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人类间充质基质细胞减少甲型流感H5N1-associated急性肺损伤在体外和体内gydF4y2Ba
2016年2月13日,由罗伯特·g·韦伯斯特(发送审查2015年8月24日;由彼得·j·奥彭肖路易斯·奥尔蒂斯,丹尼尔·佩雷斯)gydF4y2Ba
意义gydF4y2Ba
急性肺损伤,包括肺泡液体间隙,受损严重的呼吸道病毒感染,是一种危及生命的并发症和缺乏有效的治疗方法。理解这种并发症可能的机制提出新的治疗方法。这里,我们发现,在体外,流感A / H5N1感染损害肺泡液体间隙超过了季节性病毒,模仿的更严重的病人。我们证明了这个障碍是由从感染细胞可溶性因子的释放,导致肺泡钠和氯离子转运蛋白的下调。间充质基质细胞预防或减少这种影响体外和体内/感染h5n1病毒的老鼠。这些细胞提供一个潜在的有效的治疗急性肺损伤严重的流感。gydF4y2Ba
文摘gydF4y2Ba
流感可导致急性肺损伤。因为免疫反应中发挥作用,抗病毒药物不能确保一个成功的结果。确定致病机制和潜在的辅助治疗的选择,我们比较的程度禽流感A / H5N1病毒和季节性流感A / H1N1病毒损害肺泡液体间隙和蛋白质渗透率在急性肺损伤的体外模型,定义的角色占据可溶性介质在这些损伤的影响,并证明了影响是预防或减少骨骨髓来源多能间充质基质细胞。我们确认这些发现在老鼠体内相关性的实验感染流感A / H5N1病毒。我们发现,体外,肺泡上皮细胞的蛋白质渗透率和流体间隙特异表达的可溶性免疫介质释放后感染禽流感(H5N1) /香港/ 483/97,但不是季节性(/香港/ 54/98,H1N1流感病毒。降低肺泡液体运输与下调的钠和氯转运蛋白是预防或减少coculture间充质基质细胞。岁的体内,治疗感染h5n1病毒的小鼠间充质基质细胞生存的可能性增加了。我们得出这样的结论:间充质基质细胞显著减少损伤肺泡液体间隙引起的A / H5N1感染体外,防止或减少/ H5N1-associated急性肺损伤体内。这种潜在的辅助治疗严重influenza-induced肺病权证快速的临床研究。gydF4y2Ba
急性肺损伤是一个连续的临床和影像学变化,终止在最严重的急性呼吸窘迫综合征。感染高致病性禽流感(HPAI)病毒H5N1和最近H7N9亚型常常会导致急性肺损伤而季节性流感病毒和2009年大流行H1N1流感病毒很少这样做。相关急性肺损伤的潜在机制仍不清楚,缺乏有效的疗法。高致病性的病毒对人类本质上(例如,H5N1病毒)可能不同的低致病性(LP)(例如,季节性H1N1流感病毒的复制能力,细胞趋向性,和/或细胞因子失调(gydF4y2Ba1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。H5N1疾病的早期治疗antiinfluenza药物奥司他韦是有用的但不确保一个良好的结果(gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)。因此,有效的辅助治疗方法,不需要妥协有益的宿主防御(gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
H5N1型病毒(gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)和H7N9 (gydF4y2Ba6gydF4y2Ba流感病毒)目标肺泡上皮细胞,形成至关重要的肺部气体交换接口。这些细胞也有助于保持intraalveolar和矢量交通血管内流体内稳态的钠、氯和水从顶端到肺泡上皮的基底外侧表面[肺泡液体间隙(AFC)]。亚足联受损,增加肺泡蛋白质渗透率(APP)对急性肺损伤(gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)。治疗规范化肺泡液体间隙可能会自由的脱靶效应,与免疫调节,这可能促进病毒复制。gydF4y2Ba
来源于多功能的人类骨骼间充质基质细胞(msc)应用程序在多个临床疾病,包括脓毒症、心肌梗死、糖尿病、急性肾功能衰竭(gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)。同种异体MSC治疗有益的临床影响内毒素、细菌和ventilator-induced急性肺损伤(gydF4y2Ba9gydF4y2Ba)通过MSC分泌的可溶性旁分泌生长因子而(Ang1)和角质细胞生长因子(KGF) (gydF4y2Ba9gydF4y2Ba,gydF4y2Ba10gydF4y2Ba)。msc还可以转移线粒体和微泡,调节免疫和上皮反应损伤(gydF4y2Ba11gydF4y2Ba)。目前临床试验正在测试msc治疗脓毒症和急性呼吸窘迫综合征(gydF4y2Ba12gydF4y2Ba)。然而,对msc在急性呼吸道病毒感染的影响,包括流感,除了msc的研究未能减少influenza-induced小鼠肺损伤(gydF4y2Ba13gydF4y2Ba)。在这里,我们表明,流感A / H5N1病毒感染也许亚足联和应用体外诱导感染细胞释放可溶性介质用来抑制肺泡钠和氯转运蛋白。当我们与msc cocultured肺泡上皮细胞,这些损伤机制是预防或减少。然后我们治疗小鼠感染流感A / H5N1 msc和演示了一个临床显著减少肺部病理学和增加生存与调制这些体内致病机制。gydF4y2Ba
结果gydF4y2Ba
高致病性禽流感H5N1病毒感染可以减少亚足联人类肺泡上皮细胞和提高应用程序。gydF4y2Ba
层的主要人类肺泡上皮细胞紧密连接示威被种植在顶端钱伯斯的transwell文化插入基底外侧室可用于coculture与msc、或成纤维细胞或PBS控件(gydF4y2Ba图1gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)。流感H5N1、H7N9和人类季节性H1N1流感病毒复制同样在这些细胞(gydF4y2Ba无花果S1。gydF4y2Ba)。在实验条件下使用,ZO-1紧密连接染色的肺泡上皮细胞在感染病毒的细胞不受影响,transepithelial阻力(> 1000欧姆)是维护postinfection 48 h。虽然H1N1病毒54/98亚足联和应用程序的影响最小,H5N1病毒(483/97、486/97和3046/04)和(Sh2)(完整的H7N9病毒病毒名称列出gydF4y2Ba材料和方法gydF4y2Ba(所有的)减少造成更大的前进着gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.0001)(gydF4y2Ba图1gydF4y2BaBgydF4y2Ba)和增加更大的应用程序(gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.008,0.007,0.007和0.032,分别)(gydF4y2Ba图1gydF4y2BaCgydF4y2Ba)比模拟感染24小时postinfection (p)。促炎细胞因子的混合物(Cytomix (IL-1β,TNF-α和IFN-γ)]作为积极的控制。其他人类季节性流感病毒,甲型H1N1流感(好/ 447),H3N2(1174/99),和H3N2(好/ 370),亚足联的影响和应用类似于H1N1 54/98 (gydF4y2Ba无花果S2。gydF4y2Ba)。无病毒从感染病毒的肺泡上皮细胞条件培养液(病毒过滤后)同样影响亚(gydF4y2Ba图1gydF4y2BaDgydF4y2Ba)和应用程序(gydF4y2Ba图1gydF4y2BaEgydF4y2Ba)。因此,观察到的效果是由可溶性介质释放H5N1或H7N9感染病毒,但不是H1N1病毒感染,肺泡上皮细胞,而不是直接病毒细胞病变效应。gydF4y2Ba
与msc Coculture亚足联减少H5N1感染的不利影响,应用,人类肺泡上皮细胞和促炎细胞因子的反应。gydF4y2Ba
