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研究文章免疫学免费接入|10.1172 / JCI27727
1免疫病理发生截面,寄生疾病实验室,国家过敏疾病研究所(NIAID),国家健康研究所,贝塞斯达,马里兰州,美国。2美国农业部农业研究服务贝尔茨维尔人类营养研究中心营养需求与功能实验室,美国马里兰州贝尔茨维尔。3.美国马里兰州Rockville的生物医学研究所。4.Wyeth Research,剑桥,马萨诸塞州,美国。5.哈佛大学公共卫生,波士顿,美国马萨诸塞州哈佛大学和传染病系。
通讯地址:托马斯·永利,免疫发病机制科,寄生虫病重点实验室,国家过敏和传染病研究所,卫生部,50楼,6154室,8003 MSC,马里兰州贝塞斯达20892,美国全国学院。电话:(301)496-4758;传真:(301)480-5025;电子邮件:twynn@niaid.nih.gov..
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2006年公布的7月3日 -更多信息
IL-21受体(IL-21R)显示出与IL-4R和CD4的显着同源性+Th2细胞是IL-21的重要来源。在这里,我们检查了IL-21R是否规范了体内TH2反应的发展。为此,我们感染了IL-21R- / -小鼠与Th2细胞诱导病原体曼氏血吸虫和Nippostrongylus取代巴西橡胶树并检测IL-21R缺乏对th2依赖性病理发展的影响。我们发现肉芽肿性炎症和肝纤维化明显减少S. Mansoni.IL-21R来华的- / -IL-21R+/+用可溶性IL-21R-Fc (sIL-21R-Fc)处理小鼠。肉芽肿反应受损也与Th2细胞因子表达和功能的显著降低有关,这可以通过组织中IL-4、IL-13、AMCase、Ym1和FIZZ1(也称为RELMα)反应的减弱得到证明。随后观察到类似的受损Th2反应N.Brasiliensis.感染。在体外,IL-21显著增加巨噬细胞中IL-4Rα和IL-13Rα1的表达,导致IL-4和IL-13刺激后的FIZZ1 mRNA和arginase-1活性增加。因此,这些数据确定IL-21R是替代巨噬细胞激活的重要放大器。总的来说,这些结果表明IL-21R在病原体诱导的Th2反应的发展中具有重要作用,这可能与炎症和慢性纤维化疾病的治疗相关。
所述IL-21受体(IL-21R)是I类细胞因子受体家族的一个新发现的成员(1那2).该受体与IL-4Rα链具有显著的序列和结构同源性,在人类和小鼠基因组中与IL-4Rα相邻,而其配体IL-21与细胞因子IL-2、IL-4和IL-15具有显著的同源性(3.那4.).因此,IL-21和IL-21R是γ链依赖的细胞因子网络的新成员,因为它们与需要γ链进行功能信号转导的细胞因子和受体具有同源性(5.).由于γ链网络的所有成员都在宿主免疫中发挥着重要而独特的作用,人们越来越关注IL-21R在体内抗原触发免疫反应中的新功能。
最初的研究检查其功能表明,IL-21拮抗NK细胞扩增,但它可以促进抗原特异性T细胞免疫,包括抗肿瘤免疫(6.-8.),研究结果表明IL-21可以连接先天性和适应性免疫反应(9.).IL-21还调节B细胞和CD8+T细胞在体内的功能(10.-15.).另外的研究表明,IL-21是Th2细胞因子可以抑制幼稚Th细胞分化成IFN-γ分泌Th1细胞(16.).事实上,外源性IL-21可以有效地抑制IFN-γ的产生,而不影响其他与Th1/ th2相关的细胞因子,这表明IL-21对IFN-γ的抑制具有高度特异性。因此,通过IL-21抑制Th1细胞发育的能力,推测IL-21可能促进Th2反应(16.).然而,IL-21R信号通路参与Th2反应发展的研究尚未在任何Th2依赖性疾病中进行研究。
在血吸虫病中,Th2细胞因子在疾病的发病机制中发挥不可或缺的作用(17.那18.).实际上,IL-4 / IL-13-,IL-4Rα-和Stat6缺陷小鼠均显示出感染后的肉芽肿形成和肝纤维化显着受损曼氏血吸虫(19.-22.).鉴于最近IL-21被分类为Th2细胞因子(16.那23.), IL-4和IL-21受体之间惊人的相似性(3.那4.),以及相关的IL-4Rα/Stat6信号通路在该疾病以及其他Th2细胞因子驱动的炎症性疾病中的关键作用(24.),从这些研究中发展的重要问题是IL-21R信令是否在Th2抗扰度的开始和/或维持中发挥着重要作用。
为了研究体内IL-21R的调节和功能,检查了几种不同的TH2依赖性炎症实验系统,包括肺和肝炎症的模型以及线虫感染的实验模型(18.那25.).在每种情况下,将WT动物的免疫应答与IL-21R缺陷小鼠进行比较(10.那26.).数据显示,当IL-21信号传导被阻断时,TH2相关病理的发展显着降低。IL-21还增加了巨噬细胞中的IL-4 / IL-13受体表达和氨基酶活性。这些研究的合并结果揭示了IL-21R在TH2驱动的炎症和纤维化中的重要作用。他们还表明,IL-21促进了可选地激活的巨噬细胞的发展,从而为慢性感染的IL-21R提供了减少的TH2依赖性病理学的可能机制- / -老鼠。
