摘要gydF4y2Ba
在工业暴露工人中,研究了半自动痰细胞仪(ASC)、常规细胞学和最终诊断之间的相关性。对201名矽肺前铀矿工人、100名石棉肺患者、103名肺癌切除工人和200名对照组(50%吸烟者)的痰标本进行了巴氏染色法和硫代蛋白Feulgen反应染色。使用Cyto-Savant自动化系统进行细胞检测。gydF4y2Ba
404例患者样本中有72例发现不典型核,327例正常,5例不适合ASC分析。13例肿瘤(Pap IV, Pap V)和11例严重异常增生经细胞学检查确诊。20例确诊为肺癌。与肺癌的最终诊断相比,ASC的敏感性为75%(15 / 20),特异性为89.8%(520 / 579)。结果表明,诊断效率为89.3%。ASC与细胞学结合将敏感性提高到80%(20个中有16个),而特异性没有显著损失(89.7%或581个中有523个)。gydF4y2Ba
在对有限数量的职业性氡或石棉暴露患者的调查中,半自动痰细胞术似乎是检测气管支气管黏膜恶性变化的敏感和可靠的方法。与常规细胞学一起,在早期肺癌检测的大规模可行性研究中测试联合方法的有效性是合理的。gydF4y2Ba
半自动化图像细胞术为定量分析脱落气道上皮细胞的核结构和脱氧核糖核酸(DNA)含量提供了一种新的敏感方法gydF4y2Ba1gydF4y2Ba.连同自体荧光支气管镜检查gydF4y2Ba2gydF4y2Ba在美国,这是一项很有前途的新技术,可能有助于早期肺癌的诊断,并重新引起人们对肺癌筛查的兴趣。gydF4y2Ba
毋庸置疑,吸烟对肺癌的影响会因工作场所暴露而成倍增加,尤其是暴露在电离辐射或石棉粉尘下gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba.流行病学研究证实,肺癌在美国铀矿工人中增加gydF4y2Ba4gydF4y2Ba而其他国家由于电离辐照。1995年和1996年,德国登记了761例电离辐射诱发职业性肺病的病例。1994年登记的石棉诱发肿瘤病例有1 200例。与任何癌症一样,通过有效的筛查,职业相关癌症的预后可能会改善,但这在肺癌中已被证明是一个难以实现的目标。多种因素导致了早期肺癌筛查试验的失败gydF4y2Ba5gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba8gydF4y2Ba以今天的标准来看,一个主要因素是过时的技术。自1995年以来,在早期肺癌诊断和治疗研究所(RIDTELC),作者集中参与了许多有前途的方法的开发和改进,以提高早期肺癌的检测,包括痰处理和分析。gydF4y2Ba
自动化痰液处理已成为可能的原型医疗应用机器人自动化组织处理或核分离(MARATHON-S),现在常规用于单层痰液制备,染色用于半自动痰细胞仪(ASC)和常规细胞学(CY)。通过向Saccomanno防腐剂中添加0.1%的二硫苏糖醇(DTT),样品制备得到了改进和标准化gydF4y2Ba9gydF4y2Ba.作为在高危人群中检测早期肺癌的大型筛查项目的前奏,对患有矽肺的铀矿工人和石棉肺患者的诱导痰进行了半自动细胞仪和细胞学检测。此外,已切除且无已知复发的肺癌患者也包括在内。作者探讨了ASC和CY与最终诊断的相关性。gydF4y2Ba
方法gydF4y2Ba
病人gydF4y2Ba
包括三组患者,包括矽肺、石棉肺或肺癌切除术后随访的患者。所有人都在一家专门从事职业性肺病的医院接受定期检查(Berufsgenossenschaftliche Klinik Falkenstein in Thüringen,德国)。痰标本采集于1996年9月至1998年12月,连同100例重度吸烟者和100例肺功能正常、无氡或石棉暴露的非吸烟对照者。患者资料汇总见表1gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba.gydF4y2Ba
痰诱导gydF4y2Ba