当H5N1 483/97-infected肺泡上皮细胞cocultured与msc(每)100000个细胞,病毒对亚足联和应用明显放缓的影响(gydF4y2Ba图2gydF4y2Ba),显示在mock-infected细胞水平类似的水平。与人类肺成纤维细胞或PBS Coculture没有效果(gydF4y2Ba图2gydF4y2Ba)。msc存在剂量依赖的相关性影响H5N1-impaired亚足联和应用。然而,即使有10000个细胞,msc仍然调解显著降低亚足联的损伤和减少增加的应用,分别是(gydF4y2BaS3无花果。gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
mRNA表达的主要促炎细胞因子和趋化因子IFN-β,白介素(IL) 1β,咆哮,IP10,白细胞介素6、IL8也显著大于在肺泡上皮细胞感染H5N1病毒的细胞483/97感染人类流感H1N1 54/98 (gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.041,0.035,0.006,0.003,0.031,和0.038,分别)或mock-infected (gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.033,0.042,0.004,0.003,0.024,和0.034,分别)。Coculture H5N1病毒感染与msc显著降低IL-1β肺泡上皮细胞(gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.035),咆哮(gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.024)、白细胞介素6 (gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.022),IL8 (gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.031)和IP10 (gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.006)mRNA水平与细胞没有MSC coculture (gydF4y2Ba图3gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
Coculture msc防止下调的钠离子和氯离子转运蛋白在H5N1病毒感染肺泡上皮细胞。gydF4y2Ba
主要钠和氯转运蛋白mRNA水平下降了54/98 H1N1感染,更降低了H5N1感染(483/97gydF4y2Ba图3gydF4y2BaBgydF4y2Ba)。这些影响被证实在囊性纤维化跨膜电导调节蛋白表达(雌性生殖道)(3.2倍少蛋白表达在24小时和48 h p。同时,我与H5N1gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.006)和α1Na K-ATPase(3.1倍和7.1倍少蛋白表达在24小时和48 h pi与H5N1,gydF4y2BaPgydF4y2Ba分别为= 0.008和0.006)(gydF4y2Ba图3gydF4y2BaCgydF4y2Ba)。这些H5N1-induced效应被coculture预防与msc在48 h p。我和转运蛋白的表达雌性生殖道和α1Na K-ATPase显著提高(gydF4y2BaPgydF4y2Ba<分别为0.009和0.007)(gydF4y2Ba图3gydF4y2BaCgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
msc Cocultured感染h5n1病毒的肺泡上皮细胞分泌Ang1和KGF。gydF4y2Ba
Ang1和KGF旁分泌可溶性的有利影响因素与msc在临床前模型(gydF4y2Ba10gydF4y2Ba)。后coculture MSC的肺泡上皮细胞感染了H5N1病毒,在MSC Ang1浮在表面的私家侦探在24小时增加了500倍和1015倍48 h p。,而在模拟cocultures(水平gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.006)(gydF4y2Ba图4gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)。同样,KGF分泌通过msc cocultured H5N1病毒感染肺泡上皮细胞在模拟cocultures大于253倍(gydF4y2BaPgydF4y2Ba在48 h p = 0.005)。gydF4y2Ba图4gydF4y2BaBgydF4y2Ba)。这些影响没有观察到在msc cocultured H1N1病毒感染肺泡上皮细胞。gydF4y2Ba
评估的影响Ang1和KGF亚足联H5N1病毒感染肺泡上皮细胞和应用,我们有选择地撞倒Ang1和/或KGF蛋白质msc利用Ang1 KGF siRNAs,单独或在一起。我们cocultured H5N1 483/97-infected人类肺泡上皮细胞transwell膜与msc转染核或与炒核控制基底transwell室。预处理和Ang1 siRNA KGF siRNA MSC-mediated亚足联的增加减少了35%和30%,分别比模拟或与炒siRNA-transfected msc (gydF4y2BaPgydF4y2Ba分别为= 0.036和0.042)(gydF4y2Ba无花果。S4gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)。同样,MSC预处理与Ang1 siRNA或KGF siRNA MSC-mediated减少的应用减少了44%和39%,分别比模拟或与炒siRNA-transfected MSC (gydF4y2BaPgydF4y2Ba分别为= 0.008和0.007)(gydF4y2Ba无花果。S4gydF4y2BaBgydF4y2Ba)。此外,siRNA可拆卸的Ang1和KGF减少骨髓间充质恢复亚足联的能力和应用了58%和46%,分别为(gydF4y2BaPgydF4y2Ba分别为= 0.027和0.007)(gydF4y2Ba无花果。S4gydF4y2Ba)。相反,增加100 ng / mL重组人(rh)仅Ang1和KGF H5N1病毒感染肺泡上皮细胞在缺乏msc亚足联的virus-mediated降低减少了∼60% (gydF4y2Ba无花果。S4gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)和应用∼56%的增加(gydF4y2Ba无花果。S4gydF4y2BaBgydF4y2Ba)。因此,MSC介导亚足联的减少,通过分泌Ang1和KGF部分中应用障碍。然而,这两个因素加在一起没有减少H5N1-mediated肺损伤通过MSC coculture,暗示其他可溶性因子或其他机制发挥协同作用。gydF4y2Ba
MSC治疗H5N1病毒感染小鼠的影响。gydF4y2Ba
我们评估了MSC治疗对生存的影响,体重,肺肺泡蛋白质渗透率,肺泡液体间隙,肺细胞渗透,H5N1病毒感染和肺部病理学的老鼠。在年轻小鼠(年龄的6 - 8周)挑战与H5N1病毒486/97和治疗在第五天pi增长值msc (5×10gydF4y2Ba5gydF4y2Ba100μL),细胞生存和减肥都比得上小鼠成纤维细胞治疗(gydF4y2Ba无花果S5。gydF4y2Ba)。然而,生存(gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.032)(gydF4y2Ba图5gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)和体重(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05)(gydF4y2Ba图5gydF4y2BaBgydF4y2Ba显著更大的感染,MSC-treated老鼠岁(年龄8 - 12月)岁比控制,尽管类似肺病毒滴度在7到10天皮。(即。天2和5 post-MSC治疗)(gydF4y2Ba无花果S6。gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