在Th1和Th2-偏振反应期间调节IL-21及其受体。相比于IL-21(16.那27.)几乎是关于IL-21R的调节和功能的知名。确定IL-21及其受体是否在体内病理TH2反应期间调节,我们使用了S. Mansoni.肉芽肿形成模型,其中已知Th2细胞因子在病变形成中发挥着突出作用(18.).在初步研究中,我们寻求确定IL-21和IL-21R mRNA表达是否与体内偏振TH2细胞因子反应连接。要做到这一点,我们使用了高度夸大的TH1(IL-4)的老鼠(IL-4- / -il - 10- / -)或Th2 (IL-12- / -il - 10- / -)暴露于的细胞因子响应S. Mansoni.鸡蛋。在il - 4- / -il - 10- / -Th1小鼠,IFN-γmRNA表达在攻击后第4天通过第4天在基线上增加75倍,并且在第14天通过第14天保持大约50倍(图1一种)。IL-13的mRNA并不在这些小鼠中可检测到在任何时间点,证实建立了高度极化的Th1炎症反应。相反,IL-12- / -il - 10- / -Th2小鼠在挑战后的所有时间点显示IL-13 mRNA的200至250倍,几乎没有变化IFN-γ。与显示高偏振表达模式的TH1 / TH2细胞因子相反,IL-21与偏振表型无关(图1b)。在两组中,IL-21 mRNA水平在血吸虫组卵攻击后,在基线上增加至少50倍,尽管在TH1-偏振小鼠中观察到的增加平均比TH2-偏振的动物大于3-4倍(数字1B). IL-21R也与Th1或Th2免疫应答无关。然而,与IL-21相比,IL-21R在th1偏斜的动物中更明显,在th2极化的小鼠中观察到IL-21R的最大反应。
IL-21和IL-21R表达在高偏振TH1和TH2免疫应答期间。il - 10- / -il - 4- / -(th1)和IL-10- / -il - 12- / -(Th2)小鼠(N=每组5)致敏腹膜内用新鲜分离的蛋S. Mansoni.并挑战I.v.14天后。在挑战后的第4,8和14天,处死小鼠,单独制备肺部RNA样本,用于IL-13和IFN-γ的实时RT-PCR分析(一种)、IL-21及IL-21R (B.).基因表达(平均值±SEM)在HPRT正常化后,随着WT对照组的翻倍增加而表达。多次重复实验得到了相似的结果。*P.<0.05。
在IL-21R缺陷小鼠的肺部减少了Th2细胞因子产生。基于IL-21R在受血吸虫卵刺激的小鼠中表达的显著升高(图1),我们接下来检查IL-21R信令是否影响TH2反应的发展。在这些实验中,天真WT和IL-21R- / -小鼠被注射活血吸虫卵,在接下来的14天里监测肺、脾脏和引流淋巴结中Th2细胞因子和Th2调控基因的产生情况。在WT小鼠中,IL-21R mRNA表达在鸡蛋暴露后迅速增加,并在攻毒后第14天保持升高(图)2A). IL-21也有类似的表现,在第7天出现表达高峰,之后略有下降。值得注意的是,IL-21R中IL-21的表达在第7天和第14天一致且高度显著下降- / -提示IL-21R正影响其自身配体的表达。与先前的观察结果一致(28.那29.), th2相关细胞因子IL-4和IL-13在WT小鼠肉芽肿组织中表达逐渐升高,第14天可检测到5 ~ 15倍的升高。相比之下,IL-21R中IL-4和IL-13的mRNA表达显著降低- / -组织。虽然在攻击后的第4天和第14天的WT小鼠中检测到IFN-γ和IL-10 mRNA的几乎没有变化,但IL-21R的IFN-γ和IL-10的产生也略微下降- / -动物。因此,减少Th2应答的IL-21R观察- / -与Th1细胞因子产生的增加无关。然而,与肉芽肿组织相比,在体外用可溶性卵抗原(SEA)或有丝分裂原(刀豆蛋白A [Con A];数字2b)。事实上,SEA始终在来自IL-21R制备的淋巴结培养物刺激更强的IL-5,IL-10,和IL-13的响应- / -老鼠。尽管如此,与肺中的降低Th2反应一致,在IL-21R中观察到的肉芽肿形成一个更迅速的分辨率- / -动物(图2C)。此外,我们观察到与可选的巨噬细胞相关的几种基因的显着降低(30.-33.),提供进一步证明IL-21R中体内Th2效应响应的总体减少- / -老鼠(图2d)。
Th2型细胞因子的产生在血吸虫卵激发的IL-21R的肺减少- / -老鼠。WT(白条)组和IL-21R组- / -小鼠(灰色条)被静脉注射活的S. Mansoni.鸡蛋和第4天,第7天和14天牺牲。(一种)从肺组织制备RNA并单独分析(N通过实时RT-PCR =每组/时间点5个。盒子的顶部和底部分别表示七十五和二十五百分位数;框内的线路表示前五百分位数;顶部和底部晶须分别指示测试样品的九象和十分之一。没有检测到的nd。*P.<0.05,**P.<0.01,***P.<0.001与WT。(B.)脾(SPL)和肺相关的淋巴结(LALN)分别汇集(2个独立的组,每组3-4只小鼠),和单细胞悬浮液测定IL-5,IL-10,IL-13,其在Con A(1毫克/毫升)或SEA的存在下,72小时的温育后IFN-γ(20毫克/毫升)。结果为平均值±SEM。细胞因子低于检测在未受刺激的培养水平。(C)肉芽肿大小(体积,mm3.×10-3)肉芽肿中的嗜酸性粒细胞的百分比被显微化。(D.)肉芽肿性肺组织中th2调控的炎症基因的实时PCR分析。所有数据至少代表2个单独的实验。
