文摘
本研究的目的是检查fibre-type再分配的本质与纤维代谢剖面在股外侧肌慢性阻塞性肺疾病(COPD)和慢性阻塞性肺病亚型。
15 COPD患者由高分辨率计算机断层扫描与肺气肿分层(8)和15名健康对照组进行了研究。肌纤维腺苷三磷酸酶染色和免疫组织化学是用来确定纯,以及混合纤维类型。细胞色素的氧化能力,纤维染色c氧化酶、琥珀酸脱氢酶活动,和糖原磷酸化酶糖酵解能力。
类型的比例我应承担的纤维在慢性阻塞性肺病患者明显降低(16%与42%),尤其是在肺气肿,混合纤维的比例较高(29%)与16%)相比,控制。纤维染色氧化酶阳性的比例较低在COPD患者中,这与类型的比例还是我纤维。在慢性阻塞性肺病花絮纤维内氧化能力较低。
作者得出结论,fibre-type转换参与fibre-type再分配在慢性阻塞性肺疾病。低氧化能力密切相关类型的比例我应承担的纤维,但额外减少氧化在花絮纤维酶活性存在。在肺气肿Fibre-type异常可能会加剧。
这项研究是由来自荷兰哮喘基金会的资助(项目编号96.16)。
标志之一的慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者是一个逐步降低运动能力。除了肺衰竭,骨骼肌功能障碍也有助于运动不耐受1,2。生化和形态学改变外围骨骼肌慢性阻塞性肺病患者的描述3,但目前尚不清楚这些变化如何发展。异常fibre-type比例被发现在慢性阻塞性肺病的股四头肌4- - - - - -6,但是在这些研究纤维只分为I型,花絮”的基础上或IIX肌纤维腺苷三磷酸酶(mATPase)染色。在目前的研究中,mATPase和免疫组织化学鉴定纤维结合,使得检测混合纤维(纤维表达多个肌凝蛋白重链(MyHC)亚型),提供有用的信息在慢性阻塞性肺病底层fibre-type再分配机制。
数据对代谢酶活性在慢性阻塞性肺病的股四头肌是不一致的。糖酵解酶活性增加可能是也可能不是7,8和氧化酶活性降低7,8。然而,Sauledaet al。9发现细胞色素的活动c氧化酶(COX),一种酶参与氧化能量代谢,增加。因此,酶配置文件中确定fibre-type分类研究。考克斯是一个线粒体酶参与氧化磷酸化。琥珀酸脱氢酶(SDH)也是一个线粒体酶,发挥其在柠檬酸循环催化作用。糖原磷酸化酶(GlyP)是参与肝糖分解和葡萄糖运输1磷酸盐从糖原存储为糖酵解。因此,考克斯和SDH用作氧化能量代谢和GlyP标记作为糖酵解能量代谢的一个标志。用这种方法也可以建立fibre-type比例和酶活性的变化在多大程度上是耦合的。
使用凝胶电泳技术较低类型的我和一个更高的二型MyHC同种型内容被发现在慢性阻塞性肺病患者的股四头肌与健康受试者相比10,11。在这些研究MyHC类型我应承担的内容呈正相关的二氧化碳扩散能力肺(DL,有限公司)和1秒用力呼气量(FEV1)。一方面,与的关系DL,有限公司表明类型的损失还是我在肺气肿患者纤维更明显,另一方面,FEV的关系1表明,损失严重的慢性阻塞性肺病患者更明显。在当前的研究中,进一步了解肌肉的变化,没有肺气肿患者分层的高分辨率计算机断层扫描(HRCT)提供。
本研究的目的是:1)在慢性阻塞性肺病建立fibre-type再分配是否通过渐进的转变发生在细胞内MyHC同种型的内容,这将导致更大比例的混合纤维类型的病人;2)提供进一步洞察代谢酶(氧化和糖酵解)的行为及其与fibre-type分布的关系;3)建立如果异常fibre-type分布严重肺气肿患者相比nonemphysema病人。
材料和方法
研究人群
一群15骨盆韧带严重气流梗阻患者和15名健康志愿者进行了研究(表1所示⇓)。所有慢性阻塞性肺病患者根据美国胸科学会(ATS)的指导方针12和慢性气流限制,定义为测量FEV1<参考FEV的70%1。病人也有不可逆转的改善FEV阻塞性气道疾病(< 10%1预测基线后β2受体激动剂吸入)。他们是在一个临床病情稳定,没有患有呼吸道感染或恶化的疾病前至少4周的研究。药物的使用剂量和医生从医院提供检索文件和引用。患者接受标准优化吸入治疗。由于潜在的不良口服糖皮质激素对骨骼肌的影响,对研究结果的影响在本研究专门调查。剂量,是表示为氢化可的松等价物·日−1。活组织检查的时候七15 COPD患者的维持剂量的强的松(范围5 - 10毫克·天−1)。排除标准是恶性肿瘤,心脏衰竭,远端动脉病,最近的手术,α1-antiprotease不足,严重的内分泌,肝、肾功能障碍和抗凝药物的使用。书面知情同意了所有学科和研究大学医院医学伦理委员会批准的马斯特里赫特(马斯特里赫特、荷兰)。
