数据gydF4y2Ba
摘要gydF4y2Ba
基本原理gydF4y2Ba
严重流感仍然是一个主要的公共卫生威胁，每年造成数千人死亡。日益增加的抗病毒耐药性和目前治疗方法的有限效力突出了需要新的流感治疗方法。大量的临床前数据表明，间充质间质(stem)细胞(MSC)治疗可诱导抗炎作用，增强受损肺的修复。我们假设MSC治疗可以改善严重流感小鼠模型的生存，减轻肺炎症和减少急性肺损伤(ALI)gydF4y2Ba．gydF4y2Ba
方法gydF4y2Ba
C57Bl/6小鼠感染甲型流感/PuertoRico/8/34(小鼠适应H1N1)或甲型流感/墨西哥/4108/2009(猪源H1N1大流行)，并在感染前或感染后通过尾静脉给药人或小鼠MSCs。MSC的疗效被评估为与抗病毒药物奥司他韦联合使用的独立和辅助治疗策略。监测体重减轻和生存情况。检测支气管肺泡灌洗液和肺实质中的炎症细胞、细胞因子/趋化因子(IFN-γ、CXCL10、CCL2和CCL5)和ALI标志物(总蛋白和IgM)。gydF4y2Ba
引用：gydF4y2BaDarwish I, Banner D, Mubareka S, Kim H, Besla R, Kelvin DJ，等。PLoS ONE 8(8): e71761。https://doi.org/10.1371/journal.pone.0071761gydF4y2Ba
编辑器:gydF4y2BaAna Mora，美国匹兹堡大学gydF4y2Ba
收到:gydF4y2Ba2012年12月5日;gydF4y2Ba接受:gydF4y2Ba2013年7月3日;gydF4y2Ba发表:gydF4y2Ba2013年8月15日,gydF4y2Ba
版权:gydF4y2Ba©2013 Darwish等。这是一篇开放获取的文章，在知识共享署名许可协议的条款下发布，该协议允许在任何媒体上无限制地使用、发布和复制，前提是注明原作者和来源。gydF4y2Ba
基金：gydF4y2Ba这项工作得到了加拿大卫生研究所(CIHR)硕士奖[ID]、CIHR流行病防范催化剂拨款[SM]、国防高级研究计划局拨款(DARPA-BAA-09-43) [WCL, KCK]、CIHR mopo -13721和115160 [KCK]、加拿大分子寄生虫学研究主席[KCK]和传染病和炎症研究主席[WCL]。资助方在研究设计、数据收集和分析、决定发表或手稿准备方面没有作用。gydF4y2Ba
利益冲突:gydF4y2Ba作者宣称不存在相互竞争的利益。gydF4y2Ba
介绍gydF4y2Ba
虽然绝大多数甲型流感病毒感染在没有并发症的情况下痊愈，但全世界每年约有300-500万感染者患上严重和可能致命的疾病gydF4y2Ba[1]gydF4y2Ba．严重流感可激活有害的先天免疫反应，引起急性肺损伤(ALI)/急性呼吸窘迫综合征(ARDS)，直接导致流感相关的发病率和死亡率gydF4y2Ba［2］gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba［14］gydF4y2Ba．ALI/ARDS的特点是微血管内皮通透性增加，肺泡-毛细血管膜屏障破坏，导致肺水肿，伴中性粒细胞、巨噬细胞和红细胞浸润gydF4y2Ba［15］gydF4y2Ba，gydF4y2Ba［16］gydF4y2Ba．gydF4y2Ba
FDA批准的预防和治疗流感的两类药物——金刚烷类和神经氨酸酶抑制剂——在临床实践中有一些局限性。甲型流感病毒之间的频繁突变和基因重组导致抗病毒治疗效果下降。例如，金刚烷耐药的发展使这类药物无效gydF4y2Ba［17］gydF4y2Ba．还观察到对神经氨酸酶抑制剂奥司他韦产生耐药性的季节性甲型(H1N1)流感病毒突变显著增加gydF4y2Ba［18］gydF4y2Ba．抗病毒治疗的疗效也取决于给药时间gydF4y2Ba［19］gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba［23］gydF4y2Ba．在流感症状出现后的48-72小时内开始奥司他韦治疗可降低死亡率gydF4y2Ba［20］gydF4y2Ba，gydF4y2Ba[21]gydF4y2Ba．另一方面，在流感症状出现后的最初48-72小时之后开始进行奥司他韦治疗，其临床影响有限gydF4y2Ba［20］gydF4y2Ba，gydF4y2Ba[21]gydF4y2Ba．此外，据报道，神经氨酸酶抑制剂在H5N1禽流感病毒感染中相对无效gydF4y2Ba［24］gydF4y2Ba．发展新的辅助治疗策略以补充抗病毒治疗可能改善重症流感的临床结果。gydF4y2Ba