在呼吸治疗师的指导下,吸入3%盐水气雾剂诱导痰液,该气雾剂由喷射喷雾器(Pari, Starnberg, Germany)产生,持续20分钟。病人吸入了气雾剂gydF4y2Ba通过gydF4y2Ba用鼻子呼气的口。受试者被指示吞咽唾液,并将痰从更深的气道中咳出,放入一个50毫升的小瓶中,该小瓶中装有25毫升的Saccomanno's防腐剂和0.1%的DTTgydF4y2Ba9gydF4y2Ba,gydF4y2Ba10gydF4y2Ba.样品在同一天贴上标签并寄出,1-3天后送到实验室。gydF4y2Ba
染色gydF4y2Ba
在saccomano - dtt溶液中到达实验室的痰样本完全液化,可以像血液涂片一样由自动处理器(MARATHON-S)进行单层制备。500×离心15 min后gydF4y2BaggydF4y2Ba,倒出上清液。根据重量,将细胞颗粒重悬于0.5-2.5 mL Saccomanno溶液中,以获得恒定的细胞浓度。将细胞悬浮液(约0.2 mL)滴入6个载玻片,像血液样本一样涂抹,仅利用毛细血管力避免核伪影或变形。玻片一夜风干;根据Papanicolaou染色gydF4y2Ba11gydF4y2Ba对于细胞学,根据改良的Feulgen反应,有两个gydF4y2Ba12gydF4y2Ba,其余两张幻灯片留作日后参考。两种ASC涂片在96%乙醇中脱水30分钟,在Böhm-Sprenger溶液中固定45分钟,并用蒸馏水冲洗。嘌呤碱在室温(20°C)下在5 N HCl中水解45分钟即可脱除。载玻片在饱和硫氨酸溶液中染色60分钟,在亚硫酸钠溶液中漂洗。在增加酒精浓度和二甲苯中脱水后,用树脂覆盖标本进行永久安装。gydF4y2Ba
细胞学gydF4y2Ba
在汉诺威和/或波鸿进行CY独立细胞检测。结果根据改良的巴氏(Pap)分类进行分级,评分范围为Pap 0-Pap VgydF4y2Ba13gydF4y2Ba: Pap 0:非代表性物质,Pap I:正常细胞/核结构,Pap II:良性改变(多为轻度、中度或重度炎症征象),Pap III:化生改变,Pap IIID:异型增生(轻度、中度或重度),Pap IV:癌gydF4y2Ba原位gydF4y2Ba, (CIS),巴氏V型:部分/大量恶性细胞,极有可能为癌。在轻度和中度发育不良的情况下,要求第二次痰样本以确认结果。对于严重发育不良或更高级别的情况,立即进行检查(内窥镜检查,胸部x线摄影,gydF4y2Ba等。gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
半自动血细胞计数gydF4y2Ba
定量细胞仪使用自动化图像细胞仪(Cyto-Savant®,Oncometrics, Vancouver, Canada)进行,该仪器是与温哥华不列颠哥伦比亚省癌症机构合作开发的gydF4y2Ba14gydF4y2Ba.该技术遵循了诊断病理学定量方法标准化工作组(ESACP)的建议。gydF4y2Ba15gydF4y2Ba.一种专门设计用于肺脱落细胞的可训练的二元分类器gydF4y2Ba1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba16gydF4y2Ba是为细胞仪开发的。使用140万像素的高分辨率CCD数码相机以及20× Plan-Apo显微镜物镜(尼康,东京,日本),产生0.34 μ m的分辨率。除了DNA光度测定外,还计算了>110核特征,定量每个核的染色质分布形态gydF4y2Ba16gydF4y2Ba.gydF4y2Ba
自动模式允许在预设的时间(30分钟)或有限数量的核内,每天在无人值守的情况下筛选≤50张幻灯片。在目前的版本中,细胞仪在30分钟内识别和分析多达50,000个物体。作者从每个标本中收集并保存≤2000个细胞(1000个上皮细胞,200个DNA指数为>1.25的可疑细胞核(正常上皮细胞DNA-数量设置为1.0等于正常二倍体DNA含量(2c))和<2.5和≤100个高度可疑细胞核,DNA指数为>2.5)。除上皮细胞外,还收集≤200个淋巴细胞、多形核和嗜酸性粒细胞以及100个肺泡巨噬细胞。上皮细胞综合光密度标准值为110。使用20倍放大和1.4×10的矩阵gydF4y2Ba6gydF4y2Ba像素(屏幕分辨率1,246×1,026点)导致像素大小为0.34 μ m。一个典型的10-12微米直径的上皮核包含近1000个像素。原子核的大小是由像素的总数决定的。白色和黑色之间的灰度值被分为256个灰度级。细胞核中所有像素灰度的总和表示DNA的数量。gydF4y2Ba