Th2应答在IL-21R被减小- / -小鼠感染巴西血吸虫后。确定减少的Th2效应反应是否针对S. Mansoni.肺肉芽肿形成,我们感染WT和IL-21R- / -与肠道线虫的小鼠Nippostrongylus取代巴西橡胶树.感染是通过在皮肤下接种第三期幼虫建立的。当寄生虫成熟时,它们从接种部位迁移,通过循环系统进入肺部。一旦进入肺部,寄生虫就会触发强烈的、高度极化的Th2反应(34.),这是通过分析几Th2细胞相关的基因的表达在肺(图证实3.a)和肺相关淋巴结(图3.b)。在炎症区-1(FIZZ1;也称为Relmα)中,IL-4,IL-13,酸性丁质酶(AMUSASE)的肺和淋巴结显示出显着的IL-4,IL-13,酸性丁质酶(AMUSASE)的增加。和YM1 mRNA表达N.Brasiliensis.感染(图3.,a和b)。然而,与肺肉芽肿模型一致,我们观察到IL-4,IL-13和Amcase水平显着降低,并且在IL-21R的肺部中略微降低的YM1和FIZH1 mRNA水平- / -老鼠(图3.一种)。减少淋巴结显示出类似的减少,尽管在淋巴结中的YM1和FIZT1的减少更显着(图3.B).两个组织之间唯一的其他主要区别是AMCase mRNA的反应,这似乎仅限于肺。总之,这些数据证实了IL-21R在体内Th2反应发展中的重要作用。然而,值得注意的是,尽管Th2反应明显减弱,但N.Brasiliensis.IL-21R来华的- / -小鼠在成虫排出方面没有明显的延迟(数据未显示)。
Th2反应受损N.Brasiliensis.IL-21R来华的- / -老鼠。肺(一种)和肺相关的淋巴结(B.)从个人的第7天删除N.Brasiliensis.未治疗的C57BL/6或IL-21R- / -老鼠 (N=每治疗组5例)。RNA被分离出来,cDNA被生成,如图图例所示2.通过实时定量PCR单独为IL-13,IL-4,Amasa,YM1和FIZH1分析mRNA。折叠变化是基于对幼稚动物的感染小鼠的比较。用类似结果重复该实验。*P.<0.05,**P.<0.01,***P.<0.001与WT。
在IL-21R的肺部中,TH2细胞因子驱动的炎症减少了- / -老鼠。我们还检查了IL-21R是否调制次级TH2反应的发展。对于这些实验,WT和IL-21R- / -小鼠致敏S. Mansoni.鸡蛋和挑战i.v.2周后。正如预期的那样,敏感的小鼠开发出强大的肉芽肿反应,较高4-至5倍(图4.C)比初级挑战动物(图2C).在初级模型中观察到,在鸡蛋暴露后,肺中IL-21和IL-21R mRNA显著增加,尽管IL-21反应在次级刺激中更早达到峰值。与IL-21相比,IL-21R仅轻微升高,但在两个时间点均显著升高,而il - 21mrna水平在第4天达到峰值后下降(图)4.因此,有证据表明配体在组织中有更紧密的调控。我们还注意到IL-21R中IL-21的表达显著下降- / -小鼠中,证实了受体和其配体之间的有效的反馈机制。中的Th2相关的细胞因子,IL-13表现出最稳健的响应,显示在WT小鼠中50〜100倍的增加超过基线。然而,它减少了到10〜20倍以上的IL-21R的背景- / -小鼠,证明IL-21R是最大的次级TH2反应的最大开发所必需的。再次,IL-21R中的Th2细胞因子表达的减少- / -小鼠没有伴随IFN-γ的显着增加。事实上,IL-21R的肺部中的IFN-γmRNA表达减少了- / -老鼠。然而,在淋巴结和脾脏中,敲除显示出适度但一致的IFN-γ产量增加,表明总体上对Th2细胞因子有更大的抑制(图)4.b)。与初级蛋挑战模型一致,在肉芽肿组织中,Th2和Th1细胞因子产生的减少更加明显(图4.A),尽管sea诱导的Th2反应在脾脏中也部分减少(图4.b)。二次粒状炎症的显着降低与肺中较弱的Th2反应的发展一致(图4.此外,我们还观察到FIZZ1、Ym1和AMCase的表达显著下降(图)4.d),进一步证实在IL-21R次级的Th2效应器应答的显著损害- / -老鼠。
IL-21R中的细胞因子驱动的炎症降低- / -老鼠。WT(白色条)和IL-21R- / -小鼠(灰色柱)致敏腹膜内鸡蛋,静脉注射挑战用活2周后S. Mansoni.鸡蛋,然后在挑战后的第4天和第7天牺牲。(一种)从肺组织制备RNA并单独分析(N= 5每如上面的图例所述图组/时间点),通过实时RT-PCR2.(B.)对IL-5,IL-10,IL-13和IFN-γ进行测定的脾和肺相关的淋巴结(IFN-γ,促抗原(海)或丝分裂原刺激(CON A)。(C)肉芽肿尺寸(mm3.×10-3)肉芽肿中嗜酸性粒细胞的百分比在wt中被定量定量(N= 10 [第4天];15 [第7天])和IL-21R- / -老鼠 (N= 11 [第4天];16 [第7天])。(D.)肉芽肿组织中Th2炎症基因的实时PCR分析(N=每组5人/时间点)。所示数据是3个单独实验的综合结果。*P.<0.05,**P.<0.01,***P.<0.001与WT。