肺功能测试
所有的病人和对照组接受肺量测定法来确定,在别人,FEV1,从至少三个技术上可接受的最高的价值评估。残余容积(RV)和胸内的气体体积(ITGV)被全身体积描记法和评估DL,有限公司是衡量使用次呼吸方法(Masterlab, Jaeger,维尔茨堡,德国)。所有值获得相关的参考价值和预测的百分数表示13。
肺气肿的评估
评价存在的实质破坏,肺气肿的标志14,是由HRCT如前所述15。肺气肿的严重程度和范围在每个扫描是由两个独立的观察者视觉得分根据直接观察法酒井法子开发的等。16。HRCT分数范围从0(没有肺气肿)到120(严重的肺气肿)。患者分层HRCT分数分为两组:HRCT得分< 30:nonemphysema子群(Emph−);HRCT得分> 30:肺气肿小组(Emph +)。
组织收集和处理
动脉氧张力(P啊,一个2)确定(ABL 330;辐射计,哥本哈根,丹麦)获得的一份血液样本的桡动脉穿刺而呼吸室内空气。Postabsorptive股四头肌外侧的肌肉活检获得局部麻醉下穿刺活检技术17。活检被安置在一滴Tissue-tek®(10月化合物)在软木塞软木的纤维方向垂直于这个平面。异戊烷融化的标本被冻结,在液氮预冷和存储在−35°C。连续低温恒温器截面(10µm)是在−20°C和低温恒温器切片机安装在幻灯片都储存在−35°C到分析。连续9个幻灯片(每个载有两个或三个截面)活检样本用于fibre-type特性和酶活性染色。至少100(但200)纤维共存对所有九个幻灯片编号和分析如前所述18。纤维包括如果他们是集群的一部分≥30纤维和排除,如果存在令人不安的文物。由同一人所有染色强度进行分析。
Fibre-type表征
酸性mATPase pre-incubation在pH值为4.419和执行mATPase碱pre-incubation pH值10.420.。双pre-incubation方法进行酸碱10.4和4.621,唯一的区别是,固定部分碱性pre-incubation之前执行。pre-incubation后,部分被染色和安装22。图1 a - c⇓显示mATPase染色的例子。
免疫组织化学进行了面板的单克隆抗体(mab);型我MyHC (MAb 219 - 1 - d1)型活动花絮MyHC (MAb 333 - 7 - h1),对型活动花絮+ IIX MyHC (MAb 332 - 3 - d4)23。图1 d-f⇑显示MyHC染色的例子。
纤维被分配到类,首先基于三mATPase染色强度(−+或+ +)其次,免疫反应性(−或+)(表2⇓)。以下mATPase和MyHC (CMM) fibre-type类别是:I型,I /活动花絮,花絮,花絮/ IIX IIX和杂项(misc)。
酶活性染色
考克斯染色是由孵化部分1 h在50毫米三羟甲基氨基甲烷/盐酸缓冲液(pH值7.6)包含0.22蔗糖,14毫米,3′-diaminobenzidine tetrahydrochloride, 80µM细胞色素c和1300 U的过氧化氢酶。考克斯活动的网站颜色棕色24。SDH染色是由孵化部分1 h在37°C 0.2钠磷酸盐缓冲剂含有琥珀酸0.1米和1.2毫米nitro-blue四唑。网站的SDH活性颜色蓝色25。GlyP染色是由孵化部分为5分钟43毫米醋酸钠缓冲(pH值5.6)包含7毫米葡萄糖量1高磷酸盐在1毫米腺苷酸(AMP), 0.01%的糖原和15%的乙醇25后,新成立的多糖是蓝色Lugol的碘。考克斯和SDH截面在乙醇脱水范围和安装在Entallan®。GlyP部分安装在水甘油/明胶,彩色Lugol的碘。在每个部分中,选择三个染色强度反映纤维酶活性:正(+)、负(−)或中级(±)。例如,纤维阳性考克斯,中间对SDH和消极GlyP将考克斯+ SDH±和GlyP−。图1胃肠道⇑显示酶活性染色的例子。
统计分析