wet-to-dry肺重量比较显示肺泡液体间隙的净效应,而伊文思蓝染料的溢出液体泄漏到肺泡空间的一个指标。MSC-treated老鼠wet-to-dry肺重量明显低于控制在第七天皮老鼠。gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.023)(gydF4y2Ba图5gydF4y2BaCgydF4y2Ba)。伊文思蓝染料的浓度明显降低肺MSC-treated和控制在第十天皮老鼠。gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.015)(gydF4y2Ba图5gydF4y2BaDgydF4y2Ba)认为MSC治疗能降低血浆蛋白的血管渗漏。总蛋白浓度在支气管肺泡灌洗(BAL)流体在MSC-treated显著低于控制在第七天皮老鼠。gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.004)(gydF4y2Ba图5gydF4y2BaEgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
MSC治疗并不影响细胞的总数BAL液(gydF4y2Ba无花果S6。gydF4y2BaBgydF4y2Ba)。然而,BAL流体在第七天pi显示CD4细胞明显减少gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞(gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.008)和NK细胞(gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.039)和更多的巨噬细胞/单核细胞(gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.028)MSC治疗后纤维母细胞治疗后(gydF4y2Ba图5gydF4y2BaFgydF4y2Ba)。MSC治疗后,单核细胞/巨噬细胞的人口BAL流体与M2表型(CD11c肺泡巨噬细胞为主gydF4y2Ba+gydF4y2BaLy6CgydF4y2BaintgydF4y2BaF4/80gydF4y2Ba+gydF4y2Ba)(gydF4y2Ba14gydF4y2Ba)(gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.023)(gydF4y2Ba图5gydF4y2BaGgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
大多数细胞因子和趋化因子蛋白的浓度测试(IP10、MCP-1 MCP-3, M1P-1α,咆哮,il - 4, IL-17,和tnf)明显降低MSC-treated BAL流体的老鼠比fibroblast-treated老鼠在第七天皮。(gydF4y2Ba无花果S6。gydF4y2BaCgydF4y2Ba)。雌性生殖道的肺溶解产物蛋白表达明显高于MSC-treated老鼠比fibroblast-treated在第十天皮老鼠。通过免疫印迹分析,如图所示(gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.007,gydF4y2Ba图5gydF4y2BaHgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
H5N1流感病毒感染的小鼠有或没有MSC治疗显示肺部病理学(gydF4y2Ba图6gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)和组织病理学评分(gydF4y2Ba图6gydF4y2BaCgydF4y2Ba在第十天皮)。,but MSC-treated mice had significantly less lung pathology at day 18 p.i. (图6gydF4y2BaBgydF4y2Ba)。血管周的支气管旁,和整体的组织病理学评分MSC-treated老鼠明显低于fibroblast-treated老鼠在18天皮。gydF4y2BaPgydF4y2Ba分别为= 0.018,0.023,和0.015)(gydF4y2Ba图6gydF4y2BaCgydF4y2Ba)。MSC-treated和控制老鼠似乎并没有不同在肺泡上皮或内皮细胞增殖。gydF4y2Ba
讨论gydF4y2Ba
在这里,我们表明,可溶性介质释放甲型流感H5N1病毒感染肺泡上皮细胞损害肺泡液体间隙和蛋白渗透显示肺泡钠和氯转运蛋白。病理学是预防或减少coculture MSC在体外和MSC治疗在老年小鼠体内。gydF4y2Ba
高致病性H5N1流感病毒和H7N9亚足联明显引起更大的损伤和应用在培养人类肺泡上皮细胞比季节性H1N1和H3N2流感病毒。这种效应主要是由可溶性介质引起和生长因子释放的H5N1病毒或H7N9感染病毒,但不是H1N1-infected肺泡上皮细胞,而不是通过直接病毒细胞病变效应或病毒复制能力。感染H5N1,而季节性H1N1流感病毒也导致更大的Na的下调,K-ATPase在肺泡上皮细胞和雌性生殖道转运体蛋白质。流感病毒感染之前证明损害肺泡液体运输通过抑制上皮细胞钠离子通道活动通过交互的病毒血凝素(gydF4y2Ba15gydF4y2Ba)和矩阵(gydF4y2Ba16gydF4y2Ba)与上皮细胞钠离子通道蛋白。据我们所知,我们是第一个演示受损肺泡液体间隙和蛋白质渗透率由于可溶性介质释放的感染肺泡上皮细胞。gydF4y2Ba
肺泡液体间隙之前发现sepsis-induced急性损伤患者受损;一个类似的体外实验模型gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Baendotoxin-induced急性肺损伤显示肺泡液体间隙是通过促炎细胞因子和趋化因子(受损gydF4y2Ba10gydF4y2Ba),我们使用了的生理相关性模型。在我们的研究中,这一模式由肺泡上皮细胞感染了高致病性H5N1病毒诱导高水平的促炎细胞因子和趋化因子比季节性H1N1病毒。激活炎症通路之前显示导致下调的钠和氯转运蛋白负责矢量流体传输在肺泡上皮细胞(gydF4y2Ba17gydF4y2Ba),增加paracellular蛋白质渗透率。据我们所知,我们是第一个演示这一现象在实验感染病毒的肺泡上皮细胞模型。gydF4y2Ba
我们发现当MSC的表达生长因子Ang1和/或KGF siRNA撞倒了,MSC不能够减弱肺泡亚足联H5N1病毒感染的影响和应用。然而,Ang1和重组KGF只能部分恢复病理学的衰减。因此,分泌Ang1和KGF账户只是部分msc在肺泡上皮亚足联的疗效和应用。gydF4y2Ba
当老鼠感染了H5N1病毒,MSC治疗增加生存和减少体重只有在年老的老鼠。在18天皮。,these mice had fewer lung lesions and a greater number of bronchoalveolar antiinflammatory M2 macrophages, which also enhance tissue repair (18gydF4y2Ba)和促炎细胞因子和趋化因子水平较低。然而,他们的肺病毒滴度可比与未经处理的小鼠;因此,观察表型没有反映出msc的直接抗病毒作用。gydF4y2Ba