对于2000个细胞中的每一个,所有特征的数字值都被计算和存储。存储所有细胞的坐标;可疑的核可以交互式地重访。从一组具有代表性的淋巴细胞中获得的正常上皮细胞核的dna量,称为2c值或整倍体值,为2c±0.25c,对应的方差系数为12.5%。根据上皮细胞核的DNA值计算三个参数:超过5c的细胞核率(%)(5cER), 2c偏离指数(2cDI)和恶性程度(MG)作为对数转换的2cDIgydF4y2Ba15gydF4y2Ba.2cDI表示单个细胞核的dna数量与收集到的所有上皮细胞核的平均值之间的差异的平方和,除以收集到的细胞核数量。2cDI和5cER与恶性程度密切相关。5cER是dna含量为>5c的非整倍体核的比率(%)。它们不同于正常分裂的有丝分裂核。如果细胞核的dna数量在2c±0.25c范围内,则称为整倍体。2cDI定义为所有上皮细胞dna量(cgydF4y2Ba我gydF4y2Ba)由平均值(2c)除以单元格数目。这个值相当于二倍体均值的方差的均方gydF4y2Ba17gydF4y2Ba.即使DNA含量的量化不显著,细胞画廊的光学异常细胞核也被记录下来。gydF4y2Ba
该程序允许在简单评分的帮助下对整个恶性肿瘤频谱进行量化。遵循ESACP的建议gydF4y2Ba15gydF4y2Ba在定量细胞术中,作者使用了0、I、II和III类(表2gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba).gydF4y2Ba
统计数据gydF4y2Ba
作为“金标准”的最终诊断,对细胞检测的敏感性和特异性进行了测试。gydF4y2Ba18gydF4y2Ba.同样,将细胞学结果与最终诊断对照。95%范围的置信区间(CI)取自Geigy科学表gydF4y2Ba19gydF4y2Ba.gydF4y2Ba
结果gydF4y2Ba
对照组gydF4y2Ba
每个对照受试者的两张切片ASC除两例外均为良性或I级。正常切片含有炎症细胞、上皮细胞和肺泡巨噬细胞(图1)gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba).所有上皮核均在0.75-1.25范围内,只有单个核偏离正态分布,主要为DNA指数接近2.0的第二个小峰。除2例吸烟者外,其余均为良性(I级)。有可疑样本的两名受试者重复ASC均为良性结果。gydF4y2Ba
对对照受试者的所有样本进行定量评价,2cDI平均值为0.122±0.022,MG为0.080±0.014。比较健康受试者的姐妹切片,2cDI值的平均差异为0.015±0.009个单位(中位数为0.014),导致相同的I级分类。gydF4y2Ba
矽肺、石棉肺和/或肺癌切除术患者gydF4y2Ba
图2gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba显示一名患有矽肺的前铀矿矿工的痰样本中有可疑的ASC报告,CY证实为Pap IIID,中度。除了DNA-量与面积的正常相关性外,在1.25-2.5的DNA指数范围内存在一些“可疑”核,导致2cDI增加0.26,MG增加0.18。gydF4y2Ba
在一个典型的痰样本中,从矽肺患者和鳞状上皮肺癌确诊为最终诊断(图3gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba),除了dna指数1.25-2.5范围内的可疑细胞核外,还发现了大量超过5c的细胞核(5cER 3.7%)。2cDI升高至0.46,MG升高至0.21。gydF4y2Ba
半自动痰细胞仪结果与常规细胞学结果的相关性gydF4y2Ba