间充质间质(干细胞)细胞(MSCs)是治疗ALI的一种潜在的免疫调节策略gydF4y2Ba［25］gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba［32］gydF4y2Ba．MSCs是一种非造血多能基质细胞的异质亚群，具有多系分化潜能，可从胚胎组织、脂肪组织、肝脏、肌肉和牙髓中分离;然而，成人骨髓仍然是临床前和临床研究中最常见的MSCs来源gydF4y2Ba[33]gydF4y2Ba，gydF4y2Ba[34]gydF4y2Ba．最初对间充质干细胞的临床兴趣集中在它们分化为受损细胞类型的能力，作为一种改善临床前疾病模型结果的手段。最近的研究表明，在内毒素、博莱霉素或其他小鼠模型中，MSCs在不植入的情况下可以减少损伤gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba诱导的ALI和败血症gydF4y2Ba［25］gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba［28］gydF4y2Ba，gydF4y2Ba［35］gydF4y2Ba．MSCs在ALI中发挥保护作用的潜在机制包括免疫抑制、增强损伤肺的修复和增强细菌清除gydF4y2Ba［25］gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba［28］gydF4y2Ba，gydF4y2Ba［35］gydF4y2Ba这些效应已被证明是通过MSC细胞与宿主细胞直接接触、MSC分泌各种炎症旁分泌介质（例如TNF刺激的基因6蛋白（TSG-6）和前列腺素E2（PGE））介导的gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)和MSC中抗菌因子的上调gydF4y2Ba［25］gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba［32］gydF4y2Ba最近的转录组学分析表明，MSC给药调节了肺中保护组织免受损伤的广泛生物网络gydF4y2Ba［36］gydF4y2Ba．gydF4y2Ba
这些临床前数据表明，骨髓间充质干细胞有可能用于改善严重流感的临床预后。在本研究中，我们研究了在实验性严重流感模型中单独或作为辅助治疗策略施用骨髓间充质干细胞是否可以通过降低流感病毒感染率来改善临床预后炎症和阿里。gydF4y2Ba
材料和方法gydF4y2Ba
小鼠流感模型gydF4y2Ba
雄性C57Bl/6小鼠，7-10周龄，从Jackson实验室获得，在无菌条件下光照12小时。动物使用协议由大学健康网络安大略省癌症研究所动物护理委员会审查和批准，所有实验都在动物生物安全二级设施中按照机构指南进行。第0天，在轻度异氟烷麻醉下，用425个50%鸡蛋感染剂量(EID)鼻灌感染实验小鼠gydF4y2Ba50gydF4y2Ba)（60-80%致死剂量）或150 EIDgydF4y2Ba50gydF4y2BaA/PuertoRico/8流感病毒(A/PR/8;mouse-adapted H1N1流感(写明ATCC;批次号3628278)或1000 EIDgydF4y2Ba50gydF4y2Ba甲型流感/墨西哥/ 4108/2009(/墨西哥人/ 4108;2009年猪源性H1N1流感大流行)(疾病控制中心;# 200912192)。每天记录体重，最多11天，在第7天或满足安乐死标准(≤0天体重的80%)时处死小鼠。gydF4y2Ba
流感病毒滴定gydF4y2Ba
在感染后第6天，对C57Bl/6小鼠实施安乐死，并采集肺。称重肺部，并在1ml PBS中均质30秒。肺匀浆在10000转gydF4y2BaggydF4y2Ba10分钟，将上清液储存在−80°C。在Madin-Darby犬肾（MDCK）细胞（ATCC）中通过斑块试验定量流感A/PR/8病毒产量。1×10gydF4y2Ba6gydF4y2BaMDCK细胞/孔被镀在6孔板上。12-24小时后，去除培养液，将10倍稀释的肺匀浆加入500µL无血清Eagle最低必需培养基(MEM)(一式两份)到MDCK细胞中，在37°C、5% CO下孵育1小时gydF4y2Ba2gydF4y2Ba．然后用2ml 1×Eagle的MEM覆盖细胞，其中含有0.6%琼脂糖、抗生素、碳酸氢钠和8µl胰蛋白酶。细胞孵育42-72小时后，用Carnoy 's固定剂(3∶1，甲醇:冰醋酸)固定30分钟。去除琼脂糖覆盖层，在20%乙醇中用0.1%结晶紫染色可见斑块。病毒载量以每克肺组织斑块形成单位(PFU/g)表示。gydF4y2Ba
间充质基质(干细胞)细胞gydF4y2Ba
