文摘
CF可以使用特定的肠道瀑样。雌性生殖道蛋白质功能在肠道瀑样与临床疾病严重程度和药物测试瀑样可以帮助找到药物的人罕见的雌性生殖道突变。https://bit.ly/2GryRl0
介绍
成年干细胞生物学的最新进展已经导致瀑样文化技术的发展运用多种组织来源如肠、肺和肾脏(1]。瀑样是三维的,多细胞结构,概括的组织特性的器官,通常从供体组织碎片(1]。瀑样功能的表达个人基因组,这些文化尤其有用了解遗传因素导致个体疾病。这样,他们是用于研究遗传疾病,如囊性纤维化(CF),和更常见的疾病,如癌症,基因可以影响疾病严重程度和药物疗效[2,3]。
肠道瀑样已经在这些发展的前沿,在文化方法最初是为这个组织源开发(4]。CF,人类肠道瀑样可以从肠道隐窝片段分离直肠活检。采取直肠活检通常是一种无害的程序,可以在所有年龄组(包括新生儿)不需要麻醉[5,6]。肠道瀑样可以生成高个人成功率,促进组织的使用可以扩展,存储在液态氮,可以解冻,不断培养> 6个月,同时保留个人功能表型(7]。虽然许多全世界的实验室都采用瀑样培养(8),很少有实验室经验使用肠道瀑样研究CF。在这里,我们专注于应用程序的肠道瀑样CF和强调重要的未来的发展方向,可以帮助开发所有CF患者有效的治疗方法。
它是如何工作的呢?
囊性纤维化跨膜电导调节的遗传变异性(雌性生殖道CFTR基因可以导致错误折叠和故障检测的蛋白质。随后这就是说上皮离子和流体运输,导致CF疾病表现。雌性生殖道中起主导作用快速液体分泌反应所引起的大肠循环(c) AMP诱导刺激,和它的激活可导致分泌性腹泻。氯的主要驱动力是这种快速液体分泌反应(9,10]。
雌性生殖道的顶端膜上表达的内部腔行直肠瀑样。雌性生殖道激活等cAMP-raising代理forskolin导致氯运输到瀑样腔,是伴随着腔的水通过渗透分泌(图1)。两个功能化验了量化雌性生殖道功能依赖腔的氯化物分泌和肠道瀑样耦合水运输。
首先,孵化的瀑样forskolin导致快速腔的流体通过雌性生殖道分泌物活化,导致整个瀑样肿胀在60分钟。forskolin-induced肿胀(FIS)在人类和小鼠表型不在瀑样缺乏CFTR功能检测基因产物(如。我突变或两类雌性生殖道淘汰赛),是由化学抑制雌性生殖道抑制剂,支持全面CFTR-dependency FIS读出(10]。由此产生的肿胀瀑样量化使用共焦显微镜和钙黄绿素瀑样标签后绿色生活。所有瀑样的相对大小增加计算使用10分钟的间隔。生成一个相对膨胀曲线从这些数据和曲线下面积的相对膨胀计算比较条件(如。不同的药物,不同的捐助者)在一个单一的图表(11]。
第二,稳态腔的表型差异之间存在健康控制和CF瀑样forskolin独立的。健康控制直肠瀑样有大量充满液体的腔,暗示营地CFTR功能检测和生理信号的存在在标准培养条件导致腔的盐和流体运输(12]。CF瀑样没有流明,目视检查时很容易识别。这种表型差异可以量化FIS试验之前由手工绘制的腔calcein-labelled瀑样在基线图像,随后表达腔区域总面积的百分比。而CF瀑样有稳态腔区域(SLA)瀑样总面积的0%和10%之间,健康控制SLA是在40%和80%之间。SLA是CFTR-driven时,一些变异表型存在雌性生殖道的0 - 10%范围内独立的基因型。
金融中间人和SLA是互补的化验。CFTR FIS有巨大的吞吐量和量化检测功能水平与CF疾病及其治疗与当前雌性生殖道调节器(7,10]。FIS措施相对大小增加,它要求起步大小相媲美。这对CF瀑样是正确的,但在更大的SLA(∼> 25%),相对大小增加时低估了二维面积测量执行(7]。因此,FIS的CF和健康对照组不具有直接可比性。SLA CF和健康促进比较控制瀑样,但有限的决议在雌性生殖道功能水平较低与歧视严重的CF疾病(7]。
FIS和SLA最近才被开发出来,和技术专长是目前的实验室。FIS的雌性生殖道的依赖已经被独立证实其他CF (13,14在肠[]和non-CF实验室15)和non-intestinal组织(16]。为了进一步规范多中心研究,活检也可以运送到一个中央实验室进行处理,这是可行的在48 - 72 h后获得活检。不断增长的金融中间人瀑样结构实验需要∼4周,此时瀑样可以存储在液态氮,以供将来使用。在文化、FIS和SLA每周化验可以执行,和重复测量几周可以执行以保证测量结果的可靠性。
什么是当前研究中使用瀑样囊性纤维化?