在曼氏杆菌感染il - 21r缺陷小鼠中,IgG抗体、肉芽肿峰值大小和Th2细胞因子均降低。为了确定IL-21信号是否在维持慢性th2主导的反应中是必需的,我们将动物经皮暴露于S. Mansoni.感染术治疗感染术治疗急性和慢性时间点的病理反应和免疫应答。如在肺肉芽肿研究中观察到的,在感染的WT小鼠的肝脏中有一个标记的上调和IL-21 mRNA表达。相反,IL-21 mRNA在IL-21R中几乎不可检测到- / -小鼠甚至慢性感染后(图5.A).在感染急性期,IL-21R- / -小鼠Th2细胞因子mRNA表达也明显降低(图)5.一种)。然而,变化再次限制在肉芽肿组织,因为这两个基团的淋巴结和脾细胞的反应是类似的下列体外刺激寄生虫抗原(图5.B).我们在体外检测中注意到的唯一一致的差异是脾细胞培养中IL-5和IL-10的产生减少了2到3倍。的IL-21R- / -小鼠在感染后,在急性阶段也显着较小的肉芽肿(图5.C),这与肝脏中IL-4和IL-13反应的降低一致(图)5.一种)。然而,这并不伴随着肉芽肿中嗜酸性粒细胞百分比的任何明显变化(图5.C)。对病变的更详细的微观分析证实,肉芽肿的整体组成没有可检测的变化(图6.一种)。我们还检查了IL-21R缺陷是否专门影响CD4的招募+T细胞的肉芽肿组织。为了解决这个问题,使用了肺肉芽肿模型,使我们能够更好地同步炎性细胞的募集。肝肉芽肿的组织学评价(图一致6.A), CD4的百分比+在接触卵子后,肺部的T细胞大约增加了2倍;然而,WT和IL-21R的模式相似- / -老鼠(图6.b)。因此,CD4的变化+T细胞募集或扩增不太可能解释在组织中观察到的Th1/Th2细胞因子反应的减少。相反,它们似乎是整体炎症反应更普遍的减少的结果。重要的是,两组感染后第12周均有效下调肉芽肿反应(18.).因此,慢性时间点在肉芽肿大小没有显着差异(图5.C).我们还在慢性感染的敲除小鼠中检测到Th2细胞因子应答的微小损伤(图)5.A).在慢性感染的IL-21R中,急性期观察到的FIZZ1和Ym1的显著减少也减少了- / -动物(图5.然而,在第12周,AMCase的表达仍然非常低,这表明在慢性感染IL-21R中,至少有一部分th2驱动的应答持续减弱- / -老鼠。
经皮后慢性肝病S. Mansoni.在缺乏IL-21R的情况下,感染减少。WT(白色条)和IL-21R- / -小鼠(灰色棒)被感染25-30S. Mansoni.cercariae。所有动物在感染后9周(急性)或12周(慢性)处死。(一种)从肝组织中分离RNA并单独分析(N= 8-10每组/时间点),通过实时RT-PCR在图例中所描述的图2.(B.) 2-4组小鼠脾脏和肠系膜淋巴结(MLN),单细胞悬液检测IL-5、IL-10和IFN-γ。所显示的数据是3个单独合并组的平均值。地中海、中孤独。(C)肉芽肿尺寸(mm3.×10-3)在WT中显微地评估肉芽肿中嗜酸性粒细胞的百分比(N= 30 [week 9];17[第12周])和IL-21R- / -老鼠 (N= 27 [week 9];19日(第12周))。(D.)肉芽肿肝组织中TH2炎症基因的实时PCR分析(N= 8-10 /组/时间点)。所显示的数据是在第9周进行的3个单独实验和第12周进行的2个实验的综合结果。*P.<0.05,**P.<0.01,***P.<0.001与WT。
IL-21R缺乏对肉芽肿的细胞组成没有影响。(一种)在WT感染9周的肝脏中评估单个肉芽肿的细胞组成(白色条;N= 10)和IL-21R- / -(灰色棒;N= 9)小鼠。小淋巴细胞的平均值±SEM(包括CD4 / CD8 T细胞),大淋巴细胞(LG LYM; B细胞和血浆细胞),巨噬细胞(Mac),成纤维细胞(纤维),嗜酸性粒细胞(EOS)和桅杆显示细胞(MC)。(B.)从幼稚WT和IL-21R灌注肺中分离淋巴细胞- / -小鼠和7天以下的静脉注射5000挑战S. Mansoni.鸡蛋。在直方图中的数字表示CD4的百分比-和CD4.+总肺淋巴细胞之间的T细胞。
的IL-21R- / -还检查了小鼠的血清AB水平的变化(图7.和表1).与它们抑制的细胞因子反应相一致(图5.IL-21R)- / -小鼠的寄生虫特异性IgG明显减少1(Th2细胞相关的抗体)和IgG2B.(th1-相关的ab)滴度,其保持在慢性时间点(图7.然而,有趣的是,这并不伴随着IgE的任何显著变化(图)7.b),表明仅在血清AB同样物的子集中进行选择性损伤。外源性IL-21已被证明抑制IgE生产(11.),这可能解释了慢性感染IL-21R中IgE轻微升高的原因- / -老鼠。重要的是,IL-21R中的TH2响应性的总体减少- / -小鼠不归因于,因为鸡蛋的类似号码寄生虫负担差异,两组各时间点的组织中发现了成对的成虫寄生(表1).