冷冻小瓶同种骨髓源性小鼠间充质干细胞(mMSCs)和同种异体人间充质干细胞(hMSCs)均来自于Scott & White (Temple, TX, USA)德克萨斯A&M健康科学中心医学院再生医学研究所Darwin Prockop博士。由国家卫生研究院/国家研究资源中心(NIH/NCRR)资助(# P40RR017447)。中心报告的所有MSC均符合国际细胞治疗学会(ISCT)提出的MSC定义标准。gydF4y2Ba［37］gydF4y2Ba并且以前已经有效地减少了鼠模型中的LPS-和脓毒症诱导的AligydF4y2Ba［26］gydF4y2Ba，gydF4y2Ba［35］gydF4y2Ba，gydF4y2Ba[38]gydF4y2Ba. 按照制造商的说明，使用间充质干细胞功能鉴定试剂盒（研发系统）评估骨髓间充质干细胞的分化。为了检测MSC表面抗原表达，用抗人抗体CD73、CD90、CD105、CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR（以及同型/代偿对照）标记hMSCs（P3）（人类MSC分析试剂盒；BD Biosciences）。流式细胞仪分析所有细胞。mMSCs（P9）和hMSCs（P3）在标准条件下仍能分化为三种细胞系，包括脂肪细胞、骨细胞和软骨细胞gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba区分条件(gydF4y2Ba图S1A，BgydF4y2Ba)．hMSCs (P3)干细胞表面抗原CD73、CD90和CD105的>阳性99%，造血细胞标志物CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR阳性<2%，符合ISCT MSC定义标准gydF4y2Ba［37］gydF4y2Ba（gydF4y2Ba图就是S1CgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba
mscs(分离自雄性C57Bl/6小鼠)在α-MEM中解冻并放置24小时，不含核糖核苷或脱氧核糖核苷，并添加抗生素、10%胎牛血清(FBS) (Atlanta Biologicals)和10%马血清。hMSCs(从一个24岁的男性供体中分离出来)在α-MEM中解冻并放置24小时，不含核糖核苷或脱氧核糖核苷，添加2 mM l -谷氨酰胺、抗生素和16.5%胎牛血清。24小时后，胰蛋白酶化mMSC或hMSCs，并以60个/cm的速度重镀gydF4y2Ba2gydF4y2Ba．mscs /hMSCs每传代培养一次，直到细胞融合至约70%。P6-P9或P3型hMSCs在PBS和2.5×10中再次悬浮gydF4y2Ba5gydF4y2Ba细胞,5×10gydF4y2Ba5gydF4y2Ba在感染后的第2、0、2或5天，通过尾静脉给药细胞或PBS单独给药。使用26.5号针头和典型的小鼠抑制剂进行注射。gydF4y2Ba
奥司他韦gydF4y2Ba
从胶囊(达菲)(罗氏)奥司他韦磷酸盐溶解在ddHgydF4y2Ba2gydF4y2BaO和实验小鼠通过口服灌胃给药2.5 mg/kg，每天一次，从感染后2天开始，最多5天。对照组给予ddHgydF4y2Ba2gydF4y2BaO经口服灌胃。gydF4y2Ba
支气管肺泡灌洗液（BAL）分析gydF4y2Ba
对C57Bl/6小鼠实施安乐死，通过连续三次滴注和吸入500µl无菌PBS获得来自两肺的BAL液。等份在800℃下旋转gydF4y2BaggydF4y2Ba， 4°C, 5分钟。第一次灌洗的上清被取出并储存在−80°C，以便进一步分析。每只小鼠的所有等量的细胞被合并并使用血球计计数。细胞离心法和改良的赖特-吉氏染色法检测不同炎症细胞计数。采用夹心法ELISA法测定BAL液中CCL2、CXCL10、CCL5和IFN-γ的浓度(DuoSet, R&D Systems for CCL2、CXCL10、CCL5;eBioscience for IFN-γ)根据制造商的说明书。根据制造商的说明，用BCA蛋白测定法(Sigma-Aldrich)测定BAL液总蛋白浓度，用夹心ELISA法(Bethyl Laboratories)测定BAL液IgM浓度。gydF4y2Ba
结果gydF4y2Ba
在两种实验性严重流感模型中，预防和治疗均不影响mscs的体重减轻或改善生存gydF4y2Ba
C57Bl/6小鼠经鼻感染425例EIDgydF4y2Ba50gydF4y2Ba流感A/PR/8（小鼠适应H1N1）或1000 EIDgydF4y2Ba50gydF4y2Ba甲型流感/Mex/4108(2009年猪源流感H1N1)。mMSCs(2.5×10gydF4y2Ba5gydF4y2Ba通过尾静脉接种流感病毒感染小鼠，预防性(感染前4小时和感染后2天)或治疗性(感染后2天或5天)。gydF4y2Ba
流感A/PR/8或A/Mex/4108感染小鼠，预防性或治疗性地给予mMSCs，与给予PBS的感染对照组小鼠相比，经历了类似的体重减轻动力学和随后的生存动力学(gydF4y2Ba图1 a, B, D, EgydF4y2Ba)在感染后第2天或第5天给予mMSC的流感A/PR/8感染小鼠与感染的对照小鼠相比，肺部病毒滴度无差异(gydF4y2Ba图1 cgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba
取7-10周龄雄性C57Bl/6小鼠(gydF4y2BaA、BgydF4y2Ba)感染了425例EIDgydF4y2Ba50gydF4y2Ba流感A/PR/8病毒，给药2.5×10gydF4y2Ba5gydF4y2Bamscs(第6-9段)，静脉注射，预防(感染前4小时和感染后第2天)或治疗(第2天或第5天)。体重减轻动力学(双向方差分析，n = 21-46 /组，3个合并实验)和生存(洛格兰克检验，n = 21-46 /组，3个合并实验)均无显著差异。误差柱代表标准差。（gydF4y2BaCgydF4y2Ba)在pi第6天采集肺，通过MDCK细胞的空斑实验定量检测病毒载量。差异无统计学意义(单因素方差分析，n = 5/组)。误差柱代表四分位范围(IQR)。PFU =斑块形成单位。（gydF4y2BaD、EgydF4y2Ba)小鼠感染了1000个EIDgydF4y2Ba50gydF4y2Ba流感A/Mex/4108，预防性（感染前4小时和第2天P.I.）或治疗性（第2天P.I.）服用MMSC。体重减轻动力学无显著差异（双向方差分析，n = 10/组）或存活率（对数秩检验，n = 误差条代表标准偏差。gydF4y2Ba
在实验性重症流感中，治疗给药mscs未能减少肺部炎症和炎症细胞计数或预防ALIgydF4y2Ba
因为在一些临床前模型中，MSCs已经被报道对肺部炎症和ALI有有效的影响gydF4y2Ba［25］gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba［32］gydF4y2Ba，我们试图确定mMSC给药是否能减少实验性严重流感患者的肺部炎症或预防ALI。C57Bl/6小鼠感染425eidgydF4y2Ba50gydF4y2Ba流感A/PR/8和经管2.5×10gydF4y2Ba5gydF4y2Ba感染后第2天通过尾静脉注射MMSC或PBS。未感染的对照小鼠经鼻给予PBS。所有实验小鼠在感染后第7天处死。测量BAL液和肺匀浆中细胞因子/趋化因子（IFN-γ、CXCL10、CCL2和CCL5）的浓度(gydF4y2Ba图2A-DgydF4y2Ba)。与感染小鼠相比，未感染对照小鼠的BAL液中的细胞因子/趋化因子水平低于检测限，未感染对照小鼠的肺匀浆中的细胞因子/趋化因子水平显著降低。感染后第7天，所有BAL液和肺匀浆细胞因子/趋化因子水平均升高。BAL液和肺hom中的细胞因子/趋化因子水平mMSC给药对流感病毒感染小鼠的生殖细胞没有影响(gydF4y2Ba图2A-DgydF4y2Ba)BAL炎性细胞计数，包括单核细胞/巨噬细胞和中性粒细胞，也不受mMSC给药的影响(gydF4y2Ba图2比gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba
7-10周龄雄性C57Bl/6小鼠感染EID 425例gydF4y2Ba50gydF4y2Ba流感A/PR/8病毒，给药2.5×10gydF4y2Ba5gydF4y2Ba第2天处死mscs(第6-9段)或PBS，第7天处死，取肺泡，取肺。（gydF4y2BaA-DgydF4y2Ba)与对照组小鼠相比，给予mscs的小鼠BAL液和肺匀浆细胞因子和趋化因子(IFN-γ、CXCL10、CCL2或CCL5)没有显著差异(单因素方差分析，n = 4-6 /组，代表2个独立实验)。（gydF4y2BaEgydF4y2Ba) mmsc处理小鼠和感染对照组小鼠经PBS处理后BAL炎症细胞总数相似(单因素方差分析，n = 6/组)。BAL的总百分比差异无统计学意义(gydF4y2BaFgydF4y2Ba)单核/巨噬细胞及(gydF4y2BaGgydF4y2Ba)给予mMCS的小鼠与给予PBS的感染对照组小鼠之间的中性粒细胞(单因素方差分析，n = 6/组)。误差柱代表四分位范围(IQR)。ND =无法探测。gydF4y2Ba
感染后第7天，与感染对照组相比，mmsc处理小鼠的肺部观察到类似的炎症细胞浸润，组织学显示(gydF4y2Ba图3一gydF4y2Ba)．与感染小鼠相比，未感染对照组小鼠BAL液中总蛋白和IgM明显降低或低于检测水平(gydF4y2Ba图3 b, CgydF4y2Ba)．然而，与对照组小鼠相比，给予mscs的小鼠总蛋白或IgM没有观察到差异(gydF4y2Ba图3 b, CgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba
8周龄雄性C57Bl/6小鼠感染了425只EIDgydF4y2Ba50gydF4y2Ba流感A/PR/8病毒，给药2.5×10gydF4y2Ba5gydF4y2BamMSCs（第6代），在第2天通过尾静脉，在第7天处死小鼠(gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)苏木精和伊红染色的肺切片的代表性图像显示，与感染对照组相比，mMSC处理小鼠的细胞和肺损伤相似。（gydF4y2BaB, CgydF4y2Ba)在给予mscs的小鼠和给予PBS的感染对照组小鼠之间，观察到ALI的BAL液体标志物(总蛋白或IgM)无显著差异(单因素方差分析，n = 6/组，代表2个独立实验)。误差柱代表四分位范围(IQR)。ND =无法探测。gydF4y2Ba
在实验性严重或亚致死性流感中，预防性或治疗性给予hMSCs均不会影响体重减轻或提高生存率gydF4y2Ba
迄今为止，大多数关于使用间充质干细胞治疗ALI的实验证据都来自于使用间充质干细胞的研究gydF4y2Ba［25］gydF4y2Ba，gydF4y2Ba［26］gydF4y2Ba，gydF4y2Ba［29］gydF4y2Ba，gydF4y2Ba[31]gydF4y2Ba．然而，在进行临床试验之前，深入研究hMSCs的功效和作用机制是至关重要的，以便准确预测人体的生理反应gydF4y2Ba[38]gydF4y2Ba，gydF4y2Ba［39］gydF4y2Ba，gydF4y2Ba[40]gydF4y2Ba．证据还表明，在某些模型中，hMSCs和mMSCs发挥作用的机制是不同的gydF4y2Ba[41]gydF4y2Ba然而，在小鼠模型中，hMSC治疗与mMSC治疗一样有效（如LPS诱导的ALI）gydF4y2Ba［26］gydF4y2Ba，gydF4y2Ba[31]gydF4y2Ba，gydF4y2Ba[38]gydF4y2Ba．因此，我们也评估了hMSC治疗实验性重症流感的使用。gydF4y2Ba
用425只EID感染C57Bl/6小鼠gydF4y2Ba50gydF4y2Ba(致死剂量)或150 EIDgydF4y2Ba50gydF4y2Ba（非致死剂量）流感A/PR/8和2.5×10gydF4y2Ba5gydF4y2Ba通过尾静脉预防性地给予hMSCs(感染前2天或4小时;分别为第2天和第0天)，或治疗(感染后第2天和第5天)。注射hMSCs的小鼠和注射PBS的对照组小鼠在流感a诱导的体重减轻(致死和非致死模型)或存活率方面没有差异(gydF4y2Ba图4gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba
8周龄雄性C57Bl/6小鼠感染了425只EIDgydF4y2Ba50gydF4y2Ba(致命型号)或150个EIDgydF4y2Ba50gydF4y2Ba流感A/PR/8病毒（亚致死模型）和2.5×10gydF4y2Ba5gydF4y2Ba预防性（感染前2天或4小时（第0天））或治疗性（第2天或第5天）通过尾静脉记录hMSCs（第3代）或PBS。每天记录体重。体重无显著差异(gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)减重动力学(双向方差分析，n = 18-20 /组，2个联合实验)或(gydF4y2BaB)gydF4y2Ba存活率（对数秩检验，n = 在致死性流感模型中观察到18-20个/组，2个混合实验）(gydF4y2BaCgydF4y2Ba)在亚致死性流感模型中未观察到体重下降动力学的显著差异（双向方差分析，n = 误差条表示标准偏差。gydF4y2Ba
在实验性重症流感中，给药hMSCs未能减少肺部炎症和炎症细胞计数或预防ALIgydF4y2Ba
为了评估hMSC治疗是否能减少肺部炎症，给实验小鼠注射2.5×10μggydF4y2Ba5gydF4y2Ba在感染后第2天或第5天，通过尾静脉注射hMSCs或PBS，并在感染后第7天处死。未感染的小鼠经鼻给予PBS。测量IFN-γ、CXCL10、CCL2和CCL5的BAL液浓度(gydF4y2Ba图5模拟gydF4y2Ba)．未感染对照组小鼠BAL液中细胞因子/趋化因子水平低于检测限。虽然流感感染与所有测量到的细胞因子/趋化因子表达增加有关，但与PBS处理的对照组小鼠相比，hMSCs处理的小鼠之间没有显著差异(gydF4y2Ba图5模拟gydF4y2Ba)．BAL炎症细胞计数，包括单核/巨噬细胞和中性粒细胞，也不受hMSC给药的影响(gydF4y2Ba图5E-GgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba
感染425 EID的8周龄雄性C57Bl/6小鼠gydF4y2Ba50gydF4y2Ba流感A/PR/8病毒，给药2.5×10gydF4y2Ba5gydF4y2Ba第2天或第5天，在第7天处死hMSCs（第3代），进行BAL(gydF4y2BaA-DgydF4y2Ba第2天和第5天注射hMSCs的小鼠与对照组注射PBS的小鼠之间的BAL液细胞因子和趋化因子(IFN-γ、CXCL10、CCL2或CCL5)没有显著差异(单因素方差分析，n = 5/组，代表2个独立实验)。（gydF4y2BaEgydF4y2Ba)hMSC处理的小鼠和感染的对照小鼠给予PBS后BAL炎症细胞总数相似（单向方差分析，n = BAL的总百分比没有显著差异(gydF4y2BaFgydF4y2Ba)单核/巨噬细胞及(gydF4y2BaGgydF4y2Ba)给予hMCS的小鼠与给予PBS的感染对照组小鼠之间的中性粒细胞(单因素方差分析，n = 6/组)。误差柱代表四分位范围(IQR)。ND =无法探测。gydF4y2Ba
组织学显示，感染后第7天，与感染对照组相比，hMSC处理的小鼠肺中观察到类似的炎性细胞浸润(gydF4y2Ba图6gydF4y2Ba)．与感染小鼠相比，未感染对照组小鼠BAL液中总蛋白和IgM明显降低或低于检测水平(gydF4y2Ba图6B、CgydF4y2Ba)．感染后第2天和第5天，给予hMSCs的小鼠与对照组给予PBS的小鼠相比，总蛋白或IgM没有观察到差异(gydF4y2Ba图6B、CgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba
8周龄雄性C57Bl/6小鼠感染了425只EIDgydF4y2Ba50gydF4y2Ba流感A/PR/8病毒，给药5×10gydF4y2Ba5gydF4y2Ba于P.I.第2天和第5天处死hmsc(第3代)，于P.I.第7天处死BAL。gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)苏木精和伊红染色的肺切片的代表性图像显示，与感染对照组相比，hMSC处理的小鼠具有相似的细胞结构和肺损伤(gydF4y2BaB, CgydF4y2Ba)在第2天和第5天注射hMSCs的小鼠与对照组注射PBS的小鼠之间，ALI(总蛋白或IgM)标记物没有显著差异(单因素方差分析，n = 5/组，代表2个独立实验)。误差柱代表四分位范围(IQR)。ND =无法探测。gydF4y2Ba
当作为实验性严重流感的辅助治疗时，hMSCs的治疗给药未能改变体重减轻或提高生存率gydF4y2Ba
为了模拟流感的临床表现，在用425个EID攻毒C57Bl/6小鼠后，将奥司他韦和hMSCs联合抗病毒治疗推迟48小时gydF4y2Ba50gydF4y2Ba流感A/PR/8病毒。小鼠在感染后第2-6天服用奥司他韦，单独服用或与5×10联用gydF4y2Ba5gydF4y2Ba感染后第2天给予hMSCs。gydF4y2Ba
感染后第6天和第7天，与对照组相比，奥司他韦治疗小鼠的体重减轻显著减少(Bonferroni测试后的双向方差分析，***p<0.001， **p<0.01) (gydF4y2Ba图7gydF4y2Ba)．感染小鼠联合给予奥司他韦和hMSCs，与单独给予奥司他韦，在体重减轻方面没有观察到差异。观察到奥司他韦治疗的小鼠存活率有增加的趋势(gydF4y2Ba图7 bgydF4y2Ba)．感染小鼠联合使用奥司他韦和hMSCs与单独使用奥司他韦(gydF4y2Ba图7 bgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba
八周的雄性C57BL / 6小鼠感染425 EIDgydF4y2Ba50gydF4y2Ba流感A/PR/8病毒经灌胃给药2.5 mg/kg奥司他韦（100 ul ddH2O），每天1次，连续5天，从第2天开始，无论是否服用hMSC（5×10gydF4y2Ba5gydF4y2Ba细胞）在第2天P.I(gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)测定感染过程中的体重下降动力学，以评估小鼠的发病率。与对照组小鼠相比，奥司他韦治疗组小鼠在第6天和第7天的体重下降显著降低(经Bonferroni后的双向方差分析，***p<0.001， **p<0.01, n = 18-20 /组;2汇集实验)。与单独使用奥司他韦的小鼠相比，联合使用奥司他韦和hMSCs的小鼠没有观察到体重减轻的差异。误差柱代表标准差。（gydF4y2BaBgydF4y2Ba）生存曲线。与对照组给药的DDH相比，培养的奥司他韦培养的小鼠趋向于增加的存活率gydF4y2Ba2gydF4y2BaO;然而，奥司他韦和hMSCs联合给药小鼠与奥司他韦单独给药小鼠之间没有观察到差异(洛格兰克试验，n = 18-20 /组;2汇集实验)。操作系统=奥司他韦。gydF4y2Ba
当作为实验性重症流感的辅助治疗时，hMSCs的治疗给药未能减少肺部炎症或预防ALIgydF4y2Ba