值报告为平均值±标准偏差(sd)和误差数据反映平均数标准误差(sem)。比较组间数据使用一个未配对t测试(如果适当纠正不平等的方差)或单向方差分析(方差分析)(未配对t测试作为事后测试)。潜在的利益变量之间的关系进行评估使用皮尔逊相关性测试或偏相关正确的年龄。数据分析根据奥特曼的指导方针et al。26。小动物——一张长有p < 0.05被认为是具有统计学意义。
结果
15(12名男性和三名女性)和慢性阻塞性肺病患者15健康对照组(13名男性和两名女性)参与本研究(表1所示⇑)。没有性别或年龄的差异之间的组织。身体质量指数(BMI),P啊,一个2,FEV1和DL,有限公司显著降低,而RV和ITGV更高的病人比控制。与HRCT分数> 8例(30)被分配到Emph +和七个病人(HRCT分数< 30)Emph−子群。的P啊,一个2,FEV1和DL,有限公司较低和RV和ITGV更高Emph +比Emph−慢性阻塞性肺病亚型。
一个典型的例子,组织化学的结果如图1所示⇑。首先数据解释为如果纯粹基于mATPase染色(图2⇓)。mATPase类型我应承担的纤维的比例较低(19%)与的比例43%,p < 0.001)和mATPase type-IIX纤维更高(46%与27%,p = 0.004)在慢性阻塞性肺病组相比,控制。没有差异的百分比mATPase iia纤维。通过结合三个mATPase pre-incubation协议与免疫组织化学,五个fibre-type类别定义:CMM I型,活动花絮,IIX, I /花絮和花絮/ IIX纤维,后两个代表混合纤维(表2⇑)。Fibre-type分布随后重新建立这个更精确的方法(图2 b⇓)。类型的比例还是我纤维较低(16.1%与42.4%,p < 0.001)和type-IIX纤维的百分比往往更高(23.8%与14.7%,p = 0.088)在慢性阻塞性肺病比控制。此外,hybrid-fibres I /花絮(5.9%的比例与1.3%,p = 0.044),活动花絮/ IIX (22.9%与14.4%,p = 0.041),总(I /花絮+活动花絮/ IIX) (28.8%与15.7%,p = 0.008)在慢性阻塞性肺病与健康受试者相比更高。纤维不符合前面讨论的范畴之一,被分配到其他组。尽管这些纤维的比例也在慢性阻塞性肺病高于控制(1.6%与0.2%,p = 0.017),但它们的总体贡献fibre-type成分是微不足道的。没有差别在两组之间iia纤维的百分比。
图3⇓显示了酶活性染色的结果的考克斯+ SDH +和GlyP +。总的来说,考克斯+和SDH +纤维的比例较低(20.1%)与45.8%,p < 0.001和14.2%与36.3%,p < 0.001),而考克斯−和SDH +纤维的比例较高(35.3%)与23.8%,p = 0.003和47.9%与25.0%,p < 0.001,数据未显示)在慢性阻塞性肺病比在对照组。考克斯±纤维的比例也在慢性阻塞性肺病高于控制(44.6%与30.3%,p = 0.002,数据未显示)。没有差异的比例GlyP + GlyP−, GlyP±和SDH±纤维之间的病人和控制。GlyP +纤维的比例不是用糖皮质激素治疗的患者(45.8%)高于对照组(34.2%,p = 0.045),也高于并接受糖皮质激素的患者(29.2%,p = 0.017)。因为酶活性染色和fibre-type特征进行串行截面,酶活性可能在fibre-type评估类别。在CMM fibre-type类别I /花絮和花絮COPD患者较低比例的纤维氧化酶呈阳性,考克斯+和SDH +如图所示(表3⇓)。在CMM fibre-type I /花絮考克斯±纤维的比例更高的病人(数据没有显示)。
在慢性阻塞性肺病有更明显的减少的百分比CMM类型还是我在Emph +纤维比Emph−(10.0%与23.1%,p = 0.045)相比,控制(图。4⇓)。每组至少有一个病人没有CMM类型高我纤维被发现。没有观察到两个子类型之间的差异对酶活性染色。