IL-21R缺乏显著减缓Th2细胞因子依赖性纤维化的进展。WT(白色条)和IL-21R- / -小鼠(灰条)感染S. Mansoni.cercariae。处死9(急性)和12周(慢性;一种-C)或29周(晚期慢性;D.感染后)。(一种)小鼠在牺牲时被吹入,并且通过ELISA测定海同种型特异性AB滴度。(B.)血清总IgE值。(C-E.)肝纤维化的评估标准是每10000枚卵子在肝脏中检测到的羟脯氨酸(μmol)含量(C)或每肝脏(D.和E.).在E., WT C57BL/6小鼠用IgG处理2A对照Ab或sIL-21R-Fc治疗5周。*P.<0.05,**P.<0.01,***P.<0.001与WT。
IL-21R缺乏减慢肝纤维化的进展。因为Th2细胞因子被认为在组织纤维形成中起主要作用(17.那35.),我们检查了肝纤维化的发展和进展S. Mansoni.IL-21R来华的- / -老鼠。在感染后的各个时间点作为直接测量组织胶原含量的直接测量,在各种时间点测定肝羟脯氨酸水平。正如预期的那样,在感染的WT小鼠中观察到标记的肝纤维化(图7.C)相反,IL-21R- / -小鼠在急性和慢性时间点显示出显着较低的纤维化。特别是,在感染后29周,IL-21R- / -与WT小鼠相比,小鼠的总肝胶原含量的降低大于50%(图7.D),从而证实了IL-21R在依赖于Th2依赖性纤维化进展中的重要和不可或缺的作用。
我们还检查了IL-21抑制剂是否可以减缓感染的WT小鼠纤维化进展。对于这些实验,通过可溶性IL-21R-FC(SIL-21R-FC)或对照蛋白处理C57BL / 6小鼠的组,总共5周,从感染后第6周开始,围绕鸡蛋首先在肝脏中检测到。虽然这两个组都有类似的蠕虫和组织蛋负担(数据未显示),但接受IL-21阻滞剂的小鼠在实验终止时显示出肝纤维化的大于50%(图7.E).肝脏中IL-4和IL-13 mRNA表达也降低,肉芽肿大小减少约15%(数据未显示)。因此,这些数据很好地补充了用IL-21R进行的实验- / -老鼠。
IL-21信号传导促进了可选地激活巨噬细胞的发展。因为氨基酶-1(ARG-1),FIZT1和TGF-β1已与纤维化的发育相关联,并且在IL-21R的患病组织中减少了几种TH2 / Stat6调节基因的表达- / -老鼠(图2-5.)(30.那33.),我们检验了是否精氨酸 - 1,FIZZ1,和TGF-β1都在用IL-21刺激直接调制在巨噬细胞。精氨酸-1和FIZZ1也可替代地活化巨噬细胞的公知的标记物(33.).对于这些研究,产生骨髓衍生的巨噬细胞培养物,然后用IL-4,IL-13和IL-21的各种组合刺激。正如预期的那样,IL-4和IL-13增加了ARG-1和FIZH1 mRNA表达,当两种刺激组合使用时观察到添加剂效果(图8.A).值得注意的是,尽管单独使用IL-21对这两种基因均无影响,但经过IL-21预处理的培养物在随后使用IL-4和IL-13刺激时,Arg-1和FIZZ1 mRNA表达显著增加(图)8.一种)。相同的组合也显着增加了细胞中氨基酶的功能,这通过测定尿素的产生来评估(图8.b)。相比之下,IL-21对培养上清液中的总或活性TGF-β1的水平没有影响(补充图1;在本文中可用; DOI:10.1172 / JCI27727DS1)。出乎意料的是,我们发现单独的IL-21治疗显着增加了IL-4Rα和IL-13Rα1的表达(图8.C)。相比之下,IL-4和IL-13单独使用时没有影响(图8.C),并且当三种刺激组合使用时没有额外的影响(数据未显示)。
IL-21信号通过调节IL-13R的表达促进巨噬细胞的替代激活。IL-21 (20 ng/ml)单独或联合IL-4 (20 ng/ml)和IL-13 (20 ng/ml)处理骨髓源性巨噬细胞过夜。在一些实验中,巨噬细胞在注射IL-4和IL-13之前先用IL-21预处理6小时。20小时后细胞被裂解,real-time RT-PCR单独分析RNA。(一种)通过测量评估IL-21促进替代巨噬细胞激活的能力Arg-1和FIZT1.mRNA的表达。(B.通过测量l-精氨酸转化为尿素(mg/dl±SEM;一式三份测量)。(C通过实时PCR评估IL-4Rα和IL-13Rα1mRNA的表达。在所有条件下(未显示)几乎不可检测到IL-13Rα2mRNA。数据所示一种那B., 和C代表3个单独的实验。(D.)天真C57BL / 6只小鼠挑战I.v.有5000岁的生活S. Mansoni.从第1天到第6天,每隔一天用PBS或重组IL-21 (2 μg/剂量)处理。动物(N=每组5只)处死第7天,和肺IL-13Rα2的mRNA水平通过实时PCR测定,并表示为相对于未处理的对照组倍的增加。小鼠也放血在处死时,和sIL-13Rα2的个体血清样品中的量通过ELISA测定。*P.< 0.05;Arunachal Pradesh,P.<0.01;***P.<0.001。在单独的研究中获得了类似的结果。
因为IL-13Rα2也可以影响il -13依赖的信号传导(32.那35.那36.),我们还检查了IL-21是否调节IL-13Rα2的产生。毫不奇怪,因为IL-13Rα2主要由诸如成纤维细胞和平滑肌等非发育细胞产生(19.那38.-40),我们在骨髓来源的巨噬细胞培养中没有发现诱骗受体调节的证据(数据未显示)。然而,当我们在体内检测诱饵受体的调节时,IL-21下调了卵细胞刺激小鼠肺中IL-13Rα2 mRNA的表达,并显著降低了血清中sIL-13Rα2的水平(图)8.d)。这些数据共同表明IL-21通过在巨噬细胞中的TH2 IL-4R(信号传导受体)和同时降低血清中的SIL-13Rα2(诱饵受体)的水平来促进替代活化巨噬细胞的开发。这两种机制可能导致IL-4 / IL-13刺激的巨噬细胞中的ARG-1和FIZT1的激活增加。因此,它们为Helminth感染的IL-21R中的Th2响应和Th2依赖性纤维化提供了额外的机械解释- / -老鼠。
