文摘
基质金属蛋白酶(MMPs)降解细胞外基质成分的intersititium并可能发挥作用在肺泡通透性异常,这是特发性肺纤维化(IPF)的一个特性。本研究的目的是评价MMP IPF患者蛋白质含量并确定任何渗透率的关系处理和标记。
总共20 IPF患者和8个正常对照组进行支气管肺泡灌洗。MMP组织金属蛋白酶抑制剂,和血管内皮生长因子(VEGF)水平与临床结果和蛋白质渗透率指数。
MMP-3、7、8和9是仍然在IPF灌洗液和水平升高治疗。MMP-3水平,7、8和9 VEGF和蛋白质渗透率指数高于那些早期随访期间死亡。VEGF和MMP-8 9水平高于那些肺功能迅速下降。1年以上MMP-3水平、7、8和9与渗透率增加索引。
基质金属蛋白酶水平升高在特发性肺纤维化患者和没有调制目前的标准治疗。基质金属蛋白酶生产通过与已知血管permogen交互,血管内皮生长因子,可能与异常有关,可能会使毛细血管通透性neo-angiogenesis特发性肺纤维化。变化最大的那些随访期间死亡或进展,表明药物针对血管内皮生长因子、基质金属蛋白酶活性在小说的评估治疗特发性肺纤维化。
特发性肺纤维化(IPF)是一种进行性肺病的原因不明1。目前的理论推测,IPF的结果异常伤口愈合反应多个微观站点的肺泡上皮细胞(AEC)损伤和激活。微观损伤与纤维母细胞的形成/ myofibroblast疫源地,上皮细胞辍学和纤维化的发展。肺泡上皮细胞的破坏,改变了原子能委员会表型,原子能委员会上皮修复的损失和失败都是IPF的特色2。
除了myofibroblast疫源地形成和上皮细胞损伤,炎症有变量的证据就是明证增加巨噬细胞和中性粒细胞计数3,intra-alveolar coagulapathy4和新血管的形成IPF肺。异常的血管生成进一步与肺纤维化疾病的发展5。在一起,这些变化导致增加肺泡毛细血管的渗透性屏障,可以检测到临床二乙三胺五醋酸增加间隙6。
目前,异常血管生成的分子因素和增加渗透率研究有些冲突尚不清楚。一些研究表明,pro-angiogenic ELR +细胞因子,如interleukin-8或诱导protein-10,促进neo-angiogenesis7。等研究表明,抗血管生成肽色素epithelium-derived因子升高,而pro-angiogenic肽如血管内皮生长因子(VEGF)可能会减少5。,使局势更加复杂的是,似乎这些肽在肺活检可能是异构的表达;例如,成纤维细胞的疫源地内VEGF表达可能会减少5。
新血管的形成需要协调监管的矩阵蛋白水解作用和内皮细胞迁移。基质金属蛋白酶(MMPs)是至关重要的细胞外基质(ECM)改造、伤口愈合和血管生成,与IPF的发病机制8。几项研究已经证明了的金属蛋白酶- 1水平升高,8和9,这发生在与改变水平的可溶性抑制剂,的金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP) 1和2,在IPF。MMP-7表达式是提升人类IPF和纤维化小鼠模型,同时MMP-7基因敲除小鼠有减毒纤维化反应9,10。
一起,基质金属蛋白酶降解的胶原含量的能力intersititium因此可能发挥作用在肺泡通透性异常。VEGF的事实,这是一个已知的有效的诱导物的毛细血管通透性11,在一定程度上通过行动在MMP的生产进一步支持角色MMP的表达在IPF的异常血管渗透性12,13。
本研究的目的是系统地评价MMP与TIMP的水平蛋白质IPF患者,并确定MMP的水平与细胞炎症的关系,支气管肺泡灌洗液(BALF)蛋白通透性指数和VEGF水平。此外,本研究还评估了MMP的水平是否受到标准治疗和与生存或IPF患者肺功能下降。
方法
主题