msc、单独或作为一个兼职抗病毒治疗,最近报道没有改善的生存7 - 10-wk-old C57BL / 6小鼠接种/ PuertoRico / 8/34 (mouse-adapted H1N1流感或/墨西哥/ 4108/2009 (H1N1大流行性流感)流感病毒(gydF4y2Ba13gydF4y2Ba,gydF4y2Ba19gydF4y2Ba)。我们的研究结果是相似的;msc未能改善生存(gydF4y2Ba无花果S5。gydF4y2Ba)或组织病理学在年轻(年龄的6 - 8周)小鼠接种H5N1型流感病毒。只在老年小鼠MSC治疗是有益的(8 - 12 mo的年龄)。年龄影响各种MSC功能,包括表达和分泌的可溶性因子重要的复苏从肺损伤(gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba)。年龄动物显示低表达的基因参与细胞活化和迁移和细胞因子受体(例如,TNFR1和TNFR2)和趋化因子受体CCR7、CX3CR1和CXCR5参与MSC移植和趋化性(gydF4y2Ba21gydF4y2Ba)。因此,年轻的动物有更强的内生MSC响应(gydF4y2Ba22gydF4y2Ba)而外生MSC治疗更有可能产生一个明显的好处在年老的动物。gydF4y2Ba
与年龄相关的肺修复能力降低,也可以解释的进步与年龄相关的临床严重程度的增加严重急性呼吸系统综合症(SARS) (gydF4y2Ba23gydF4y2Ba,gydF4y2Ba24gydF4y2Ba)和H1N1大流行性流感病毒感染(gydF4y2Ba25gydF4y2Ba)和更高的死亡率在老年患者与急性呼吸窘迫综合征(gydF4y2Ba26gydF4y2Ba)。年龄也决定了非典型肺炎的严重程度在老鼠和猕猴实验模型(gydF4y2Ba27gydF4y2Ba,gydF4y2Ba28gydF4y2Ba岁),老鼠更容易受到外源性内毒素(LPS) sepsis-induced肾脏损伤的动物模型gydF4y2Ba29日gydF4y2Ba)。尽管与年龄相关的变化可能占了其中的一些结果,可能会有其他因素。我们假设,在严重的流感,年龄和年轻小鼠肺部病理学和修复机制的不同。正如我们此前报道,H5N1病毒的致病机制在重要方面不同于季节性或大流行性H1N1流感病毒(gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba31日gydF4y2Ba)。同样,致病机制和MSC治疗的潜在好处很可能取决于病毒和宿主因素有关。gydF4y2Ba
我们没有调查结合MSC治疗,抗病毒治疗的效果,会做临床。我们的主要兴趣在这个阶段是MSC治疗对严重流感的发病机理的影响,最好单独使用MSC治疗所示。未来的研究应探讨MSC与抗病毒药物的协同作用和机制的互动时代与MSC治疗的影响。gydF4y2Ba
总之,感染高致病性H5N1流感病毒和H7N9肺泡液体间隙和特异表达蛋白质体外渗透,观察到人类;这些影响是由感染细胞释放的可溶性因子,抑制钠和氯转运蛋白。高致病性流感病毒的能力调节亚足联和程序可能提供有用的参数评估毒性。在活的有机体内gydF4y2Ba,gydF4y2BaMSC治疗减少肺损伤和增加生存年龄感染h5n1病毒的老鼠。这些临床数据表明,msc可以提供治疗有利于人类流感病毒引起的严重肺部疾病患者,如H5N1和H7N9,尤其是老年患者,他们有更高的风险。肺泡上皮细胞钠离子和氯离子转运蛋白的识别关键致病目标和发布的这些致病机制的调节因素msc建议额外治疗病毒性急性肺损伤的临床管理的可能性。gydF4y2Ba
材料和方法gydF4y2Ba
提供了实验的详细描述gydF4y2Ba如果材料和方法gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
甲型流感病毒。gydF4y2Ba
H5N1流感病毒使用/香港/ 483/97(483/97),/香港/ 486/97(486/97),和一个/越南/ 3046/04 (3046/04);都是高致病性病毒。H7N9甲型流感病毒是/上海/ 2/2013 (Sh2)。季节性流感病毒H1N1(/香港/ 54/98(54/98)和俄克拉何马州/ 447/08 (OK447/08)]和H3N2[/香港/ 1174/99(1174/99)和俄克拉何马州/ 370/05 (OK370/05)]。病毒都是人类的分离。他们生长在Madin-Darby狗肾细胞(MDCK)然后整除,储存在−80°C。病毒滴定MDCK细胞(组织培养(TCID感染剂量的50%gydF4y2Ba50gydF4y2Ba)]。gydF4y2Ba
急性肺损伤Coculture模型。gydF4y2Ba
先前描述的体外模型(gydF4y2Ba图1gydF4y2Ba)(gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)是适应中使用的生物安全三级实验室(BSL-3)和用来测量净亚足联和应用在流感病毒感染。肺泡上皮细胞分离切除,良性的肺组织在玛丽女王医院,香港。该研究机构审查委员会批准香港大学(IRB参考编号威斯康辛大学09 - 394)和医院管理局,香港西部集群。这些细胞被镀上24-well transwell insets建立气液界面。净亚足联测量通过添加FITC-labeled右旋糖酐(σ)细胞病毒感染后24 h[感染复数(MOI) = 0.1)或与病毒脱毒后孵化条件培养液1 h。Cytomix(混合促炎细胞因子在缓冲区;研发系统)作为积极的控制。gydF4y2Ba
来源于人类的骨头从德州农工大学健康科学中心获得msc被添加到基底外侧商会transwell评估它们对亚足联的影响和应用;人肺成纤维细胞被用作控制。评估的角色MSC-secreted可溶性生长介质Ang1 KGF, msc与300 nM reverse-transfected Ang1 (121280;Ambion)和/或100海里KGF (10818;Ambion)沉默RNA (siRNA)双工或炒核(负控制)。重组人类蛋白质,100 ng / mL rhAng-1和100 ng / mL rhKGF(研发系统),是用来比较的作用定义可溶性蛋白质H5N1 virus-impaired亚足联和应用。gydF4y2Ba
老鼠的研究。gydF4y2Ba
雌性Balb / C小鼠年龄在6 - 8周(年轻)或8 - 12月(“岁”)接种经10gydF4y2Ba6gydF4y2BaTCIDgydF4y2Ba50gydF4y2Ba在25个μL 486/97的流感病毒。在第五天皮。,mice were injected i.v. with 5 × 105gydF4y2Ba人类在100年μL骨骨髓来源msc。NIH 3 t3小鼠胚胎成纤维细胞(5×10gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)100年μL(写明ATCC)作为控制。msc不表达主要组织相容性抗原和不引起排斥反应,与人类msc在先前的研究已经使用endotoxin-induced急性肺损伤模型(gydF4y2Ba10gydF4y2Ba)。生存和体重监控18 d。在第七天皮。,virus was titrated in three mouse lungs per group (MSC-treated, fibroblast-treated groups). BAL fluid was collected on day 7 p.i. for cytokine assay and immune cell profiling (如果材料和方法gydF4y2Ba)。在第十天皮。,three mice per group were killed for measurement of pulmonary microvascular permeability and CFTR protein expression. On days 10 and 18 p.i., four mouse lungs per group were fixed for histopathology. The animal infection experiments were approved by the University of Hong Kong Animal Ethics Committee (CULATR 3445-14).