IL-21最近被认为是一种Th2细胞因子,可以抑制原始Th细胞向产生IFN-γ的Th1细胞分化(16.).因为血吸虫病的免疫反应从早期的IFN-γ演变为持续的和占优势的Th2反应(18.),我们研究了IL-21R信号对蠕虫诱导的Th2反应发展的影响。WT小鼠感染S. Mansoni.肝脏中的IL-21和IL-21R表达增加,证实了IL-21信号传导与Helminth诱导的Th2免疫的关联。然而,在肺中,血吸虫卵在Th1-和Th2-极化反应中诱导显着的IL-21表达。事实上,当小鼠偏振到Th1反应时,IL-21表达的增加最多。这些数据表明IL-21表现出比其他TH2相关细胞因子的表达较少的抑制模式。IL-21的受体也未能显示TH / TH2特异性模式。然而,IL-21R在th2-肺部诱导近4倍的肺部比在Th1-偏振小鼠中,这提供了IL-21R信号传导可能参与TH2介导的炎症的调节之一。
为了确定在没有IL-21R的情况下是否损害Th2效应反应,我们检查了在TH2-偏振条件下优先诱导的几种基因的表达。这些基因包括Amcase,YM1和FIZT1,所有这些都被认为在调节Th2介导的炎症中起重要和非冗余的作用(30.-32.那36.那41.).尽管在原发性、继发性或慢性免疫反应中观察到一些变化,但在每个病例中IL-21R的水平都有所不同- / -小鼠显示出这些th2相关基因的显著下降。Ym1和AMCase是与低等生物几丁质酶同源的一个蛋白家族的成员(30.).虽然在宿主免疫反应的确切功能仍然不明朗,它们被认为在嗜酸性粒细胞,组织重塑和纤维化中发挥重要作用。事实上,最近的一项研究表明,AMCase中和能改善过敏原引起的炎症和气道高反应,从而表明哺乳动物几丁质酶的Th2型免疫中的参与(31.).FIZT1也与组织纤维发生有关(36.那42.).因此,IL-21R的主要功能可以是调节伤口愈合和纤维化的机制。因此,除了参与蠕虫诱导的免疫应答之外,IL-21R可以参与调节各种TH2介导的炎症障碍。
在血吸虫病中,IL-21R缺乏对疾病的进展产生了深远的影响。虽然WT和IL-21R中感染强度相同- / -小鼠,在没有IL-21R的情况下,蛋诱导的炎症反应显着降低。我们还观察到二次肉芽肿形成的显着降低以及肺中原粒组织的更快分辨率。这些数据在一起说明了IL-21R在肉芽肿炎症中的不可或缺的作用。作为之前的研究表明,IL-4和IL-13对于病变形成至关重要(19.),因此我们假设IL-21R直接或间接地影响这些细胞因子的活性。我们知道IL-21不是单独作用的,因为在IL-4/IL-10双敲除小鼠中观察到极高水平的IL-21,但在这些th2缺陷动物中肉芽肿形成几乎完全消除(43.那44.).因此,IL-21似乎与IL-4和IL-13合作诱导最大的反应。我们也没有观察到肉芽肿中IL-21R的细胞组成的变化- / -小鼠和CD4中没有特定的损伤+T细胞招聘。这些研究结果表明,IL-21R通过调节TH2效应响应的总体强度来调节寄生虫诱导的病理学的发展。
IL-21未被认为直接调节IL-4诱导的TH2细胞分化(11.那16.).相反,在最近的一篇论文中假设,IL-21可能通过下调产生IFN-γ的Th1细胞的扩张来放大th2驱动的反应(16.).因此,我们推测,在血吸虫感染小鼠的IFN-γ反应可能在没有IL-21R的增加。虽然在体外肺相关淋巴结中观察到的少量增加,IFN-γ产生是一贯在肉芽肿组织减少。因此,有一个从我们的研究,内源性IL-21R是至关重要参与IFN-γ生产的蠕虫感染过程中抑制几乎没有证据。相反,IL-21R- / -小鼠同时产生在组织中较弱的Th1和Th2细胞因子应答。IgG中的显著减少2B.(Th1-associated)和免疫球蛋白1感染后所有时间的(th2相关)抗体滴度支持这一结论。Th2细胞因子在mRNA水平上也降低,在肺和淋巴结N.Brasiliensis.感染。实际上,所有直接的离体数据都证实了受影响组织内的Th2细胞因子表达和功能的显着降低。尽管如此,在抗原重新诱导后,抗原淋巴细胞的分离淋巴细胞产生了无一致的降低,这表明IL-21R- / -小鼠能够产生显著Th2应答,在体外至少的。因此,我们的结论是IL-21R被选择性地增强体内Th2应答。除了促进Th2应答,所述IL-21R也增加IL-21的产生。因此,IL-21R显示以自分泌的方式操作,以驱动Th2细胞因子的表达和Th2效应子功能在体内。
为了进一步阐明相关机制,我们还检测了IL-21是否直接调节巨噬细胞功能,因为我们的体内数据显示,与“交替激活”表型相关的几个基因显著减少(33.那45.).表现出交替激活表型的巨噬细胞和成纤维细胞是血吸虫肉芽肿的主要细胞成分,功能研究表明,它们在疾病的进展中起着关键作用(46.).事实上,Brombacher等人的一项重要研究表明,完全缺乏交替激活巨噬细胞的小鼠在感染后会发生致死的卵诱导病理S. Mansoni.(47.).此外,由于巨噬细胞来源的TGF-β1参与了il -13介导的纤维化机制(48.那49.),我们检测了IL-21是否调节巨噬细胞中TGF-β1的产生。为了研究这些问题,我们测量了IL-21、IL-4和IL-13不同组合刺激后骨髓源性巨噬细胞中Arg-1和FIZZ1 mRNA、精氨酸酶活性和TGF-β1蛋白反应。Arg-1和FIZZ1是IL-4Rα/ stat6依赖的基因(42.那46.那50.);因此,它们可以作为替代巨噬细胞活化的功能标记物。重要的是,研究结果表明,当巨噬细胞暴露于IL-21时,它们对IL-4和IL-13诱导Arg-1和fizz1的活性变得更加敏感。通过尿素的产生来评估精氨酸酶的活性也显著增加,证实IL-21是高功能交替激活巨噬细胞发育的重要刺激因素。而IL-21对巨噬细胞TGF-β1的产生无影响。因此,促纤维化细胞因子TGF-β1似乎没有参与,这与以往研究TGF-β1在血吸虫病中的作用一致(51.).相反,我们发现IL-21在骨髓衍生的巨噬细胞中显着增加了IL-4Rα和IL-13Rα1表达,并降低了体内SIL-13诱饵受体的产生,这可能解释了对IL-4和IL的增强敏感性-13。因此,这些数据恭维我们的IL-21R的体内研究- / -小鼠并表明IL-21R信号传导的重要功能是增强可变活化的巨噬细胞的发展,这涉及纤维化机制(46.那52.).此外,因为交替激活的巨噬细胞已经被证明会放大CD4+Th2细胞分化(53.),这些数据也可能解释了蠕虫诱导的IL-21R中Th2活性的整体下降- / -老鼠。