总共20 IPF患者诊断根据目前美国胸科学会(ATS)标准是从专家间质性肺病诊所招募大学医院伯明翰(英国伯明翰)。支持开放肺活检在诊断5例,组织学肺移植后在一个案例中,高分辨率计算机断层扫描在所有情况下的证据。执行开放肺活检,组织从至少两个站点,获得相同的上、下叶肺。基线进行支气管镜检查在调查阶段推荐后,开始前明确的治疗。八个健康个体自由从呼吸道疾病被招募为正常对照组。这项研究是由当地伦理委员会批准和参与者给书面知情同意。
测量
患者进行支气管镜检查和支气管肺泡灌洗(BAL)如前所述14。TIMP-1 TIMP-2和VEGF BALF中测量使用ELISA试剂盒(研发系统,阿宾顿,英国)。BALF金属蛋白酶- 1、2、3、7、8、9、-12年和-13年测量使用Luminex数组(研发系统)。Luminex数组值正常MMP的水平已经包含在一个尚未出版研究急性呼吸窘迫综合征(ARDS);个人沟通c•欧凯恩称)。IPF MMP-3水平在进一步引用未公开发表的研究涉及血管内皮抑制素劈理(A.G.级、个人通信)。蛋白质测定使用Bio-Rad直流试验装备二世(英国)赫默尔亨普斯特德镇Bio-Rad实验室。蛋白质渗透率指数(PPI)的比例计算BALF血浆蛋白,如前所述15。
明胶zymography
明胶zymography如前所述16。总之,BALF稀释1/10,20-μL整除与5μL混合加载缓冲区(0.25米三pH值6.8、50%甘油、5% SDS,溴酚蓝)和运行在11%丙烯酰胺凝胶浸满0.1%明胶在180 V 3.5 h(缓冲25毫米三、190毫米甘氨酸0.1% SDS)。孵化后2.5% Triton X 1 h与搅拌和两个短暂洗胶原酶缓冲(55毫米三基地,200毫米氯化钠,5毫米氯化钙、0.02%玻雷吉,pH值7.6),凝胶孵化16 h在新鲜胶原酶缓冲37°C。Gelatinolytic活动检测到单个步骤染色/ de-stain方法使用1/3/6 Coomasie蓝色0.02%醋酸/甲醇/水。所有实验样本并行运行2 ng重组MMP-9(致癌基因,剑桥,英国)凝胶之间的标准化。
MMP-9活动分析
BALF稀释1/25或1/50,分析使用MMP-9 fluorokine活动试验(研发系统)根据制造商的指示。标准曲线的纯化MMP-9运行在同一板块(pro-forms MMP-9标准被激活4-aminophenylmercuric醋酸(APMA) 2 h添加前fluorogenic衬底)允许量化。的最小检测浓度MMP-9使用这个分析报告为5 pg·毫升−1(制造商的数据)。这个试验的影响考虑TIMPs在示例,给出了衡量净MMP-9活动。
肺功能测试
用力肺活量(FVC)测量使用Jaeger紧凑系统(英国贝辛斯托克Viasys医保)。肺总一氧化碳扩散能力(TL,有限公司)用一次呼吸测量技术(Jaeger紧凑的系统)。结果表示为%的预测值。在可能的情况下,连续的肺功能得到了3月的临床随访。降低肺功能迅速下降被定义为一个一致的(> 10%)在FVC,肺活量TL,有限公司演讲后1年1。
统计数据
IPF BALF蛋白质数据非参数,因此作为中位数(四分位范围(差))。群体间的比较进行了使用Mann-Whitney紫外线测试。假定值≤0.05的所有数据被认为是显著的。使用皮尔逊相关性进行了非参数的对数变换后的测试数据。本研究认为存活率存在并没有进行动力计算。
结果
人口统计资料
总共20 IPF患者和8名健康对照组被招募。总结患者的特点如表1所示⇓。八个病人同意连续落下帷幕后3 - 6个月开始用强的松治疗0.5毫克公斤−1和咪唑硫嘌呤·1 - 1.5毫克公斤−1有或没有N乙酰半胱氨酸600毫克每日三次。患者必须远离肺部感染的临床建议在支气管镜检查前4周。
的20个IPF患者参加本研究,随访12人死亡3年期间。死因是肺功能恶化导致呼吸衰竭(n = 5),肺癌(n = 3),肺感染(n = 2),肺动脉栓子(n = 1)和心肌梗死(n = 1)。一个病人在随访期间接受肺移植。到死亡的平均时间为18个月的时候第一次支气管镜检查。