细胞因子的测量,钠和氯离子转运蛋白,MSC-Secreted可溶性蛋白质。gydF4y2Ba
从感染病毒的细胞总RNA和总蛋白提取肺肺泡上皮细胞或鼠标。细胞因子,主要转运蛋白,Ang1 KGF由msc分泌可溶性蛋白质测定中描述gydF4y2Ba如果材料和方法gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
统计分析。gydF4y2Ba
平均值由未配对的双尾三个独立的实验进行了比较gydF4y2BatgydF4y2Ba测试。单向方差分析与事后Bonferroni测试使用。差异被认为是重要的gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05。GraphPad Prism 6.0版本使用的所有统计分析软件。gydF4y2Ba
如果材料和方法gydF4y2Ba
由TCID病毒滴定gydF4y2Ba50gydF4y2Ba化验。gydF4y2Ba
96孔细胞培养板的支流MDCK细胞制备病毒滴定(TCID前1 dgydF4y2Ba50gydF4y2Ba)。与PBS细胞被洗一次,无血清培养系统中补充了最低基本培养基(MEM)补充与100 U /毫升青霉素、链霉素100μg /毫升、和2μg /毫升tosylsulfonyl phenylalanylchloromethyl酮(TPCK)治疗胰蛋白酶。连续稀释的病毒上清液,从0.5日志7日志,被添加到单元格盘子一式四份。板块每天观察细胞病变效应。稀释的病毒导致细胞病变效应在50%的接种井使用Karber估计方法。gydF4y2Ba
人类的间充质基质细胞。gydF4y2Ba
人类msc来源于骨髓从德州农工大学健康科学中心获得医学院的再生医学研究所斯科特和白色。在这项研究中使用的所有msc满足的标准定义msc发表的国际社会的细胞疗法。msc在体外和体内模型分析了流式细胞仪实验,发现之前> 99%为干细胞表面抗原阳性CD73, CD90,和CD105,从而满足定义的标准。msc在α-MEM培养没有核糖核苷或脱氧核苷(GibcoBRL)包含2毫米gydF4y2BalgydF4y2Ba谷氨酰胺,16.5%(卷/期)HyClone的边后卫(SV30160.03;热费希尔)和1%的青霉素和链霉素。gydF4y2Ba
人类肺泡上皮细胞的分离。gydF4y2Ba
人肺泡上皮细胞分离(如前所述)(gydF4y2Ba6gydF4y2Ba从切除),良性的人类肺组织获得的心胸外科手术,玛丽女王医院,香港,作为研究的一部分,机构审查委员会批准香港大学(IRB参考编号威斯康辛大学09 - 394)和医院管理局,香港西部集群。gydF4y2Ba
简而言之,可见支气管被移除,肺组织碎(使用组织直升机)< 0.5毫米大小的成碎片。剁碎组织与汉克的洗了三次平衡盐溶液(hbs) (Gibco)和0.7毫米碳酸氢钠(Gibco) pH值7.4去除大部分的巨噬细胞和血液细胞。组织消化使用的组合0.5%胰蛋白酶(Gibco)和4 U /毫升弹性蛋白酶(卫氏生化公司)40分钟37°C水浴颤抖。消化了通过添加DMEM / F12培养基(Gibco)与40%的边后卫和350 U /毫升DNase我(σ)。细胞团被多次移液分散10分钟。一次性细胞的细胞悬液过滤器(纱布大小50μm) (BD生物科学)被用来去除大未消化的组织碎片。单细胞悬液离心机,小球是resuspended 1:1混合的DMEM / F12中小气道基础培养基(SABM) (Lonza)补充0.5 ng / mL表皮生长因子(高能),500 ng / mL肾上腺素,10μg / mL转铁蛋白,胰岛素5μg /毫升、0.1 ng / mL视黄酸,6.5 ng / mL三碘甲状腺氨酸,0.5μg /毫升氢化可的松,30μg /毫升牛脑垂体提取物,和0.5毫克/毫升BSA, 5%的边后卫和350 U /毫升DNase即细胞悬液镀在组织培养瓶和孵化37°C水套孵化器有限公司5%gydF4y2Ba2gydF4y2Ba90分钟的不依从细胞分层不连续冷Percoll密度梯度(密度1.089和1.040 g / mL),在25×离心机gydF4y2BaggydF4y2Ba20分钟。细胞层界面的两个梯度与BSS曾四次收集和清洗,去除Percoll流体。细胞悬液是孵化与磁珠涂布anti-CD14抗体(mac CD14微磁)在室温20分钟。使用磁铁的珠子后,细胞生存能力评估台盼蓝染料排斥。肺泡上皮细胞悬液在SAGM resuspended (Lonza Walkersville, Inc .)补充1%的边后卫,100 U /毫升青霉素和链霉素100μg /毫升和镀3×10的细胞密度gydF4y2Ba5gydF4y2Ba每厘米gydF4y2Ba2gydF4y2Ba。这些细胞被保持在湿润的气氛中(5%股份有限公司gydF4y2Ba2gydF4y2Ba、37°C)和生长介质改变了日报,镀后60 h细胞开始。细胞层接近75%融合时,肺泡上皮细胞与胰蛋白酶分离,分离成汉克斯缓冲盐溶液,然后播种transwell文化插入如下所述。gydF4y2Ba
体外急性肺损伤的模型。gydF4y2Ba
研究msc对肺泡液体间隙和蛋白质的影响渗透率受流感H5N1病毒感染人类肺泡上皮细胞,我们适应一个体外急性肺损伤模型,通过使用先前描述coculture系统(gydF4y2Ba7gydF4y2Ba);中使用的协议修改BSL-3实验室。肺泡上皮细胞被镀的顶端室24-well合演Transwell插入0.4 -μm孔隙大小(康宁),在每口井的100000个细胞的密度。微孔transwell膜建立了气液界面类似于人类的肺上皮细胞,大气和镀细胞保持湿润(5%股份有限公司gydF4y2Ba2gydF4y2Ba,37°C)。coculture的肺泡上皮细胞实验,msc或正常成人肺成纤维细胞(控制)(Lonza Inc .)在基底外侧镀室transwell (gydF4y2Ba图1gydF4y2Ba)每口井的100000个细胞的密度(或不同的MSC细胞密度:1000年,10000年,50000年和500000年MSC)并没有直接接触顶端室。H5N1型病毒感染的条件培养基是浮在表面的无毒化肺泡上皮细胞,收集在24 h postinfection (p)和100 - kda孔隙过滤器过滤(微孔)去除病毒颗粒。在过滤后的上层清液,流感病毒矩阵(M)基因表达被定量rt - pcr,监控和病毒被TCID滴定gydF4y2Ba50gydF4y2Ba试验,以确保没有传染性的病毒。浮在表面的无毒化是用于治疗甲型流感病毒感染肺泡上皮细胞观察影响肺泡液体运输和蛋白质在肺泡上皮细胞层渗透率。混合的细胞因子IL-1βCytomix, TNF-α,和IFN-γ(研发系统),是用于50 ng / mL积极控制肺损伤。gydF4y2Ba