来自无症状的非吸烟者和重度吸烟者的细胞学调查痰样本被分为正常(Pap I),轻度、中度或重度炎症(Pap II),极少数病例为炎症伴细胞化生(Pap III)。胸片或最终诊断均未发现瘤变证据。gydF4y2Ba
在404例职业暴露患者中,最终诊断出肺癌或其他癌症转移的患者有20例。在384例未患癌症的患者中,有323例被ASC分为I级,55例为可疑(II级),2例为高度可疑(III级),4例为不充分(表3)gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba).在323例ASC正常标本中,15例细胞学检查不充分,仅1例为正常(Pap I),绝大多数(299例)为轻度、中度或重度炎症(Pap II)。7例标本含有不同程度的发育不良细胞核(Pap IIID), 1例为CIS细胞核(Pap IV)。gydF4y2Ba
在57例ASC无II级和III级肺癌的患者中,1例细胞学不充分,2例Pap I, 21例Pap II,另有10例化生。不典型增生18例,瘤变5例。因此,在57例最终诊断为非癌症的asc阳性患者中,共有13例被细胞学认为是病理的。在矽肺或石棉肺患者中,使用ASC发现了45个可疑/高度可疑样本。其中20例被细胞学分类为发育不良、CIS或浸润性肿瘤(Pap IIID-V)。疑似肺癌病例最终确诊。在既往切除肺癌患者的样本中,12例ASC结果可疑,5例CY阳性,最终诊断均为肺癌。总的来说,在20例最终诊断为肺癌的患者中,有15例被ASC识别。579份样品中有59份ASC检测结果为假阳性。gydF4y2Ba
最终诊断为肺癌的患者有20例。6例为石棉肺,14例为矽肺,8例既往有肺癌切除术。14种癌症被组织学分类为鳞状细胞肺癌(SQuCLC), 3种为非小细胞肺癌(NSCLC), 2种为腺癌,1种为晚期胸膜间皮瘤(表4)gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba).gydF4y2Ba
半自动痰细胞仪的敏感性和特异性gydF4y2Ba
与基于404名患者、100名吸烟者和100名对照组的所有数据的最终诊断相比,ASC的敏感性为75.0% (15 / 20),95% CI为50.9-90.3%(表5)gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba).特异性为89.5% (520 / 579),95% CI为78.3-96.1%。ASC的诊断效率为89.3%。gydF4y2Ba
细胞学敏感性为60% (12 / 20),95% CI为36.1 ~ 80.9%;特异性高达97.3% (558 / 545),95% CI为90.6 ~ 99.9%。gydF4y2Ba
结合ASC和细胞学检查,I组多检测出1例肺癌(矽肺),III组多检测出1例假阳性(切除肺癌)。因此,ASC和细胞学联合诊断的敏感性更高,为80%(20例中有16例),特异性相似,为89.6%(581例中有521例),诊断效率为89.7%。gydF4y2Ba
讨论gydF4y2Ba
定量半自动化图像细胞术诱导痰,从氡暴露的前铀矿工人矽肺和石棉肺,被证明是敏感和可靠的筛查肺癌。与最终诊断相比,发现ASC的敏感性为75%(15 / 20),高于细胞学的敏感性(60%或12 / 20)。asc特异性(89.8%)低于细胞学特异性(97.3%)。ASC和细胞学结合导致敏感性增加(80%或16 / 20),特异性损失不显著(89.7%)。所获得的结果表明ASC的诊断效率为89.3%,这表明ASC将是高危人群肺癌筛查计划的有效工具。404例患者中,ASC检出疑似恶性肿瘤72例,Pap V检出13例,细胞学检出严重异常增生11例。在最终的诊断中,报告了20个肿瘤,其中15个是由ASC检测到的。在对照组中,两名吸烟者的姐妹切片中只有一人最初被ASC怀疑,但在重复ASC时被发现是正常的。gydF4y2Ba