上述各组C57Bl/6小鼠于感染后第7天处死。组织学显示，奥司他韦处理的小鼠与未处理的感染对照组小鼠相比，肺部炎症细胞浸润减少(gydF4y2Ba图8gydF4y2Ba)然而，与单独服用奥司他韦的小鼠相比，联合服用hMSCs和奥司他韦的小鼠的炎症细胞浸润和肺损伤相似(gydF4y2Ba图8gydF4y2Ba)．与未感染小鼠相比，我们观察到甲型流感/PR/8感染小鼠BAL液中所有测量到的细胞因子/趋化因子水平升高(gydF4y2Ba图8中gydF4y2Ba)然而，在用hMSCs和奥司他韦联合治疗的感染小鼠和单独用奥司他韦治疗的感染小鼠之间，BAL液细胞因子/趋化因子水平没有显著差异。同样，与单独使用奥司他韦治疗的感染小鼠相比，联合使用奥司他韦和hMSCs治疗的感染小鼠的BAL液总蛋白和IgM没有差异(gydF4y2Ba图8 f, GgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba
八周的雄性C57BL / 6小鼠感染425 EIDgydF4y2Ba50gydF4y2Ba流感A/PR/8病毒经灌胃给药2.5 mg/kg奥司他韦（100 ul ddH2O），每天1次，连续5天，从第2天开始，无论是否服用hMSC（5×10gydF4y2Ba5gydF4y2Ba第2天处死，第7天处死(gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)苏木精和伊红染色肺切片的代表性图像。奥司他韦治疗的小鼠与未治疗的对照组小鼠相比，肺部炎症细胞浸润减少。然而，联合给予hMSCs和奥司他韦的小鼠与单独给予奥司他韦的小鼠表现出相似的细胞和肺损伤。（gydF4y2BaB-EgydF4y2Ba)与单独服用奥司他韦的小鼠相比，联合服用奥司他韦和hMSCs的小鼠BAL液中细胞因子和趋化因子（IFN-γ、CXCL10、CCL2或CCL5）水平无显著差异（单向方差分析，n = 8-10/组，代表2个独立实验）(gydF4y2BaF, GgydF4y2Ba)与单独给予奥司他韦的小鼠相比，奥司他韦与hMSCs联合给予小鼠的ALI(总蛋白或IgM)标记物没有显著差异(单因素方差分析，n = 8-10 /组，代表2个独立实验)。误差柱代表四分位范围(IQR)。ND =无法探测;操作系统=奥司他韦。gydF4y2Ba
讨论gydF4y2Ba
据我们所知，这项研究是首次报道MSC治疗流感诱导ALI(特别是病毒诱导ALI)的研究。我们观察到，在实验性重症流感中，无论是单独或作为辅助治疗策略，给药mscs或hMSCs都不能改善生存，减少肺部炎症或预防ALI。尽管ALI和严重流感的临床表现和病理生物学有相似之处，我们的研究结果表明MSC治疗可能不是改善严重流感预后的有效治疗策略。gydF4y2Ba
MSC微环境中局部信号分子的存在可以在确定临床前模型中MSC的疗效方面发挥重要作用gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba结果表明，在IFN-γ共同刺激下，在TNF、IL-1α或IL-1β共同存在下，hMSCs分泌大量吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)和趋化因子，驱动t细胞迁移和hMSCs介导的t细胞抑制gydF4y2Ba[41]gydF4y2Ba相反，低水平的IFN-γ或MSC微环境中缺乏某些信号可导致MSC表现为抗原呈递细胞gydF4y2Ba[45]gydF4y2Ba．由于感染的特点是在整个感染过程中有不同的细胞因子和动态调节的炎症微环境，在我们的模型中，MSCs引入宿主微环境的时间可能会影响MSC的功能。在我们的实验中，骨髓间充质干细胞分别在肺部炎症轻微或升高的不同时间点注入。在所有的治疗方案中(无论是预防还是治疗)，间充质干细胞都不能抑制宿主肺部炎症，降低ALI，或改善发病率和死亡率。我们还评估了在采集注射前与IFN-γ和TNF孵育24小时后mMSC的疗效;然而，在我们的严重流感小鼠模型中，这种方法未能提高存活率(数据未显示)。总之，这些结果表明，虽然MSC给药的时机可能很重要，但它可能不能解释在我们的实验性严重流感模型中MSC缺乏疗效的原因。此外，MSC免疫抑制所需的细胞因子环境gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba可能不能充分反映所需的细胞因子环境gydF4y2Ba体内gydF4y2Ba．例如，有3例间充质干细胞未能改善预后gydF4y2Ba体内gydF4y2Bat细胞功能介导的疾病模型，尽管它们有抑制t细胞增殖的能力gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba［42］gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba［44］gydF4y2Ba．gydF4y2Ba