牢固的关系被发现之间的慢性阻塞性肺病CMM的比例我应承担的纤维种类和比例的考克斯+ (r = 0.77, p = 0.001)和SDH + (r = 0.84, p < 0.001),纤维(图5所示⇓)。积极的年龄和类型的百分比之间的关系我应承担的纤维在健康对照组(r = 0.61;p = 0.015)也被观察到。这种关系也出现在Emph−COPD亚型,尽管这没有达到统计学意义(r = 0.73;p = 0.061)。这种关系没有Emph + (r = 0.49;p = 0.290)。没有fibre-type比例和肺功能数据之间的相关性被发现。考克斯+纤维的比例呈正相关的P啊,一个2(r = 0.60, p = 0.019)。
讨论
这项研究强烈表明我IIX fibre-type再分配在慢性阻塞性肺病患者的股外侧肌通过渐进的转变发生在细胞内MyHC同种型内容。因此,纤维的比例高的酶参与氧化能量代谢活动减少的病人。这些比例密切相关类型的比例我应承担的纤维,但即使在花絮纤维氧化能力减少慢性阻塞性肺病。没有糖酵解能力差异病人和控制。此外,第一次,结果表明,低纤维类型我应承担的比例严重肺气肿患者相比,慢性阻塞性肺病患者没有肺气肿。
在目前的研究中,发现个别纤维的基础上,结合三个不同mATPase染色技术和免疫组织化学。通过这样做,准确区分类型的我,花絮和IIX纤维,还我/花絮和花絮/ IIX混合纤维可以。混合纤维包含多个MyHC亚型,它可以在任何比例共存。在目前的研究中,纤维被确定为被mATPase混合只有表示染色和免疫组织化学。更高比例的混合纤维在慢性阻塞性肺病强烈表明,渐进的一种纤维类型转换为另一个发生:我→/花絮”→花絮”→花絮/ IIX→IIX。
与mATPase type-IIX fibre-type比例,CMM的不同纤维type-IIX COPD患者和控制之间的比例没有达到统计学意义。这可以解释这一事实的一部分mATPase IIX纤维都分配给混合花絮/ IIX fibre-type类别。健康受试者相比,比例减少mATPase必经我纤维类型和比例的增加mATPaseⅱ型(花絮和/或IIX)纤维在慢性阻塞性肺病之前报道4- - - - - -6。然而,这些研究大型fibre-type分布之间存在的差异。疾病严重程度的差异,研究人口可能解释这些差异在某种程度上,但应用组织化学技术的大型多元化也是一个因素。此外,混合纤维以前不常检测到,因此被误诊。例如,混合I /花絮纤维染色后中间mATPase活动pre-incubation pH值4.4,将确定为IIX纤维。
在这项研究中,考克斯+和SDH +纤维的比例降低COPD组控制相比,虽然考克斯−和SDH−纤维的百分比增加。虽然酶活性染色是一种半定量的方法,它提供了有用的信息关于本地化。因此,在肌肉活检标本,减少活动的线粒体酶柠檬酸合成酶、SDH和hydroxyacyl-coenzymeA脱氢酶在慢性阻塞性肺病已报告7,8。目前的数据是不一致的研究由Sauleda执行的结果et al。9考克斯,增加活动和考克斯活动与之间的负相关P啊,一个2对慢性阻塞性肺病患者。因为考克斯是参与氧化磷酸化和最后的酶和氧呼吸链的相互作用,作者曾提出,其活动的增加可能提高残余氧萃取的效率作为适应缺氧3。相比之下,考克斯的百分比+纤维和减少之间的正相关和考克斯+纤维的比例P啊,一个2在这项研究中观察到。各种各样的解释可以提供这些数据之间的差异和以前公布的报告9。首先,考虑的是这个意思P啊,一个2这个病人组不一样低P啊,一个2发现Sauledaet al。9(9.9 kPa与分别为8.3 kPa)。如果缺氧可能上调考克斯活动,这将意味着考克斯活动研究中的病人组低于《考克斯Sauleda COPD组中观察到的活动et al。9。其次,人们也可以辩称,尽管考克斯+纤维比例降低,总体COX活性升高是由于观察到的考克斯±纤维的病人的比例增加。然而,考克斯当然不是整体染色强度高相比,慢性阻塞性肺病的部分控制。此外,没有考克斯±纤维的比例关系P啊,一个2。还需要更多的研究来阐明考克斯在骨骼肌慢性阻塞性肺病的行为。
一项研究称糖酵解酶活性增加磷酸果糖激酶(PFK)在慢性阻塞性肺病患者的股外侧肌8。此外,增加PFK活动报道肺移植受者与控制相比,尽管GlyP活动被发现不变27。相应地,增加的百分比GlyP +纤维并没有发现在这个研究。不变的解释GlyP +纤维比例在本研究的七15 COPD患者接受低剂量的口服糖皮质激素。GlyP +纤维的比例的病人不接受皮质类固醇是高于控制,表明糖皮质激素影响GlyP活动。然而,病人经常遭受发作更容易接受糖皮质激素,因此全身炎症可能涉及。糖皮质激素对糖酵解代谢的影响需要进一步阐明。