目前,利用基因和其他标志物对早期肺癌的痰样本、支气管洗液和刷子进行了大量研究gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba21gydF4y2Ba.使用微卫星标记,在35%(43例中有15例)肺癌患者中检测到支气管灌洗细胞的遗传改变,但在23%(43例中有11例)无肿瘤证据的患者中也检测到gydF4y2Ba22gydF4y2Ba.在肺癌患者的支气管扫描中,79%的患者至少有一个染色体位点杂合度缺失,而只有59%的患者细胞学呈阳性gydF4y2Ba21gydF4y2Ba.在肺癌患者的肿瘤、正常支气管黏膜和细胞学标本中,有49%(51例中有25例)发现微卫星改变gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba.在肺癌中已经发现了许多突变,例如肿瘤抑制基因的等位基因缺失或p53改变的存在,而不仅仅是在肺癌中gydF4y2Ba23gydF4y2Ba.其他方法包括特异性单克隆抗体识别痰细胞上的人肺癌抗原gydF4y2Ba24gydF4y2Ba.这些正在进行的研究尚处于实验阶段,仍需临床验证。gydF4y2Ba
除少数例外,雾化吸入3%生理盐水诱导痰可动员足够的下气道诊断细胞。604个样本中只有5个样本含有足够的ASC材料,26个样本含有大量的颊部细胞,但肺泡巨噬细胞和柱状细胞太少。即使在健康、非慢性阻塞性肺疾病人群中,80%的受试者接受盐水诱导也有足够的结果gydF4y2Ba25gydF4y2Ba.与自然痰相比,3%生理盐水诱导能调动足量的下气道痰液gydF4y2Ba10gydF4y2Ba并应优先于自发痰样本。gydF4y2Ba
0.1% DTT处理导致痰标本完全液化gydF4y2Ba9gydF4y2Ba,gydF4y2Ba10gydF4y2Ba.通过邮件发送到作者实验室的样品可以直接用MARATHON-S或手动处理。在任何一种模式下,颗粒根据大小在Saccomanno固定液中重悬,并涂抹在类似于血液涂片的玻片上,没有剪切力改变细胞完整性。这一过程将使所有载玻片上的诊断细胞分布均匀,这是传统的“挑选涂抹法”甚至Saccomanno所使用的“混合法”所无法获得的gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba26gydF4y2Ba.这种高度自动化的程序可能导致样本数量较少;在细胞过少或过多的极端情况下,手工处理更可取。gydF4y2Ba
一项研究回顾了60项具有代表性的研究,以评估痰细胞学的敏感性gydF4y2Ba27gydF4y2Ba平均灵敏度为64.5%,范围为22.0 ~ 98.1%。审稿人自己的结果显示痰细胞学的敏感性为40.3%gydF4y2Ba27gydF4y2Ba这与文献中的早期报道相当gydF4y2Ba5gydF4y2Ba,但不像Böcking报道的痰细胞学敏感性异常高gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba28gydF4y2Ba他对三个不同的样本使用了细胞学、定量细胞术和免疫组化(石蜡包痰)的组合。gydF4y2Ba
与早期用于诊断支气管肺肿瘤的痰样本、支气管洗液或刷活检的细胞学评估研究相比,目前使用自动化细胞仪的结果具有更高的敏感性gydF4y2Ba1gydF4y2Ba.•德•加西亚gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba29gydF4y2Ba发现支气管冲洗与支气管肺泡灌洗和支气管镜后痰液联合使用的敏感性为33%,敏感性为56%。PirozynskigydF4y2Ba30.gydF4y2Ba在一项比较研究中报告的敏感性为64%。几位作者描述了依赖细胞学调查的痰和支气管冲洗对肿瘤位置和大小的敏感性gydF4y2Ba27gydF4y2Ba,gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba.对142例疑似支气管肺肿瘤患者的内镜检查结果进行平行调查,发现以下生长模式:22%主要是粘膜下肿瘤生长,44%是可见范围内的外生性肿瘤,11%的周围病变在支气管镜下不可见gydF4y2Ba1gydF4y2Ba.在目前对支气管洗液的研究中,发现支气管镜下可见肿瘤的阳性识别率较高(粘膜下肿瘤为84%,外生肿瘤为90%)。在没有可见的内镜变化的情况下,ASC可以在56%的周围病变病例中识别出可疑的核gydF4y2Ba1gydF4y2Ba.gydF4y2Ba