在人血吸虫病中,纤维化肝脏病理的发展是慢性发病率和死亡率的原因原因(18.那54.).因为已知Th2细胞因子反应在胶原沉积中起重要作用(17.),在最终的一系列实验中,我们检查了IL-21R对肝纤维化进展的影响。值得注意的是,IL-21R的纤维化的发展显着下降- / -小鼠,敲除动物显示在感染后第29周肝纤维化减少超过50%。重要的是,用sIL-21R-Fc处理感染的WT小鼠时也产生了类似的结果。因此,IL-21R被认为是抗纤维化治疗的潜在新靶点。总之,这些研究表明IL-21R在Th2细胞因子介导的疾病进展中具有重要作用。因此,IL-21R应该被加入到调节Th2免疫和巨噬细胞极化的重要受体名单中。
小鼠,寄生虫感染和抗原制剂。雌性或雄性C57BL / 6,C57BL / 6 / AI-IL-10KO / IL-4KO和C57BL / 6 / AI-10KO / IL-12KO小鼠从Taconic获得(55.).繁殖对IL-21R- / -从容纳在哈佛公共卫生学院(一个繁殖群体获得在C57BL / 6背景的小鼠26.).所有小鼠都被安置在美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)和美国实验室动物护理认证协会(American Association for the Accreditation of Laboratory Animal care)批准的设施中,在特定的无病原体条件下饲养。NIAID动物护理和使用委员会批准了所有实验程序。S. Mansoni.如前所述从受感染的小鼠(生物医学研究所)的肝脏中提取蛋(56.).对于同步肺肉芽肿的诱导,给予小鼠5,000个蛋I.v.对于诱导二次肉芽肿,小鼠敏化I.P。5,000个活鸡蛋,然后用5,000个活蛋挑战I.v.(25.).在感染实验,将小鼠通过尾经皮感染25-30尾蚴波多黎各应变的S. Mansoni.(NMRI)Biomphalria glabrata蜗牛(生物医学研究所)。从纯化和均化获得海洋和可溶性蠕虫抗原制剂(交换)S. Mansoni.如前所述的虫卵及成虫(57.).所有动物在牺牲时接受灌注,使得可以如前所述确定蠕虫和组织蛋负担(57.).N.Brasiliensis.如前所述制备幼虫(L3)(58.).通过S.C接种小鼠。注射500 L3。在接种后第7天,收集肺组织和纵隔淋巴结进行细胞因子分析。
组织病理学和纤维化。肺和肝肉芽肿大小分别对染色用瑞氏姬姆萨染色(美国的Histopath)组织切片来确定。每只小鼠大约30肉芽肿被纳入所有分析。一个熟练的病理学家评估嗜曙红细胞,肥大细胞,和其它类型的在相同的部分单元的百分比。在肝脏和肠和肝脏中的胶原蛋白含量血吸虫卵,如由羟脯氨酸水平测量的数目,如前面所描述的进行测定(57.).通过Bergman和Loxley的技术作为羟脯氨酸测量肝胶原蛋白(59.)在110℃下在5ml 6N HCl中水解200mg部分肝脏18小时。肝羟脯氨酸的增加与所有实验中的卵数正相关,肝脏胶原蛋白报告为每10,000个卵μmol的正常肝胶原醇的增加([感染肝胶原蛋白 - 正常肝胶原] /肝蛋×10-4)或每对蠕虫μmol。在慢性时间点的晚期,纤维化被报道为每个肝脏的总肝胶原蛋白。同一个人对所有的组织学特征进行了评分,并且不知道实验设计。
荧光激活细胞分选分析。收获整个肺部并置于RPMI中。通过通过70μm尼龙网(BD Biosciences - 猎鹰)来破坏组织。洗涤单细胞悬浮液,通过与缓冲的氯化铵裂解溶液孵育3分钟,裂解RBC。用PE-Cy5标记的抗CD4标记肺淋巴细胞,以及在荧光激活的细胞分选缓冲液中与Fc嵌段(ABS来自BD Biosciences-Pharmingen),在4℃下加入15分钟。洗涤后,使用Flowjo软件(Tree Star Inc.)在Facscalibur流式细胞仪(BD Biosciences)上分析细胞。
IL-21阻断实验用的sIL-21R-Fc的。C57BL / 6小鼠(N每组= 10个)通过30-35的尾巴经皮S. Mansoni.cercariae。感染后第6周开始,小鼠用小鼠sIL-21R-Fc的(惠氏)处理或抗柔嫩艾美耳球虫鼠IgG.2A控制ab(wyeth)。每只小鼠通过I.P接收一个200μg剂量。每周注射3次,共5周。感染后12周处死小鼠,通过羟脯氨酸测定法测定肝纤维化。
淋巴细胞培养及细胞因子ELISA检测。脾和肠系膜淋巴结(感染模型)或肺相关淋巴结(肺部模型)在无菌条件下除去,并且如先前所述制备单细胞悬浮液(52.).培养物在37°C、5% CO的湿化气氛中培养2.用SEA (20 μg/ml)、SWAP (50 μg/ml)、Con A (1 μg/ml)或单独培养基刺激细胞。72小时收集上清液并检测细胞因子的产生。IFN-γ、IL-5和IL-10采用双抗体夹心酶联免疫吸附测定(BD Biosciences - Pharmingen),如前所述(52.).用使用重组鼠细胞因子(BD Biosciences-Pharmingen)构建的标准曲线计算细胞因子水平。根据制造商的协议使用鼠IL-13 ELISA试剂盒(R&D Systems)测量IL-13水平。根据制造商的协议,使用小鼠TGF-β1Duoset ELISA开发系统(研发系统)量化TGF-β1水平。为了避免牛衍生的TGF-β1污染,将细胞在PBS中洗涤3次并在含有0.5%小鼠血清的培养基中培养。
