致37),在正常的肺Chit1表达仅限于一个低级信号在上皮细胞(巨噬细胞,基本上没有染色图1 c)。相比之下,SSc-ILD肺外植体显示Chit1表达式在巨噬细胞以及气道和肺泡上皮细胞(图1 d-f)。代表低功率图片所示图1克和1 h分别对控制和SSc-ILD肺。这些研究表明,夸大SSc-ILD患者血浆Chit1活动与夸张Chit1肺巨噬细胞和上皮细胞的蛋白表达。
Chit1 SSc-ILD患者的最高水平
在发现Chit1活动是提升SSc ILD的患者,我们下一个检查是否这个发现是针对那些SSc患者肺实质参与或是否SSc疾病状态有关。因为它已经先前表明Chit1活动之间是等价的血浆和血清(38),我们能够探讨这个问题从特征获得硬皮病血清样本中银行在芝加哥。这个群是用来确定Chit1水平高那些也ILD的SSc患者。病人特点补充表2所示。这一分析表明,SSc间质性肺病患者显示水平升高的血清Chit1活动相比,SSc病人没有ILD(25.22±3.87和13.86±2.54 nM /毫升/小时,p= 0.04;图2一个)。在这两个军团,这些学科水平受损FVC证明大幅增加的Chit1活动相比,那些保留肺功能(图2 b,2摄氏度,p所有比较p < 0.05)。
患者高Chit1活动的特征
进一步了解高水平的循环Chit1活动的重要性,我们进行了事后分析使用等离子Chit1活动和我们组的病人的记录特征(补充表III)。在这些评价,Chit1活动与年龄无关抽血的时候或者疾病发作,持续时间的疾病,或DLCO。Chit1活动的水平也没有与循环IL-13的水平(数据没有显示)。Chit1活动之间的重大关系和严重程度的皮肤或sci - 70积极参与也不感激(补充表III)。这个多变量分析也表明Chit1活动之间的相关性和肺部疾病的严重程度持续调整了潜在的混杂因素,包括年龄、性别、种族或民族,和食管反流(补充表III)。因为耶鲁队列不包括肺动脉高压患者或患者免疫抑制治疗,我们无法评估Chit1活动之间的关系和免疫抑制或肺动脉高压在这些科目。然而,在芝加哥队列没有关系使用免疫抑制和Chit1活动水平,有轻微的趋势增加Chit1患者肺动脉高压(p= 0.05)。在两组之间有显著负相关Chit1活动和预测百分比FVC (图2 d,2 e)。相结合,这些评估证明两个组别的水平循环Chit1活动独立与通气障碍和疾病的严重程度相关。
博来霉素和Chit1 IL-13感应
以上数据说明突出强烈的水平循环之间的关系Chit1活动SSc-ILD患者和疾病严重程度。然而,这些结果并不表明是否Chit1活动只是一个生物标志物或也会导致疾病发病机理。开始解决这一问题的研究来确定是否进行纤维发生的刺激改变体内Chit1表达式。每隔一天后28 d ip博来霉素,肺部炎症和纤维化是容易欣赏。这些改变与肺Chit1水平增加有关蛋白质,信使rna,活动(图3 a - c)。这个感应不是bleomycin-specific因为IL-13也刺激Chit1蛋白质和信使rna (图3 d,3 e)。SSc的人类肺样本,免疫荧光评估表明,这个Chit1局部肺泡上皮细胞和巨噬细胞(图3 f,3 g)。这些研究表明,博来霉素和IL-13肺Chit1的有力刺激器。
表征Chit1−−/老鼠
Chit1−−/在C57BL / 6小鼠背景成功生成和维护。在基线Chit1−−/老鼠是可行的,土地肥沃,是无法区分的WT同窝出生仔畜控制基于大小,外表,增长率或水平的身体活动(数据没有显示)。此外,尸检,光显微镜检查时,皮肤和内脏器官和圆),马洛里的三色的,弹性蛋白评价未能揭示WT和Chit1之间的差异−−/动物(数据未显示)。
Chit1在博来霉素和IL-13-induced肺纤维化
定义的角色Chit1 SSc-ILD-like肺纤维化发病机理的反应我们的响应相比,博来霉素和Tg过度缺乏Chit1 IL-13诱导的小鼠和WT控制。腹腔内博来霉素引起明显的肺纤维化和炎症(图4 a - c)。这个纤维化反应至少部分Chit1-dependent因为组织学和生化检测胶原蛋白积累显著降低肺从bleomycin-treated Chit1−−/老鼠(图4,4 b)。这个结果不相关博来霉素政府的路线,因为类似的结果被认为与气管内的博来霉素(数据没有显示)。博来霉素也不具体,因为类似的减少胶原蛋白积累出现在肺与零Chit1 IL-13 Tg老鼠基因座(图4 d,4 e)。有趣的是,尽管BAL Chit1细胞数没有显著减少−−/老鼠在ip或气管内的博来霉素管理局(图4摄氏度数据未显示),IL-13-stimulated炎症显著降低在缺乏Chit1 (图4 f)。这些发现表明Chit1博来霉素的发病机制中起着至关重要的作用——IL-13-induced肺纤维化和IL-13-stimulated组织炎症。