高架BALF IPF患者巨噬细胞和中性粒细胞计数
IPF BALF细胞计数(平均1260000个细胞·毫升−1(差560000 - 3220000细胞·毫升−1)与正常相比显著增加BALF细胞计数(412000·毫升细胞−1(253000 - 470000细胞·毫升−1);p = 0.0034)。显著提高肺泡巨噬细胞(AM)总数是指出(IPF: 1030000 AMs·毫升−1BALF(446000 - 2740000年AMs·毫升−1BALF);正常:391000 AMs·毫升−1(245000 - 450000年AMs·毫升−1);p = 0.0051)。BALF %巨噬细胞数减少(IPF: %是88.3 (73.2 - -94.1);正常落下帷幕:% 96 (95.5 - -97.7);p = 0.031)。
有提高IPF BALF和%嗜中性粒细胞总数与正常相比BALF计数。IPF嗜中性粒细胞总数是120000细胞·毫升−1(56500 - 279000细胞·毫升−1)和正常细胞中性粒细胞总数是400毫升−1(52.5 -956个细胞·毫升−1);p = 0.0373。IPF BALF %中性粒细胞计数为11.7%(5.9 -26.8%)和正常为2% (0.75 - -2.75%);p = 0.016。有%的增加中性粒细胞(但不是总中性粒细胞和巨噬细胞)在病人死在后续阶段(那些死亡:25.0%中性粒细胞(中性粒细胞13 - 62%);中性粒细胞在幸存者:7.9%;p = 0.05),最近被报道3。没有显著差异BALF淋巴细胞和嗜酸性粒细胞计数之间的正常和IPF BALF的队列研究。
BALF MMP的水平升高在那些迅速发展的肺功能报告后1年
BALF的MMP - 3、7、8和9是升高患者肺功能迅速下降(n = 8)与non-rapid进展情况(n = 12)。然而,只有MMP-8和9之间的差异显著(表3所示⇓)。没有重要关系的IPF BALF金属蛋白酶- 1,2,8,-12年或-13年FVC、TL,有限公司或肺的转移系数一氧化碳。BALF MMP-7弱相关TL,有限公司(r = 0.28, p = 0.008)和MMP-3与FVC (r = 0.20, p = 0.048)。
MMP的水平升高在随访期间去世
现在的患者死亡率的40% 3年的随访。BALF MMP-3, 8和9高架在那些随后死亡在后续阶段(表4所示⇓)。MMP的水平在死者没有预测死亡时间。
高架BALF TIMP-1 IPF患者和2
TIMP-1和2相比,顺序BALF中水平提高到正常水平。平均正常BALF TIMP-1是505 pg·毫升−1(差290 - 1062 pg·毫升−1)与7343 pg·毫升−1(1830 - 18668 pg·毫升−1)IPF BALF TIMP-1 (p = 0.0044)。BALF TIMP-1仍然升高IPF患者治疗(n = 8;9725 pg·毫升−1(2500 - 20230 pg·毫升−1);p = 0.0022),而正常(图。2⇓)。
最初的IPF BALF TIMP-2水平(898 pg·毫升−1(460 - 1836 pg·毫升−1);p = 0.0046)和IPF重复BALF TIMP-2水平(1623 pg·毫升−1(606 - 2296 pg·毫升−1);相比,p = 0.0022)升高到正常(276 pg·毫升−1(43 - 764 pg·毫升−1);图2 b⇑)。没有TIMP-1或2之间的关系和静态肺功能诊断水平。BALF TIMP-1和2水平升高在那些死于后续幸存者相比(表4所示⇑)。
MMP的摩尔比率:IPF的TIMP发生改变
