抽象的
快速测试,以评估SARS-COV-2特异性T细胞应答的迫切需要破译免疫保护和援助监测疫苗诱导的免疫力。使用快速全血测定法需要的血液量极少,我们测量在31名医护人员定性和定量SARS-CoV的-2特异性CD4T细胞应答,使用流式细胞术。COVID-19恢复期参与者的100%显示可检测SARS-CoV的-2特异性CD4T细胞应答。SARS冠状病毒-2-应答细胞在没有COVID-19相关症状或谁参与者的40.9%还检测到测试PCR阴性。表型评估表明,在COVID-19恢复期参与者,SARS-CoV的-2的CD4应答显示具有以产生IFNɣ容量有限的早期分化的记忆表型。相反,在参加者没有报告的症状,SARS-COV-2的CD4应答在后期分化的细胞富集,共表达IFNɣ和TNFα和颗粒酶也B.这证明了概念研究提出了一个可伸缩的替代基于PBMC的分析枚举和表型SARS-CoV的-2-响应性T细胞,因此代表一种实用工具来监视适应性免疫由于自然感染或疫苗试验。
抽象的
在这项概念验证研究中,我们证明了SARS-CoV-2T细胞反应很容易被检测,使用快速全血检测需要最小血容量。这种分析方法是在疫苗试验中监测适应性免疫的合适工具。
介绍
SARS-COV-2感染的爆发(导致被称为COVID-19的疾病),在武汉,中国第一次出现在2019年十二月,宣布于2020年3月12日全球大流行,并影响到世界上所有国家,包括非洲[中1].目前迫切需要更好地了解临床表现和SARS-COV-2,以开发相关工具,包括诊断,检查,治疗和疫苗,以阻止疾病的蔓延,以及战略,以最好地管理这种疾病的发病机制在所有人群。
COVID-19的临床谱很广,从无症状的轻度通过流感样症状到严重肺炎而死亡。了解什么是抗SARS-COV-2免疫保护的关键是预测长期的免疫力,并告知疫苗设计。虽然大部分重点放在对B细胞和抗体反应,但目前尚不清楚是什么类型的免疫应答赋予保护对SARS-COV-22].几项研究表明,T细胞反应可能在SARS-COV-2发病机制中发挥重要作用和表明缺乏B细胞的患者可以从SARS-COV-2感染中恢复进一步突出T细胞免疫的可能重要性[3.那4.].此外,越来越多的证据表明,预先存在的,交叉反应性记忆T细胞特异性针对普通感冒冠状病毒的存在可影响易感性SARS-CoV的-2感染和部分解释的显着不同的临床表现COVID-19 [5.-8.].
高效、敏感和简单地评估人类t细胞免疫仍然是一个挑战。最常用的T细胞检测需要分离外周血单个核细胞(PBMC),这需要大量的血液。因此,全血检测可能比基于pbmc的方法更有优势,因为它可以显著减少血容量(约1ml),使其更适用于儿科人群。此外,这种检测是快速的,因为它们不需要细胞分离,并保存生理细胞和可溶性环境,模拟更好的人类血液状况。在这里,我们报告了一种基于全血的快速(约7小时)检测sars - cov -2特异性T细胞反应的方法,其步骤简单,可适用于资源有限的环境。这种快速适用的检测方法可以作为一种易于标准化的工具,用于评估sars - cov -2特异性适应性免疫,监测疫苗试验中的T细胞应答,了解什么是保护性应答,或定义SARS-CoV-2T细胞应答人群的流行情况。
方法
学习人口
研究人口包括医护人员(HCW,N = 31,29%为男性)七月和2020年9月间招募,从格鲁特Schuur医院在开普敦,初始COVID-19疫情的重灾区区域在南非[9.].参加者根据我分类的)的COVID-19相关症状的报告,ⅱ)是否从鼻或咽拭子一个SARS-CoV的-2 RNA进行PCR和iii)SARS-CoV的-2 PCR结果。基于这些标准,参与者被分为三组:1)的人没有COVID-19相关症状(N = 15);2)人谁报告的症状,但经测试SARS-CoV的-2 PCR阴性(N = 7);和3)谁曾COVID-19相关症状和测试SARS-CoV的-2 PCR阳性(N = 9人)(表格1).在所有群体中,对Covid-19患者的暴露相当(86.8至100%)。所有PCR的参与者都证实了Covid-19具有轻度症状,并且不需要住院治疗。获得血液样品的中位数7.3周后的SARS-COV-2在具有阴性试验结果的人的人中测试,4.7周,确认阳性结果(P = 0.09)。在抽样时,所有参与者都是无症状的。在四个SARS-COV-2 PCR阳性参与者中,1个月后获得第二个样品。开普敦大学的卫生科学教师人类研究伦理委员会批准了这项研究(HREC:207/2020),并从所有参与者那里获得了书面知情同意书。
测量血浆中SARS-COV-2核衣壳特异性IgG
使用RocheElecsys®抗SARS-COV-2免疫测定(Roche Diagnostics,Basel,Switzerland)进行SARS-COV-2特异性抗体的测量。这个半量值E.LeCTO-化学发光免疫测定测量SARS-COV-2核衣壳特异性IgG。该检验由南非国家卫生实验室服务(NHLS)进行,并根据制造商的说明解释(Roche:V 1.0 2020-05)。结果报告为截止指数(COI;信号样品/截止)的形式的数值,其中COI <1.0对应于非反应性等离子体和COI≥1.0至反应性等离子体。在SARS-COV-2后14天,ELECSYS®ALARS-COV-2免疫测定的敏感性和特异性已被报告为99.5%(95%CI,97.0至100.0%)和99.80%(95%CI,99.69至99.88%)分别[10-12].