最近的gydF4y2Ba体内gydF4y2Ba研究表明，MSCs可能增强抗菌免疫效应细胞的功能，并增加细菌清除在感染挑战gydF4y2Ba［28］gydF4y2Ba，gydF4y2Ba［35］gydF4y2Ba，gydF4y2Ba[46]gydF4y2Ba．因此，MSC治疗可能在流感后继发性细菌性肺炎的情况下提供临床益处，流感相关死亡的一个重要原因，特别是在老年患者中gydF4y2Ba[47]gydF4y2Ba。或者，流感病毒可能直接与骨髓间充质干细胞相互作用以抑制其抗炎活性。最近的一项研究表明，骨髓间充质干细胞表达流感病毒受体α-2,3和α-2,6连接的唾液酸，并支持流感病毒的有效感染和复制gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba[48]gydF4y2Ba流感病毒与骨髓间充质干细胞结合导致骨髓间充质干细胞裂解和细胞因子分泌。流感病毒与表达TLRs的骨髓间充质干细胞之间的相互作用也可能很重要。已经描述了通过病毒激活骨髓间充质干细胞上的toll样受体3（TLR3）和TLR4诱导的骨髓间充质干细胞介导的抗炎作用的暂时失活gydF4y2Ba[49]gydF4y2Ba．这一观察结果可能代表了一种机制，使免疫系统在病毒或细菌存在的情况下有效地发挥作用。然而，流感病毒由单链RNA (ssRNA)组成，不产生大量的双链RNAgydF4y2Ba[50]gydF4y2Ba或LPS，TLR3和TLR4的配体。此外，TLR对ssRNA识别（TLR7和TLR8）很重要gydF4y2Ba[51]gydF4y2Ba，gydF4y2Ba［52］gydF4y2Ba在骨髓来源的人骨髓间充质干细胞上不表达gydF4y2Ba[53]gydF4y2Ba但在骨髓源性小鼠间充质干细胞上表达gydF4y2Ba［54］gydF4y2Ba．gydF4y2Ba
虽然msc分泌的蛋白如TSG-6和PGEgydF4y2Ba2gydF4y2Ba在肺损伤的临床前模型中，这些蛋白被归因于msc介导的改善结果，这些蛋白在严重流感的治疗中可能不是有益的，尽管来自病毒或细菌源的肺损伤的潜在病理生理学常见。例如，尽管重组TSG-6治疗lps诱导的小鼠肺损伤可能是有益的gydF4y2Ba[38]gydF4y2Ba，TSG-6治疗严重流感可能是有害的，因为它能够上调环氧合酶-2（COX-2），因为COX-2上调与严重流感的发病率和死亡率增加有关gydF4y2Ba［3］gydF4y2Ba，gydF4y2Ba[55]gydF4y2Ba，gydF4y2Ba[56]gydF4y2Ba．类似的原理也适用于间充质干细胞PGE上调gydF4y2Ba2gydF4y2Ba它是由COX-2转化花生四烯酸生成的。gydF4y2Ba
最后，本研究中观察到的MSC治疗的缺乏治疗益处可能是由于鼠模型的严重流感的固有局限性。具体地，鼠严重流感模型的短暂持续时间不允许在流感感染后对肺回收进行调查。虽然施用MSCs在急性环境中实验严重流感的临床结果，但目前的研究结果并不排除MSC治疗可能在流感后潜在肺功能的长期修复和恢复的可能性。感染。gydF4y2Ba
支持信息gydF4y2Ba
图S1。gydF4y2Ba
MSC符合ISCT定义标准。gydF4y2Ba相衬显微镜图像gydF4y2Ba(A，从左到右)gydF4y2Ba未分化的mscs (P9)， Oil Red染色的mscs向脂肪细胞分化，茜素Red S染色的mscs向骨细胞分化，Alcian Blue染色的mscs向软骨细胞分化(10×magnification)。gydF4y2Ba(B，从左到右)gydF4y2Ba未分化的hmsc (P3)， Oil Red染色的hmsc向脂肪细胞分化，茜素Red染色的hmsc向骨细胞分化，Alcian Blue染色的hmsc向软骨细胞分化(10×magnification)。gydF4y2Ba（C）gydF4y2Ba流式细胞术分析hMSC标记物(P3)。hMSCs (P3)干细胞表面抗原CD73、CD90和CD105的>阳性率为99%，造血细胞标志物CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR的>阳性率<2%。gydF4y2Ba
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0071761.s001gydF4y2Ba
(TIF)gydF4y2Ba
作者的贡献gydF4y2Ba
构思并设计了实验:ID DB SM HK DJK KCK WCL。进行实验:ID DB SM RB HK。分析数据:ID HK WCL。提供试剂/材料/分析工具:DJK KCK。写论文:ID WCL。修改稿件:ID DB SM DJK KCK WCL。gydF4y2Ba
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