肠道瀑样用于更好地了解雌性生殖道功能或操纵的治疗干预措施可以影响个人临床表型(图1)。此外,最近HIT-CF资助项目(www.hitcf.org)将使用瀑样的预处理分层设计的临床试验在体外急救员。
临床研究表明,瀑样FIS相关描述雌性生殖道罕见的雌性生殖道功能变体。许多目前已知的2000个雌性生殖道变异没有特征,预测的复杂个体疾病表型。此外,有限的数据对药物影响稀有基因型阻止访问现有的和新的CFTR-mutation特定治疗。试验研究表明,瀑样既可以帮助个体CFTR生物标志物的检测函数来预测个体疾病表型(17),以及对治疗的反应(18),这将有助于描述治疗罕见突变反应(7]。
瀑样和临床疾病表型
瀑样FIS反映CFTR残留检测功能和与预测CF基因型的表型特征(7,17CFTR]和其他生物标志物的检测功能,如汗氯浓度(SCC) [7,17)和肠道电流测量(ICM) [17,19]。而鼻电位差CFTR (NPD)是另一个重要的临床生物标志物的检测功能,没有数据之间的相关性瀑样FIS和NPD目前可用。
第一项研究直接比较瀑样FIS和临床表型与CF前瞻性包括34个新生儿。新生儿被聚集到低FIS或高金融中间人。低FIS瀑样增加肺和胰腺疾病有关参数时1年(17]。有趣的是,在鳞状细胞癌和ICM不同意的情况下,金融中间人似乎正确结合临床指标(17]。这项研究表明,FIS的雌性生殖道的依赖和48点我们通常收集(通过滴定forskolin和重复测量)输入个人雌性生殖道剩余函数可以提供更高的准确度和精密度CFTR相比其他生物标志物的检测功能。雌性生殖道函数的精确测量也表明,残余功能的进一步细化分类是可能的。由于这些早期的研究虽小,目前还不清楚如何模型预测长期临床风险。后续研究需要更大的群组研究中验证使用瀑样预测患有罕见疾病表型的突变,并预测相同CF-causing突变的个体之间的表型变化。
瀑样研究药物疗效
功能型,瀑样被用于识别和开发CFTR-modulating药物和探索机制与雌性生殖道功能差异相关。制药公司在药物开发中使用肠道瀑样管道(20.,21]。在最初的大规模筛选,许多不同的化学结构和CFTR-modulating药物发现工作。瀑样可以是一个有用的工具来有效地验证铅化合物,因为他们的中/高吞吐量和对药物的敏感性影响结合他们表达内源性雌性生殖道的事实。瀑样用于测试单一药物的效力,但也比较不同联合治疗的疗效[20.- - - - - -22]。
此外,研究了Dekkers和同事(7,10,23]在瀑样表明雌性生殖道CFTR突变和其他特定的遗传差异修改响应检测调节器。通过研究一系列药物在不同基因型的影响,最优雌性生殖道调节药物及其效力对于每个基因型可以被识别为进一步的临床研究[23,24]。
几项研究已经强调了平移瀑样的潜力。Genotype-specific ivacaftor和lumacaftor / ivacaftor瀑样与临床试验数据(在集团层面7]。III期临床试验的失败与ataluren科目与终止密码子突变之前是没有报告药物瀑样的活动模式25,26]。这些组的观测表明,瀑样可以描述突变特定治疗的反应。这种方法将补充当前雌性生殖道“theratyping”努力,主要依赖细胞株表达系统介绍了雌性生殖道突变。基于定量和定性治疗反应差异瀑样子组(如。比较平均p.Ala455Glu / p。Phe508del p.Asn1303Lys / p。F508del或类I / p。Phe508del responses), mutation-specific phenotypes with different therapeutic vulnerabilities can be deduced [23]。这些theratyping努力个别病人没有直接关系,但依靠单个雌性生殖道基因型的耦合基于单元的数据。
最近的证据概念在两件突变患者显示清晰在体外- - - - - -在活的有机体内相关性与ivacaftor(对治疗的反应7]。随后24个人基因型的研究发现,肠道瀑样FIS与药物姜黄素治疗后,染料木素,ivacaftor和lumacaftor / ivacaftor与在活的有机体内反应肺功能和汗水氯浓度在个人层面上。此外,接受者操作特征曲线从这些数据表明,单个的临床反应生成CFTR-modulating药物可以与good-to-high预测精度(18]。这些初步研究表明,瀑样提供相结合的功能读出CFTR缺失检测突变和额外的遗传变异,修改对治疗的反应。如果这些结果验证在后续的研究中,这将表明,直接测试病人瀑样可以用来描述对治疗的反应,独立于任何先天的知识在雌性生殖道的基因型。
瀑样比较如何体外或在体外细胞模型?