Tg的影响Chit1
CC10 /反向四环素反式激活因子/ Chit1 Tg老鼠有一个适当的目标和诱导转基因。在基线人类Chit1不是BAL从WT可检测的老鼠和Chit1 Tg的老鼠没有收到强力霉素。相比之下,Chit1容易被探测到(50 - 70 ng / ml)在矿山Chit1 Tg老鼠用强力霉素治疗≥48 h。有趣的是,Tg Chit1本身并不引起肺部炎症或结构改变因为Chit1 Tg小鼠正常肺总值和光显微镜检查后4周强力霉素管理(数据未显示)。相比之下,Tg Chit1并改变bleomycin-induced反应。这是研究欣赏WT和Tg小鼠被随机分为正常或强力霉素的水,然后用气管内的挑战博来霉素或车辆。如上所述,博来霉素引起的肺纤维化和炎症(WT老鼠图5)。重要的是,夸张的肺纤维化反应是在从Chit1 Tg老鼠(图5,5 b)。Chit1过剩没有定量或定性改变bleomycin-induced BAL和组织炎症以类似的方式(图5度和数据未显示)。当WT, Chit1−−/结合和Chit1 Tg老鼠,他们有必要证明Chit1最佳bleomycin-induced纤维化和足以直接增加bleomycin-induced组织纤维化反应。
Chit1 TGF-β1受体表达和信号的影响
人类研究证明Chit1 SSc-ILD疾病生物标志物和疾病严重程度,和我们的鼠标数据证明Chit1是多种形式的治疗目标TGF-β1-driven肺纤维化(39- - - - - -41)。因为增强TGF-β1信号被假定为SSc-ILD的发病机理(9,34,42),我们假设Chit1可能通过改变TGF-β1-induced受体表达和或信号。为了验证这个假设,我们评估的影响Chit1 TGFR表达式的孵化人类纤维母细胞MRC5细胞rChit1和rTGF-β1,单独和组合。符合之前的研究(43),TGF-β1刺激TGFR1的表达而抑制TGFR2表达式(图6)。Chit1本身没有刺激和不一致的表达抑制受体(图6)。相比之下,Chit1和TGF-β1互动来增强这两种受体的表达。具体地说,与Chit1聚集有关,TGF-β1增强TGFR1的表达而废除TGFR2抑制(图6)。
我们下一个评估的表达TGF-β1-responsive纤溶酶原激活物抑制剂promoter-driven Mv1Lu细胞荧光素酶构建处理rChit1 rTGF-β1,单独和组合。与受体的改变在协议上面所提到的,rChit1增强型TGF-β1激活这个构造的能力(图7)。评估标准信号,NIH 3 t3细胞被刺激与rTGF-β1 rChit1的存在与否,和SMAD2磷酸化是评估通过免疫印迹(图7 b)。我们还与SMAD-luciferase记者转染HEK 293细胞,治疗后评估的活化构造rTGF-β1和rChit1,单独和组合。这些研究表明,Chit1增强TGF-β1-induced SMAD2磷酸化和SMAD2记者激活(图7 b,7 c)。评估中的TGF-β1信号,我们评估的影响rChit1和rTGF-β1磷酸化的MAPK ERK1/2。这些研究表明,Chit1增强TGF-β1-induced ERK的磷酸化(图7 d)。因此Chit1与TGF-β1增加TGF-β1受体表达和规范以及经典之中TGF-β1信号。
讨论
来确定是否有SSc和几丁质酶之间的关系,我们比较Chit1活动的水平循环和积累Chit1 SSc和控制患者的组织。我们还生成Chit1−−/老鼠和老鼠Chit1 Tg和使用它们来定义的角色Chit1在肺纤维化的发病机制和小说定义机制,导致这些反应。这些研究表明,Chit1 SSc-ILD的潜在生物标志物是由肺巨噬细胞和上皮细胞并与疾病严重程度相关。小鼠研究也证明Chit1由博来霉素诱导,IL-13对于优化肺纤维化是必要的和足够的增强纤维发生的刺激的反应。最后,他们证明Chit1调和这些影响,至少在某种程度上,通过互动TGF-β1增加TGFR1 TGFR2表达式和规范中的TGF-β1信号。