肺泡液体测量间隙和肺泡蛋白质渗透率。gydF4y2Ba
我们测量净肺泡液体运输的顶端室transwell文化插入(包含一个单层的肺泡上皮细胞感染流感病毒)的基底外侧室transwell在24 h p。Transepithelial电阻保持在1500Ω/厘米gydF4y2Ba2gydF4y2Ba,紧密连接的形态学证据。肺泡上皮细胞都与各自的A型流感病毒接种的莫伊0.1或孵化条件培养基无毒化的1 h。然后,200μL FITC-labeled右旋糖酐(σ),大小为70 kDa被加入到细胞(最终浓度,500 ng /μL)。5分钟后,最初的样品20μL从顶端室收集。右旋糖酐孵化24小时后,另一个20μL收集来自同一隔间里,和100年μL收集从基底外侧室作为最终样品。每个样品的荧光被模量测量荧光计(Fluostar Optima的BMG Labtech)。gydF4y2Ba
体外肺损伤模型和净亚足联的测量和应用是前面描述的(gydF4y2Ba7gydF4y2Ba);中使用的协议修改BSL-3实验室。净肺泡液体运输μL⋅厘米gydF4y2Ba−2gydF4y2Ba⋅hgydF4y2Ba−1gydF4y2Ba测定[1 -(荧光阅读最初的样本/重量的初始样本)/(荧光阅读在最后的样本/最终样本的重量)]×100。剩余的液体基底外侧室收集右旋糖酐孵化24小时后测量蛋白质渗透率,基于单向fluorescence-labeled通量右旋糖酐从顶端到基底外侧室transwell文化的插入。transepithelial阻力之间的顶端和基底室transwell维持在1500Ω/厘米gydF4y2Ba2gydF4y2Ba,紧密连接的形态学证据。gydF4y2Ba
流感病毒感染肺泡上皮细胞的细胞因子的反应。gydF4y2Ba
肺泡上皮细胞注射流感病毒的莫伊2。24小时后,总RNA提取利用RNeasy迷你包(试剂盒)和孵化RNase-free DNase(试剂盒)根据制造商的指示。使用PrimeScript RT互补脱氧核糖核酸是由反转录试剂盒(豆类)根据制造商的指示。的mRNA表达细胞因子(IFN-β,IL-1β)和趋化因子(咆哮,IP-10 MCP-1, il - 6, IL8)和钠和氯转运蛋白(雌性生殖道;α-、β-、γ-ENaC;α3α2α1——————,β1,β2,感染细胞和β3-NaKATPase)是评估使用SYBR预混料交货Taq II工具包(豆类)根据制造商的指示。促炎细胞因子和趋化因子的引物是前面描述的(gydF4y2Ba6gydF4y2Ba),感兴趣的其他基因的引物获得σ。互补的产品被使用放大gene-specific引物和量化使用96 -格式ABI ViiA 7实时PCR系统(应用生物系统公司Inc .)。放大数据(循环阈值)被转换为相对基因拷贝数基于标准曲线的线性回归。每个基因的表达是计算归一化后beta-actin表达式。gydF4y2Ba
蛋白表达的主要离子转运蛋白、细胞因子和生长因子在感染肺泡上皮细胞,MSC上层清液,老鼠的肺。gydF4y2Ba
从流感病毒感染细胞总蛋白提取肺泡上皮细胞和小鼠肺组织准备利用radioimmunoprecipitation化验(里帕)裂解缓冲(σ)(0.15毫升/肺细胞和0.4毫升/鼠标)与EDTA-free蛋白酶抑制剂(罗氏)。每个样本变性,20μg加载在4 - 12%梯度self-cast Tris-Gly与Tris-Gly SDS聚丙烯酰胺凝胶缓冲区和电泳在120 V 80分钟。随后被转移到Hybond-P PVDF膜的蛋白质(通用电气医疗集团)和孵化与Tris-buffered牛奶5%盐水渐变20 (TBS-T) 1 h。特定的膜在一夜之间被孵化主要CFTR抗体检测(细胞信号),α1-NaKATPase(罗福斯生物制品)和beta-actin(微孔)。二次共轭主抗体抗体第二天使用。蛋白质的乐队是由化学发光可视化(ECL +试剂;Amersham生物科学)和量化用NIH ImageJ软件。gydF4y2Ba
支气管肺泡灌洗(BAL)(洗涤过程,恢复流体样本的感染)是由天7 p。BAL流体定量分析细胞因子(IP10、MCP-1 MCP-3, M1P-1α,M1P-1β,M1P-3α,咆哮,IL-1β,il - 4、il - 10, IL-17 KC, TNF-α,gm - csf,和IFN-γ)通过使用流cytometry-based免疫测定(Flowcytomix多路复用;本德MedSystems)和协议根据制造商的说明书。可溶性蛋白由MSC分泌,包括他们(Ang-1)和角质细胞生长因子(KGF),测定MSC的上层清液层通过ELISA(研发系统)根据制造商的指示。gydF4y2Ba
核转染msc。gydF4y2Ba
msc与siRNAs转染如前所述李et al。(gydF4y2Ba10gydF4y2Ba),除了Lipofectamine第(英杰公司)作为转染试剂。-小干扰rna转染作为控制炒。gydF4y2Ba
实验感染的老鼠。gydF4y2Ba
雌性Balb / C小鼠6 - 8岁的莫(“年轻”)或8 - 12月(“岁”)从实验动物获得香港大学的单位。他们分成两组,麻醉的氯胺酮和甲苯噻嗪0.11毫克1.88毫克,与接种鼻内25μL 1.5日志LDgydF4y2Ba50gydF4y2Ba(10gydF4y2Ba6gydF4y2Ba日志TCIDgydF4y2Ba50gydF4y2Ba)的流感H5N1病毒/香港/ 486/97 (486/97)。急性呼吸窘迫综合征(ARDS)是疾病和死亡的主要原因在Balb / C小鼠实验感染H5N1流感病毒株。其他H5N1病毒株通常用于小鼠的实验研究与病毒传播到大脑,和脑炎是死亡的主要原因,尽管这个病理不是观察到在大多数H5N1疾病(gydF4y2Ba31日gydF4y2Ba)。老鼠生存和接种后体重监控。动物感染实验由香港大学动物伦理委员会批准,进行生物安全三级(BSL-3)遏制香港大学的实验室。gydF4y2Ba
伊文思蓝染料在感染小鼠肺外渗。gydF4y2Ba