在慢性阻塞性肺病患者在这项研究中,纤维的比例呈阳性考克斯和SDH拒绝在同一个数量级的百分比类型我纤维。事实上,大多数的考克斯+和SDH +纤维分为类型我应承担的纤维,这是强调他们的比例相关性强。因此总体而言,相对损失我纤维和氧化的损失类型的酶活性有关。它从未被建立之前的下降百分比纤维类型的我和酶参与了COPD的氧化能量代谢活动是有联系的。由于在本次研究中酶活性染色和fibre-type分类进行串行横断面图,它不仅可以检查fibre-type再分配和酶活性之间的关系,但也fibre-type类别内的酶活性。
考克斯+和SDH +纤维的比例在每个单独的CMM纤维类型、I /花絮和花絮,显著降低了慢性阻塞性肺病控制相比(表3所示⇑)。此外,考克斯±纤维的比例在CMM iia纤维的患者更高。因此,可行的考克斯+纤维转化为考克斯±纤维。是可能的,这额外的氧化能力的丧失是专门针对iia纤维。另一个可能性是氧化酶活性的损失发生在fibre-type的早期阶段过渡。它是可行的,结果病(即。缺氧),氧化能量代谢是不安和酶的活动减少。类型的我和花絮纤维强烈依赖有氧代谢,而在type-IIX纤维能量转换是主要基于厌氧,糖酵解代谢。因此容易,必经我型纤维的co-expression MyHC-IIA同种型在iia纤维的co-expression MyHC-IIX同种型是一种适应氧化能量代谢受损。或者,它可能减少氧化能力是次要的变化MyHC-isoform内容或一个或多个常见因素同时影响氧化能力和MyHC-isoform内容。
目前的结果表明,低纤维类型我应承担的比例在慢性阻塞性肺病Emph +患者更明显(由HRCT分层)相比Emph−病人。像其他作者发现一个积极的纤维类型之间的关系我在健康受试者比例和年龄28- - - - - -30.。由于相对损失类型的量我纤维这种关系是干扰在COPD患者中,在Emph +完全缺席。考克斯+纤维的比例也低Emph +,但没有统计学意义。之间的正相关关系P啊,一个2和类型的比例我之前纤维已经被报道5,6。此外,一个积极的关系MyHC我应承担的内容,和DL,有限公司,FEV1,已被证明10,11。然而,在目前的研究这些fibre-type比例之间的关系和肺功能数据没有观察,表明纤维类型我应承担的比例与疾病严重程度无关本身。慢性阻塞性肺病患者DL,有限公司在运动中预测可能会冲淡< 55%31日。自DL,有限公司Emph +患者低,它可以推测慢性特别是间歇性缺氧直接或间接参与导致较低的纤维类型我应承担的比例相比Emph−病人。这个问题需要进一步调查。
在这一点上,它不是完全理解哪些因素导致慢性阻塞性肺病肌肉异常。缺氧早已经被讨论了。然而,氧化应激可能也扮演了一定的角色在线粒体酶活性的丧失和类型的相对损失我纤维,因为它已经证明了线粒体蛋白质极易受到氧化损伤32。营养不良的可能的作用是证明了动物研究营养不足引起的抑郁肌肉线粒体能力33- - - - - -35。缺乏身体活动或废弃肢体肌肉潜在贡献者观察fibre-type转变36。然而,作者并没有观察到以前的日常身体活动水平之间的任何差异Emph +和Emph−病人[37],而这些子组之间的纤维类型的差异我应承担的比例已经被发现。此外,没有一个在这个研究是卧床不起的病人,因此不太可能停止使用造成了非常低的纤维类型还是我观察到的比例。
最后,本研究表明增加的参与比例的混合I /花絮和花絮/ IIX纤维类型fibre-type从我转向IIX在慢性阻塞性肺疾病患者的股外侧肌相比,控制。异常纤维类型还是我在肺气肿患者比例加重。此外,纤维的百分比高氧化酶活性也降低了在慢性阻塞性肺疾病患者中,被紧密的联系减少纤维类型我应承担的比例。此外,尽管类似活动花絮fibre-type病人之间的比例和控制,氧化能力降低纤维类型的病人。进一步的研究应确定肌肉变化的潜在因素和机制来评估当前的治疗方法和开发新的方法。
确认
作者要感谢A.F.M.摩尔人提供的抗体MyHC亚型,花絮和花絮+ IIX。
- 收到了2001年6月7日。
- 接受2001年10月30日。
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