我们的研究表明,水平的循环Chit1活动增加患者SSc的族群。肤浅的分析这可能似乎不同于SSc研究Bargagli et al。44)。然而,不同的人群,研究和采用的方法有可能解释这些对比的结果。具体来说,研究Bargagli et al。(44)不包括相当数量的严重疾病的患者,但只有评估单个病人群体,与高水平的历史控制使用循环Chit1活动,和不吸烟者排除在他们的人口。相比之下,使用两个军团从不同机构指出,Chit1的水平与疾病严重程度相关。有趣的是,在协议的研究Bargagli et al。(44),那么严重疾病患者没有Chit1活动增加。另外,我们同时处理Chit1活动的控制较低水平比那些Bargagli et al。(44)的研究。最后,吸烟者被排除在我们的研究而不是学业。众所周知,吸烟会增加Chit1表达式对其它正常的人类(37,45),我们的数据支持这个观点,Chit1活动的水平是非常高的现任或前任吸烟者在控制和SSc-ILD对象(数据没有显示)。
SSc是临床上异构条件特点是fibroproliferative血管病变和组织纤维化影响皮肤和多个内脏器官。器官参与的程度和疾病进展速度的主要因素是发病率和死亡率(25,46)。肺参与SSc死亡率的主要原因,最常见的肺参与ILD (47)。然而,器官的参与和疾病表型不容易预测患者群体或个人(25)。为了解决这个问题,调查人员已经将注意力集中在这种疾病的生物标记物的标准应该被用来评估他们。这些努力导致了大量的候选分子和评分系统(参了。25,48)。他们还强调了生物有效性和再现性的重要性,生物标志物的能力区分感兴趣的情况下,和生物标志物的可行性评估(25)。尽管有这些努力,验证生物标记物可以作为替代结果SSc缺乏的措施(25)。我们的演示,Chit1活动associates SSc-ILD和与疾病严重程度在两个不同的患者人群支持这个参数在病人的潜在效用和再现性评估。的现成的临床样本执行这个分析也证明了它的可行性。因为我们没有找到一个关系Chit1活动和许多SSc-relevant并存病的存在,很可能存在的肺实质疾病占Chit1增加记录。我们确实发现一个可能的关联Chit1活动和肺动脉高压在芝加哥群组。然而,由于这个协会只达到临界统计学意义,因为Chit1还被提拔的耶鲁样本肺动脉高压患者明确排除在外,很可能Chit1活动和SSc-ILD之间的关系是独立于肺血管疾病。与所有实验到临床事业一样,这些评估的局限性也必须牢记。具体地说,我们的战友都相对较小,没有评估Chit1和疾病进展之间的关系。此外,他们没有解决Chit1的效用评估的诊断SSc-ILD或程度Chit1活动水平在其他肺纤维化疾病增加。即使有这些限制,重要的是注意我们人类数据伴随着动物数据证明Chit1肺纤维化的发病机制中起着重要的作用。 This allows for the exciting speculation that interventions that abrogate Chit1 may be therapeutically useful in SSc-ILD and that assessments of circulating Chit1 activity may predict who will respond and who will not respond to these interventions.
TGF-β1一直被认为是一个中央中介的伤口愈合和组织纤维化(49,50)。符合这个概念,“硬皮病表型”认为,在某种程度上,夸张的自分泌刺激TGF-β1 (8,49,50)。这种假设基于动物的建模系统和SSc的研究组织。前者包括研究从我们的实验室和其他突出的重要性TGF-β1或Smad信号在博来霉素-,IL-13和移植物抗host-induced组织纤维化(49,50)。后者包括研究突显出夸张的积累TGF-β1 SSc伤疤的外围(51)和存在TGF-β1分子签名SSc组织(8)。然而,TGF-β1在SSc的确切作用还不清楚,因为它是现在知道夸大TGF-β1积累及其基因签名只看到SSc的易感患者(8,52- - - - - -54)。此外,I型胶原蛋白的过度SSc成纤维细胞是TGF-β1-dependent即使细胞不产生高浓度的活性或潜在TGF-β1 (55)。此外,现在升值,SSc组织清单对内源性TGF-β1反应过大(55),最优TGF-β1-induced纤维化反应通常需要与各种各样的代数余子式的互动等结缔组织生长因子(52)。学习增加我们的理解这些问题的复杂性,证明的水平循环Chit1增加患者SSc-ILD Chit1起着至关重要的作用在博来霉素和IL-13-induced纤维化的发病机制。他们还证明Chit1是一个重要的增强TGFR1 TGF-β1代数余子式和TGFR2表达式,以及规范和经典之中TGF-β1信号。这些发现与之前的研究结果相一致,表明TGF-β1签名的应用都是口头较多、笔头SSc ILD患者(8)。结合在一起,他们证明Chit1是一个重要的治疗目标SSc和表明Chit1水平升高有助于增强TGF-β1响应特性的障碍。