可以推测,一定比例的ASC和细胞学“假阳性”结果代表了目前方法无法检测到的早期癌遗传变化。一些asc阳性结果对应于不同程度的细胞学分类异常增生(轻度、中度或重度),甚至上皮化生,这些被认为在很大程度上是可逆的。随着时间的推移,有可能识别这些潜在的癌前病变,可能会获得更多关于癌变的自然史的知识。核结构的炎症性改变也可能导致误读。必须测试改变的决策阈值,以及对未确诊肿瘤但有可疑细胞计数/细胞学结果的患者进行仔细随访。gydF4y2Ba
ASC分类的解释(在目前的版本中)并不仅仅依赖于2cDI和MG,但在较小程度上,它还依赖于形态学,来自细胞仪显示的异常核库的不可量化印象。接受者操作曲线(ROC)不能代表这种方法的真正潜力。近20%的ASC可疑病例含有细胞核,或多或少可疑为发育不良或恶性,无2cDI >0.20。ASC最重要的进一步发展之一将是一个样本分类器,根据区分正常和病理核的几个核特征,对正常和异常样本给出一个综合评分。变异面积、变异强度、分形面积、变异半径或长45程等特征可表征病理转化核gydF4y2Ba16gydF4y2Ba.它们可以集成到痰样本分类器中,然后就可以绘制roc。未来ASC的发展可能会允许组织学上不同的肿瘤类型(SCLC, SQuCLC,腺癌,异质性分化肿瘤或非原发性肺癌的转移)的识别。gydF4y2Ba
在细胞学发现Pap IIID严重或更高的患者中,开始调查;对于IIID轻度和中度发育不良的病例,要求第二次痰样本。对ASC分类为可疑或高度可疑而没有病理细胞学证据的痰液应立即重复分析。gydF4y2Ba
如果样本被ASC持续分类为可疑或高度可疑,并被细胞学证实为严重发育不良或更高,应建议受试者进行内窥镜和放射检查。在未发现肿瘤或瘤前病变的情况下,应每6个月重复一次痰检查,直到自发缓解或发生肿瘤变化。在痰样本中发现的严重发育不良的随访显示,在一个系列中46%的病例为恶性肿瘤gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba.SaccomannogydF4y2Baet al。gydF4y2Ba25gydF4y2Ba该研究对患有肺癌的铀矿工人的痰进行了随访,随访超过10年,在最初的调查中,60%的病例发现了与严重发育不良一致的异型性,其中83%的病例在一段时间内发现了鳞状细胞癌。gydF4y2Ba
总之,基于目前有限的发现,半自动痰细胞术似乎是一种敏感的非侵入性方法,用于检测呼吸道的恶性变化,可能是癌前病变。与其他方法相比,该方法提供了自动化、无人参与和标准化的细胞收集,并支持对结果的交互式解释。持续出现可疑半自动化痰细胞检测结果的患者应接受进一步诊断检查,至少包括常规细胞学检查。随着标准化的痰液处理和节省时间的自动化,半自动痰细胞仪结合其他诊断测试可能在不久的将来有用,用于筛查高危患者群体,如职业暴露工人或重度吸烟者。它已经是早期肺癌诊断与治疗前瞻性研究所大规模高危患者早期肺癌检测可行性研究的重要组成部分。gydF4y2Ba
致谢gydF4y2Ba
作者希望向不列颠哥伦比亚省癌症机构的B. Palcic表示感谢,感谢他在开发Cyto-Savant方面的开创性工作,以及他在波鸿市RIDTELC单位建立该系统的支持。gydF4y2Ba
- 收到了gydF4y2Ba2000年3月10日。gydF4y2Ba
- 接受gydF4y2Ba2001年7月5日。gydF4y2Ba
- ©ERS期刊有限公司gydF4y2Ba
参考文献gydF4y2Ba
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