计算MMP / TIMP-1摩尔比率表明,没有金属蛋白酶- 1和2的区别,正常。MMP-3摩尔比率显著降低(IPF 0.00304与正常的0.02;p = 0.0066)。相比之下,MMP-7摩尔比率增加(IPF 0.89与正常的0.25;p = 0.0374), MMP-8 (IPF 0.417与正常的0.092;p = 0.0078)和MMP-9 (IPF 0.973与正常的0.171;p = 0.018)。MMP / TIMP-2比率不高而正常的金属蛋白酶- 1、2和3,但是MMP-7明显升高,8和9(数据没有显示)。
为了证实蛋白质含量反映活动,BALF MMP-9 MMP的活动进行了分析。MMP-9被选中,因为它是最好的验证分析MMP的活动。
高架IPF患者MMP的活动
使用zymography MMP-9 19中发现了20 IPF患者和正常对照组患者之一。代表凝胶图3所示⇓。荧光的MMP-9活动是23791 pg·毫升−1(5145 - 62787 pg·毫升−1在IPF BALF相比低于检出限在七,八(平均分配值125 pg·毫升样品−1;p = 0.000)。添加APMA增加的活动MMP-9 IPF BALF中pg·23791毫升−152529 pg·毫升−1(11728 - 134631 pg·毫升−1;p = 0.14;图4⇓)。
BALF IPF的VEGF水平
IPF患者VEGF水平没有显著不同IPF患者比正常(82 pg·毫升−1(25 - 222 pg·毫升−1)与140 pg·毫升−1;p = 0.499;图5⇓)。VEGF水平没有与基线肺功能。最初的IPF BALF的VEGF水平与蛋白通透性指数显著相关(r = 0.51, p = 0.026)和BALF MMP-3 (r = 0.53, p = 0.003), MMP-7 (r = 0.36, p = 0.02), MMP-8 (r = 0.38, p = 0.018)和MMP-9 (r = 0.34, p = 0.029;数据未显示)。
基线BALF VEGF水平升高患者肺功能迅速下降在第一年的随访(188 pg·毫升−1(56 - 301.7 pg·毫升−1)相比,IPF non-progressors (38.4 pg·毫升−1(16.8 - -152.1 pg·毫升−1);p = 0.04;图5 b⇑)。基线BALF VEGF水平也升高患者死亡(159 pg·毫升−1(62 - 272 pg·毫升−1),而那些幸存下来(34 pg·毫升−1(13.9 pg·-70毫升−1);p = 0.03;图5度⇑)。
讨论
基质金属蛋白酶的降解结缔组织矩阵的各种组件被认为扮演了一个重要的角色在改造后实质损害,导致组织破坏或修复过程诱导的肺疾病17。在目前的研究中,已经证明了主要提高IPF BALF中基质金属蛋白酶7、8和9。MMP-7水平以前是调节在微阵列研究和IPF患者洗胃的研究之一9,18。另一项研究证明了高架MMP-8和neutrophil-derived MMP-9 BALF中8。日本须贺的进一步研究et al。19确认在IPF MMP-9活动增加,特别是在那些迅速发展。类似于目前的发现,先前的研究并没有显示出高度的金属蛋白酶- 1,但没有确认目前作者的发现TIMP-1含量的增加8。
在以前的动物研究,它已经表明,MMP-12肺纤维化的发展中扮演了重要的角色20.。很难调和这些发现与低/中检测不到MMP-12本研究。重要的是要认识到,组织水平的MMP-12不一定反映BALF水平由于当地复杂的调节基质金属蛋白酶抑制剂;显然,在人类疾病的进一步的研究来阐明MMP-12人类肺纤维化的作用。