基于单元的方法大多被用于类型的平均治疗反应突变或基因型。费舍尔鼠甲状腺(FRT)细胞株,在雌性生殖道突变以标准化的方式介绍了使用定义的互补,可用于高通量药物筛选,帮助延长ivacaftor治疗新雌性生殖道突变(27]。这个模型的强度是其标准化测试组件的定义,和病人没有接受额外的程序。然而,FRT细胞非人类,影响雌性生殖道蛋白质折叠(28和药物治疗反应29日,30.]。补充这种mutation-oriented方法,几个模型已经开发使用patient-derived细胞。
只有少数研究直接比较药物的结果体外或在体外培养的细胞和在活的有机体内治疗参数。ICM在体外CFTR直肠活检是验证测量残留检测功能(31日,32],敏感地检测CFTR-modulator治疗后效果在活的有机体内药物治疗(33,34]。然而,每个切片只有一个治疗可以进行测试,使繁重的个性化药物评估。
雌性生殖道功能在人类支气管上皮细胞(HBE)和鼻上皮细胞(HNE)评估使用电生理学研究气液界面文化,模仿气道环境(35]。大规模筛选后由于细胞衰老是不可行的数量有限的段落,并多次获得HBE细胞从活体供体是一个入侵过程。HNE细胞可以通过鼻刷牙,初步研究表明,电生理测量与刷HNE细胞在活的有机体内雌性生殖道功能和可能是预测个体的治疗反应(36,37]。
上述模型相比,肠瀑样的局限性和优势。因为健康的瀑样pre-swollen, FIS CF健康控制雌性生殖道功能无法比较。此外,尽管肠道和呼吸道细胞都来源于内胚层,目前尚不清楚肠道上皮雌性生殖道功能与气道上皮雌性生殖道功能直接相关,这可能影响治疗反应(29日,30.]。然而,潜在的生物和反复测试肠瀑样促进强劲的个人化药物的方法。未来的研究需要阐明该模型优越的可行性和预测能力。
NPD和鳞状细胞癌在活的有机体内雌性生殖道功能测量,都是用于诊断CF和作为生物标志物在I和II期临床试验评价雌性生殖道功能改进后药物治疗(38]。这些方法已经彻底验证,可用在许多中心。然而,NPD和SCC不能使用功能型,个性化医学这限制了它们的使用方法。为深入研究ICM的概述,NPD和鳞状细胞癌eBoeck等。(39]。
未来使用瀑样
当前的研究与瀑样支持额外的残余的分类函数的可能性。雌性生殖道功能可能是一个生物连续体,主要是依赖于雌性生殖道的基因型和进一步修改个人的遗传和环境因素。第一个临床验证研究表明相对较大的剩余函数的差异(尽管在CF域)与临床表现(17]。更微妙的差异是否在瀑样肿胀(如。瀑样之间的人相同的CF-causing突变;或者在边界条件CF和CFTR-related疾病)也与临床表型仍然需要进一步的长期临床随访研究。
当前CF瀑样研究的焦点是预处理的CFTR件检测变异患者选择欧洲联盟研究(www.hitcf.org)。此外,本研究强调使用瀑样技术的可能性研究pharmacy-overarching的药物组合。未来的研究应该定义更精确地测定敏感性和特异性变化与治疗效果的大小在活的有机体内长期和短期预测与结果。实现瀑样dose-optimisation研究可能有助于进一步赋予个性与即将到来的CFTR-modulating药物治疗。
结论
直肠瀑样是在体外原代细胞培养,使雌性生殖道功能的单个输入和响应雌性生殖道调节器。第一个临床研究表明,FIS的直肠瀑样有助于描述CFTR罕见的疾病表型和药物反应检测突变。进一步的研究正在进行中,以进一步验证之间的关系在体外雌性生殖道功能和在活的有机体内临床表型的CF诊断、预后和治疗反应。
脚注
利益冲突:p . van Mourik没有披露。
比克曼的利益冲突:J.M.在这项技术上拥有专利的瀑样肿胀个性化诊断与支付的版税CF Hubrecht瀑样技术。他收到财政支持来支付旅行费用和准备时间从顶点的科学讲座。他还获得了资金从加拉帕戈斯群岛雌性生殖道调制器的研究。
利益冲突:C.K. van der Ent报告赠款从顶点医药公司,基列科学和加拉帕戈斯群岛,从ProQR津贴和其他资金,从梯瓦制药产业和其他资金,在提交工作。
- 收到了2018年12月15日。
- 接受2019年4月7日。
- 版权©2019人队