在第十天皮。,pulmonary microvascular permeability was measured in all mouse groups by using Evans blue assay. Dye (20 mg/kg) dissolved in PBS was i.v. injected 3 h before mice were euthanized. The pulmonary vasculature was perfused with 1 mL of PBS, and the lungs were dissected from the thoracic cavity and surrounding mediastinal structures. The lung tissue was then homogenized in 1 mL of PBS, added to two volumes of deionized formamide, and incubated at 60 °C for 12 h. The supernatant was then separated from the lung tissue by centrifugation at 2,000 ×ggydF4y2Ba30分钟。伊文思蓝染料在肺组织是由双波长光度法定量分析,使用下面的公式:校正吸光度在620海里=实际吸光度在620 nm−[1.426 + 0.03(吸光度在740海里)]。在肺匀浆的浓度,伊文思蓝染料对标准曲线计算。病理学家蒙蔽组织病理学实验细节得分气道,血管,和实质炎症在组织规模的13部分准备从formalin-fixed石蜡包埋的肺和苏木精和伊红染色。gydF4y2Ba
免疫细胞在矿山测量液体。gydF4y2Ba
BAL液的蛋白质浓度测定用皮尔斯BCA蛋白质化验设备(热科学)。离心分离后,细胞的液体在流式细胞仪的特征。Fc受体阻断后(anti-CD16 / CD32, BD生物科学),细胞染色对冰与三种面板30分钟先天和适应性免疫细胞的单克隆抗体(所有从Biolegend,除非另有指示):面板1,F4/80-PE, I-AE-PerCPCy5·5 CD11b-APCy7, Gr1-PECy7, IA8-APC, CD11c-FITC;面板2 CD3-APC CD4-APCCy7 CD8-PerCPCy5·5, Dx5-FITC,γδT-PE, B220-PECy7;小组3 F4/80-PECy7 CD11b-APCCy7 I-AE-PerCPCy5·5, MMR-APC, IL-4Rα-PE, iNOS-FITC (BD生物科学)。细胞内染色,细胞被固定在固定/透化作用缓冲区(eBioscience) 30分钟在冰和沾iNOS-FITC烫洗缓冲区(BD生物科学)。细胞然后用100μL 4%多聚甲醛固定在冰上20分钟,洗了,沾在PBS DAPI 10分钟在冰上。样品通过流式细胞术分析了流式细胞仪和FlowJo LSRII和分析软件。gydF4y2Ba
统计分析。gydF4y2Ba
所有独立进行体外实验,使用至少三个不同的老鼠;每个实验重复进行。结果显示在数字计算均值和扫描电镜从三个独立的实验。组通过一个未配对相比,双尾gydF4y2BatgydF4y2Ba测试。单向方差分析,事后Bonferroni测试,使用适当的,不需要修正。差异被认为是重要的gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05。gydF4y2Ba
老鼠生存和身体减肥比较在三个独立的体内实验中通过使用生存率较线性回归模型。汇集数据从三个独立的体内实验分析了如果没有迹象的异质性;否则,模型中的差异占实验通过添加一个指标变量。老鼠的生存在MSC治疗和纤维母细胞对照组相比,使用日志等级测试而身体减肥是通过使用线性回归模型进行比较。病毒滴度,伊文思蓝染料外渗,组织病理学评分比较使用的学生gydF4y2BatgydF4y2Ba测试的阈值gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05的统计学意义。GraphPad Prism 6.0版本使用的所有统计分析和R 3.0.2版本(R统计计算)的基础项目。gydF4y2Ba
道德的声明。gydF4y2Ba
香港大学的机构审查委员会和香港医院管理局西方集群(IRB引用华盛顿大学09 - 394)批准使用人体组织的隔离人肺泡上皮细胞在这项研究。所有成年受试者提供书面同意使用他们在科学研究的组织样本。gydF4y2Ba
动物研究委员会批准使用的动物生活在教学和研究(CULATR 3445 - 14),路医学院,香港大学,进行生物安全三级实验室。委员会审查和批准了动物保健计划,本研究遵循的协议gydF4y2Ba指导实验室动物保健和使用的gydF4y2Ba国家研究委员会的国家科学院(gydF4y2Ba32gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
确认gydF4y2Ba
艾伦·d·l·Sihoe博士和员工(心胸外科手术,外科学系,李嘉诚医学院,香港大学玛丽医院)提供人类的肺组织。卡罗尔女士提供的技术支持是c . c . Ho曼迪·m·t·Ng,乔安妮·h·m·方新航罪粉丝,糖果,李先生挂唱歌,克里斯·k·p·莫博士(流感研究的中心,公共卫生学院的李嘉诚医学院,香港大学),和凯文Fung先生(香港大学病理学系)。提供了研究经费由美国国家过敏症和传染病研究所(NIAID)下HHSN272201400006C CEIRS合同。研究资助委员会的香港特别行政区,基于主题的研究提供了资助计划(T11-705/14N)和一般研究基金会(HKU761210M)。gydF4y2Ba
脚注gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba1gydF4y2Ba人信件可能得到解决。电子邮件:gydF4y2Ba马利克在{}hku.hkgydF4y2Ba,gydF4y2Bamchan在{}hku.hkgydF4y2Ba,或gydF4y2Barobert.webster在}{stjude.orggydF4y2Ba。gydF4y2Ba
作者的贡献:M.C.W.C.,J.W.L.,M.A.M.,J。S.M.P. designed research; D.I.T.K., C.Y.H.L., K.P.Y.H., S.A.V., X.F., and R.W.Y.C. performed research; X.F. contributed new reagents/analytic tools; M.C.W.C., D.I.T.K., C.Y.H.L., K.P.Y.H., S.A.V., E.H.Y.L., J.M.N., J.W.L., R.W.Y.C., M.A.M., and J.S.M.P. analyzed data; and M.C.W.C., D.I.T.K., C.Y.H.L., K.P.Y.H., S.A.V., Y.G., R.W.Y.C., R.G.W., and J.S.M.P. wrote the paper.