MMP的活动的监管TIMPs活动的一部分。因此,简单的BALF MMP的免疫反应性并不一定反映生物活性。试图解决这个问题,目前的作者分析了TIMP-1的蛋白质含量和2以及MMP-9净BALF活动。净MMP / TIMP摩尔比率升高在IPF与正常控制个人MMP-7相比,8和9。活动分析确认活动的增加MMP-9灌洗液,zymography发现证实。这将表明,升高MMP-9 IPF患者的肺内生物活性。
在目前的研究中,作者试图评估MMP的表达之间的关系和PPI (BAL /血浆蛋白的比例)。PPI已被广泛用于评估患者的上皮屏障功能的完整性ARDS15,在哮喘患者气道渗透率指数21。目前作者的知识,没有先前的研究评估其效用IPF患者。目前作者已经证明了指数与正常相比,增加与VEGF和MMP的水平,是提升与IPF的人早死。事实上,血浆蛋白和BALF蛋白质与结果关系支持的有效性指数IPF的设置。
在IPF,它已经认识到,肺泡壁的结构完整性取决于基底膜和牙龈基底膜的破坏可能会先于肺泡纤维化的发展。不连续的基底膜允许更大的访问为渗出性肺泡空间因素和间质细胞,可能进一步促进组织破坏和进步的纤维化。在目前的研究中,发现MMP的水平之间的关系和PPI MMP-3支持作用,7、8和9直接在IPF肺泡的渗透屏障。VEGF和PPI和基质金属蛋白酶之间的相关性支持VEGF的作用在这个异常的渗透率。VEGF是促进neo-angiogenesis和增加血管通透性,促进上皮细胞增殖和修复11,22,23。此外,基质金属蛋白酶可以激活矩阵结合生长因子VEGF等潜在的提高生物利用度。显然,高浓度的PPI的发现,MMP-3, 7和9和VEGF在患者早期死亡或进展表明,这些变化的临床意义。
目前治疗IPF仍不满意,没有证据表明通常的间质性肺炎(摘要)模式在肺活组织检查和治疗难度。然而,最近的一次试验表明,用强的松治疗用药N乙酰半胱氨酸缓慢发展24。目前的数据清楚地表明,患者同意重复的子群落下帷幕后3 - 6个月这样的组合药物疗法,这种疗法没有任何抑制活动在BALF MMP的免疫反应性。这尽管是一个先前的研究表明,类固醇治疗减少MMP-9生产从IPF患者类固醇和咪唑硫嘌呤25;然而,在这个研究中,患者没有单独研究连续预处理和后处理。
目前的研究也有一些局限性。首先,病人没有接受肺活检证明摘要,尽管他们的特征根据国际准则专家诊所。此外,年龄的不同IPF患者和健康对照组之间可能是一个混杂因素相比MMP的水平。为了解决这个问题,年龄和IPF的MMP的水平之间的关系和正常控制检查,不存在相关性。最后,重要的是要理解,BALF MMP的水平不一定反映活动内的间质,但目前的结果做确认从先前的研究结果。BAL只有样品肺的肺泡分量对疾病的反应,很可能改变生产的其它抽样胶原酶在网站不是BAL也可以导致胶原重塑的起始这种疾病。
总之,本研究系统地评估一系列基质金属蛋白酶在肺疾病被认为是重要的,在特发性肺纤维化患者治疗前后。基质金属蛋白酶活性提高,似乎并未受到治疗。基质金属蛋白酶与增加蛋白质水平渗透率指数和已知的血管permogen,血管内皮生长因子,表明基质金属蛋白酶参与生产异常的毛细血管通透性和潜在neo-angiogenesis特发性肺纤维化。事实上,这些变化在那些伟大的死亡或进展在后续阶段显示显著的临床重要性。总之,建议针对基质金属蛋白酶活性药物目前在发展为慢性阻塞性肺疾病证评估新的治疗特发性肺纤维化。
支持声明
湄Thickett和A.G.里克特威康信托基金会资助的。c O 'Kane是国立卫生研究所临床科学家。
感兴趣的语句
一份声明中对湄Thickett可以发现www.www.qdcxjkg.com/misc/statements.shtml
- 收到了2008年4月21日。
- 接受2008年9月15日。
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