RNA分离和纯化和实时PCR。总RNA从肺和肝组织样本中提取,分别置于1ml TRI中zol试剂(Invitrogen)。使用组织多螺纹(OMNI International)均化样品,并根据制造商的建议提取总RNA,并通过QIAGEN使用RNEasy Mini试剂盒进一步纯化。单个样品RNA(1μg)使用上标II逆转录酶(Invitrogen Corp.)和寡核苷酸(DT)和随机引物的混合物逆转录。实时RT-PCR在ABI棱镜7900HT序列检测系统(应用生物系统)上进行。使用Sybr Green PCR母系混合物(Applied Biosystems)和通过对ABI棱镜7700 / 7900HT序列检测系统的应用生物系统描述的比较阈值循环方法测定几种基因的相对量。在该方法中,将每种样品的mRNA水平标准化为次值脱黄胍磷酰基转移酶(HPRT)mRNA水平,然后表达为与未感染的对照中的水平相比的相对增加或减少。使用Primer Express软件(2.0版;应用生物系统)设计了引物。IL-13,IL-4,IL-10和HPRT的引物(46.);IL-13Rα2(32.);和ym1,fizz1和amcase(44.之前发表过。其他引物序列如下:IL-21,感测5'-GCCAGATCGCCTCCTGATTA-3',反义5'-CATGCTCACAGTGCCCCTTT-3';IL-21R,感测5'-CTCCCCCCTTGAACGTGACT-3',反义5'-TTGCCCCTCAGCCACGTAGTT-3';IFN-γ,感测5'-AgagCCAGATTATCTTTTTCTACCTCAG-3',反义5'-CCTTTTTTCGCCTTGCTGTG-3'。
血清AB同种型分析。根据生产商的方案,使用BD OPtEIA小鼠IgE ELISA试剂盒(BD Biosciences - Pharmingen)测定总IgE。SEA-specific免疫球蛋白1和IgG2B.采用间接ELISA法测定同型特异性抗体滴度。用PBS稀释的10 μg/ml SEA (100 μl/well)包被Immulon 4板,用连续2倍稀释的血清样品进行分析。Biotin-Rabbit Anti-Mouse免疫球蛋白1(Zymed)用于1:1,000稀释。接下来是过氧化物酶,标记的链霉抗生物素蛋白(KPL)底物为1:1,000稀释。二阶辣根过氧化物酶 - 共轭兔兔抗小鼠IgG2B.1000稀释:(Zymed公司)的Ab以1使用。在孔中的吸光度,加入100μl一个部件ABTS过氧化物酶底物(KPL)后使用的Vmax动力学酶标仪(Molecular Devices)上在405nm处读取。
骨髓衍生的巨噬细胞。从雌性C57BL / 6小鼠中回收骨髓,并在含有补充DMEM(L929条件培养基)的培养皿(100mm×15mm)中培养6天。6天后,收获细胞并以0.5×10的浓度接种6.细胞/孔在24孔板中含有补充的DMEM(10%FBS,2mM的L.-Glutamine,100u / ml青霉素和100μg/ ml链霉素)。用IL-4,IL-13和IL-21(R&D Systems)刺激细胞20小时。在一些测定中,用IL-21预处理细胞。裂解细胞,使用RNA清除程序纯化RNA,用RNEasy试剂盒(QIAGEN)。
氨基酶活性测定。骨髓衍生的巨噬细胞镀以6×105.细胞/孔在96孔组织培养板,并用IL-4,IL-13,和IL-21的组合刺激。IL-21之前的IL-4或IL-13刺激加入6小时。在刺激后,将细胞用PBS洗涤,并用裂解含0.1%蛋白酶抑制剂(Roche Diagnostics)上的Triton X-100。将裂解物转移到96孔PCR板和用10mM的MnCl孵育2和50mM Tris HCl(pH7.5)在55℃下活化酶10分钟。在酶活化后,除去25μL裂解物并在新的PCR板中加入到25μL1M精氨酸(pH9.7)中,并在37℃下温育20小时。将5μl每一式一式两份加入到96孔ELISA板上,以及5μL每种标准,在相同的测定条件下稀释,从100mg / dl开始。根据制造商的协议使用来自生物测定系统的尿素测定试剂Quantichrom尿素测定试剂盒。
统计数据。肝纤维化(调整卵数)随着感染强度(蠕虫对)的增加而降低。因此,通过对协方差的分析来比较这些变量,使用总肝脏卵作为每卵的羟脯氨酸含量的协变量和对数。通过1向ANOVA或2尾学生进行了没有使用感染强度改变的变量T.测试(57.).使用ANOVA评估细胞因子mRNA表达和肉芽肿大小的变化。差异被认为是显着的*P.<0.05,**P.<0.01,和***P.<0.01。
作者感谢Fred Lewis(美国马里兰州洛克维尔生物医学研究所)提供的寄生虫材料。我们还要感谢Keith Olson、Sandy White和NIH的动物护理人员提供的技术援助。最后,我们感谢Margaret Mentink-Kane、Rachael Reiman、Mark Wilson和Eldad Elnekave提供的有益讨论、评论和建议。美国国立卫生研究院(NIAID)的内部研究项目支持了这项研究。
非标准的缩写使用:AMCase,酸性的几丁质酶;Arg-1 arginase-1;Con A,刀豆蛋白A;FIZZ1,位于炎症区1;- r受体;s -可溶;SEA,可溶性卵抗原。
利益冲突:作者宣称不存在利益冲突。
参考信息:j .中国。投资。116.: 2044 - 2055(2006)。doi: 10.1172 / JCI27727。
John Pesce和Mallika Kaviratne对这项工作做出了同样的贡献。