纤维化的“2型细胞因子假说”认为Th2炎症是一个主要的驱动力在终末器官的纤维化的发展(56)。符合这一假说,IL-13, Th2反应的主要纤维发生的效应在网站,是提高肺癌和循环的SSc和线性硬皮病患者或患者SSc-like反应假肢(24,57,58)。此外,遗传咨询和小鼠建模提供了证据,表明IL-13发挥了至关重要的作用在SSc纤维化的发病机制(59- - - - - -61年)。因此我们假设Chit1施加其影响导致IL-13-induced纤维化的发病机制。来测试这一假说,Tg小鼠持续表达IL-13越过了Chit1-null老鼠和IL-13的纤维化的影响评估与正常小鼠和零Chit1位点。这些研究表明Chit1 IL-13-induced纤维化的发病机制中起着至关重要的作用,因为肺纤维化和胶原蛋白积累水平减少从IL-13 Tg老鼠Chit1和足够的不足。与我们的研究结果与博来霉素相比,缺乏Chit1也减少IL-13引起组织炎症的能力。相结合,这些研究证明Chit1的发病机制中起关键作用由IL-13纤维化和炎症引起的。他们也表明Chit1也可能其他疾病的发病机制中发挥重要作用的特点是IL-13-driven装修如哮喘(32)。
Chit1,人类的相同器官nonvertebrate物种的几丁质酶,是一种最丰富的蛋白质产生的激活巨噬细胞(20.)。产量增加在戈谢病患者Chit1是验证疾病生物标志物水平的活动和对治疗的反应(20.)。也增加了其他疾病的特点是溶酶体功能障碍或巨噬细胞激活溶酶体储存等疾病,动脉硬化和非酒精性脂肪肝炎(20.)。然而,我们非常有限的理解生物学Chit1很难欣赏这些疾病的真正含义/ Chit1协会和方式Chit1有助于disease-relevant病理反应。在某种程度上,这是由于这一事实Chit1零突变的老鼠和老鼠过多表达Chit1没有生成,从而限制这些分子的小鼠模型。解决这个不足,进一步定义Chit1的生物学,我们生成和特征Chit1零突变的老鼠和老鼠过多表达Chit1 lung-specific时尚。这些研究表明Chit1肺纤维化的发病机制中起着重要的作用,高浓度的Chit1进一步增强组织纤维化反应。他们还提供了新颖的见解机制,有助于这些反应表明Chit1增强TGFR表达和规范以及经典之中TGF-β1信号。有趣的是,从我们实验室之前的研究表明,酸性哺乳动物几丁质酶和几丁质酶存在(称为BRP-39鼠标和YKL-40人)也有助于肺纤维化的发病机制和TGF-β1精化的感应(28,30.)。这些发现可以猜测Chit1有助于组织重塑的疾病的发病机理的特点是Chit1过剩。他们也证明有助于伤口愈合的能力,TGF-β1精化和信号,组织纤维化可能GH18家庭根的一般性质。
总之,这些研究表明在两个单独的病人群体循环Chit1活动升高SSc-ILD患者与疾病严重程度的客观指标。他们还证明Chit1的发病机制中起关键作用SSc-relevant组织纤维化反应,因为博来霉素和IL-13-induced肺纤维化是改善Chit1-null老鼠和bleomycin-induced纤维化增加lung-targeted Chit1 Tg老鼠。最后,他们提供见解的机制被证明参与这些反应Chit1与TGF-β1增加TGFR表达式,以及规范和经典之中TGF-β1信号。这些研究验证Chit1 SSc-ILD的生物标志物和治疗目标的干预措施可以直接控制SSc-ILD和其他纤维化疾病。
披露的信息
作者没有利益上的冲突。
脚注
这项工作是由美国国立卫生研究院的资助hl - 081639 (J.A.E.)和hl - 084225 (C.G.L.),以及一个既定硬皮病基金会的研究员奖(E.L.H.)。
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- 落下帷幕
- 支气管肺泡larvage
- Chit1
- chitotriosidase
- DLCO
- 扩散能力的一氧化碳
- FVC
- 用力肺活量
- 包含IHC
- 免疫组织化学
- ILD
- 间质性肺病
- SSc
- 系统性硬化病
- Tg
- 转基因
- TGFR
- TGF-β受体
- WT
- 野生型。
- 收到了2012年4月18日。
- 接受2012年6月28日。
- 版权©2012年由美国免疫学家协会有限公司