评论家:P.J.O.,我mperial College London; L.O., University of Pittsburgh; and D.P., University of Georgia.
作者宣称没有利益冲突。gydF4y2Ba
这篇文章包含支持信息在网上gydF4y2Bawww.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.1073 pnas.1601911113 /——/ DCSupplementalgydF4y2Ba。gydF4y2Ba
免费在线通过PNAS开放存取选项。188滚球软件gydF4y2Ba
引用gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- 陈gydF4y2BaMCgydF4y2Ba,gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- PerronegydF4y2Ba拉gydF4y2Ba,gydF4y2Ba
- PlowdengydF4y2BaJKgydF4y2Ba,gydF4y2Ba
- Garcia-SastregydF4y2Ba一个gydF4y2Ba,gydF4y2Ba
- 卡茨gydF4y2BaJMgydF4y2Ba,gydF4y2Ba
- 汤佩使gydF4y2BaTMgydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- KandungydF4y2Ba在gydF4y2Ba,gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- 霍华德gydF4y2Ba佤邦gydF4y2Ba,gydF4y2Ba
- 裴伟士gydF4y2Ba米gydF4y2Ba,gydF4y2Ba
- 海登gydF4y2Ba成品gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- 范·里尔gydF4y2BaDgydF4y2Ba,gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- 陈gydF4y2BaMCgydF4y2Ba,gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- 李gydF4y2BaJWgydF4y2Ba,gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ParekkadangydF4y2BaBgydF4y2Ba,gydF4y2Ba
- MilwidgydF4y2BaJMgydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- 沃尔特gydF4y2BaJgydF4y2Ba,gydF4y2Ba
- 制品gydF4y2Ba磅gydF4y2Ba,gydF4y2Ba
- MatthaygydF4y2Ba马gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- 李gydF4y2BaJWgydF4y2Ba,gydF4y2Ba
- 方gydF4y2BaXgydF4y2Ba,gydF4y2Ba
- 古普塔gydF4y2BaNgydF4y2Ba,gydF4y2Ba
- SerikovgydF4y2BaVgydF4y2Ba,gydF4y2Ba
- MatthaygydF4y2Ba马gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- MonselgydF4y2Ba一个gydF4y2Ba,gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- 威尔逊gydF4y2Ba詹gydF4y2Ba,gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- 先验哲学gydF4y2Ba我gydF4y2Ba,gydF4y2Ba
- 阿伯特gydF4y2BaJgydF4y2Ba,gydF4y2Ba
- MatthaygydF4y2Ba马gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- KedzierskigydF4y2BalgydF4y2Ba,gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- KunzelmanngydF4y2BaKgydF4y2Ba,gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- LazrakgydF4y2Ba一个gydF4y2Ba,gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- 伊利亚gydF4y2BaNgydF4y2Ba,gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- 米尔斯gydF4y2BaCDgydF4y2Ba,gydF4y2Ba
- 莱伊gydF4y2BaKgydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- 达尔维什gydF4y2Ba我gydF4y2Ba,gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- 布斯托斯gydF4y2Ba毫升gydF4y2Ba,gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- NemethgydF4y2BaKgydF4y2Ba,gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- Lopez-OtingydF4y2BaCgydF4y2Ba,gydF4y2Ba
- BlascogydF4y2Ba马gydF4y2Ba,gydF4y2Ba
- 帕特里奇gydF4y2BalgydF4y2Ba,gydF4y2Ba
- 萨拉诺gydF4y2Ba米gydF4y2Ba,gydF4y2Ba
- 获得gydF4y2BaGgydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- 徐gydF4y2BaPTgydF4y2Ba,gydF4y2Ba
- 郭gydF4y2Ba毫升gydF4y2Ba,gydF4y2Ba
- 袁gydF4y2BaHgydF4y2Ba,gydF4y2Ba
- 赖gydF4y2Ba圣gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- 梁gydF4y2Ba连续波gydF4y2Ba,gydF4y2Ba
- 赵gydF4y2Ba周gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- 吴gydF4y2BaJTgydF4y2Ba,gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- MatthaygydF4y2Ba马gydF4y2Ba,gydF4y2Ba
- 制品gydF4y2Ba磅gydF4y2Ba,gydF4y2Ba
- 齐默尔曼gydF4y2Ba遗传算法gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- 罗伯茨gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba,gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- 史密特gydF4y2BaSLgydF4y2Ba,gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- DoigydF4y2BaKgydF4y2Ba,gydF4y2Ba
- LeelahavanichkulgydF4y2Ba一个gydF4y2Ba,gydF4y2Ba
- 袁gydF4y2BaPSgydF4y2Ba,gydF4y2Ba
- 明星gydF4y2Ba类风湿性关节炎gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- 裴伟士gydF4y2BaJSgydF4y2Ba,gydF4y2Ba
- 张gydF4y2BaCYgydF4y2Ba,gydF4y2Ba
- 梁gydF4y2BaCYgydF4y2Ba,gydF4y2Ba
- 尼科尔斯gydF4y2BaJMgydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- 梁gydF4y2Ba本产品gydF4y2Ba,gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- 国家研究委员会gydF4y2Ba