SARS-CoV的-2假病毒中和测定
患者血浆进行评价用于使用SARS-CoV的-2假病毒感染测定SARS-CoV的-2中和活性。单周期感染SARS-CoV的-2假病毒基于所述HIV骨干表达SARS-CoV的-2穗(S)蛋白和萤火虫荧光素酶报道在HEK-293TT细胞中产生[13那14质粒pNL4-3.Luc.R-共转染。E.-(N.一世H一种一世D.S.Reagent Program (#3418), Germantown, MD, USA) and pcDNA3.3-SARS-CoV-2-spike Δ18 [15].转染3天后收集含有病毒粒子的HEK-293TT细胞培养上清,与热灭活的患者血浆以5倍连续稀释在37℃下孵育60分钟。然后用血浆/伪病毒混合物转染稳定表达ACE2受体的HEK-293T细胞[16].感染后3天,使用Promega细胞培养裂解试剂(Promega Biosciences Inc., San Luis Obispo, CA, USA)裂解细胞,并使用GloMax®Explorer多模微孔板Reader (Promega Biosciences)和荧光素酶检测系统(Promega Biosciences)评估荧光素酶活性。
全血基T细胞检测测定
在肝素管中收集血液并在收集的3小时内加工。基于血液的SARS-COV-2特异性T细胞检测测定从先前报告的全血细胞内细胞因子检测测定旨在定量结核分枝杆菌特异性T细胞中的血小体积[17].然而,显著修改已经进行,其中包括减小的温育时间,固定的缓冲器允许红细胞的同时裂解,以简化处理时间的使用,从而导致更快的采集结果[的18].在这里,我们采用了这种测定法使用合成的SARS-CoV的-2 PepTivator肽(美天旎,萨里,UK)来检测SARS-CoV的-2特异性T细胞,包括15聚体序列的与11覆盖的免疫显性的部分氨基酸重叠尖峰(S)蛋白,和核衣壳(N)和膜(M)蛋白的完整序列。一种ll peptides were combined in a single pool and used at a final concentration of 1 µg·mL-1.介绍了测定的工作流程图1.简而言之,在抗CD28和CD49D的共刺激抗体存在下,用SARS-COV-2S,N和M蛋白肽池在37℃下用SARS-COV-2S,N和M蛋白肽库刺激400μL全血。(1μg·ml-1每个;BD.B.iosciences, San Jose, CA, USA) and Brefeldin-A (10 µg·mL-1, Sigma-Aldrich,圣路易斯,MO,美国)。未刺激的血液与共刺激抗体、Brefeldin-A和等摩尔量的DMSO一起孵育。然后使用转录因子固定缓冲液(eBioscience, San Diego, CA, USA)将红细胞裂解和白细胞固定作为单一步骤进行20分钟。在这一阶段,细胞在冷冻介质(50%胎牛血清,40% RPMI和10%二甲基亚砜)中低温保存,并保存在液氮中,直到批量分析。
细胞染色上解冻的是,洗涤并用透化的转录因子渗透/洗涤缓冲液(eBioscience公司)冷冻保存的细胞进行。细胞s were then stained at room temperature for 30 min with antibodies for CD3 BV650, CD4 BV785, CD8 BV510, CD45RA Alexa 488, CD27 PE-Cy5, CD38 APC, HLA-DR BV605, Ki67 PerCP-Cy5.5, PD-1 PE, Granzyme B (GrB) BV421, IFNɣ BV711, TNFα PE-Cy7 and IL-2 PE/Dazzle 594, as detailed in补充表1.样品在BD LSR-II上采集,使用FlowJo (v9.9.6, FlowJo LCC, Ashland, OR, USA)进行分析。阳性反应被定义为任何细胞因子反应至少是未受刺激细胞背景的两倍。为了确定sars - cov -2特异性CD4T细胞的表型,使用了30个事件的截断值。浇注策略是在补充图1.
统计分析
图形表示是在棱镜进行(v8.4.3;格拉夫派得软件公司,圣地亚哥,CA,USA)和JMP(v14.0.0; SAS研究所,卡里,NC,USA)。统计测试是在棱镜进行。非参数检验用于所有比较。使用了Kruskal-Wallis检验与Dunn的多重比较检验进行多重比较,并且分别曼 - 惠特尼和Wilcoxon配对检验和不匹配的成对样品。
结果
SARS-COV-2致敏的血清学评价
即使RT-PCR是检测急性SARS-COV-2感染的最具体的技术,阳性率在症状后10天左右迅速下降,特别是在具有轻度形式的Covid-19的个体中[19那20.].因此,血清学检测为RNA检测提供了重要的补充,以识别被SARS-CoV-2致敏的个体。因此,为了评估未进行SARS-CoV-2 PCR检测或PCR检测阴性的参与者的潜在SARS-CoV-2致敏性,需要检测SARS-CoV-2特异性抗体(例如SARS-CoV的-2核衣壳特异性IgG)进行测定,并在所有的参与者还进行了SARS-CoV的-2假病毒中和测定。而具有正SARS-CoV的-2 PCR测试所有与会者显示体外抗SARS-COV-2中和活性和8/9(88.8%)有检测SARS-COV-2特异性核衣壳IgG抗体,没有谁测试阴性或没有进行PCR检测为阳性SARS-COV-2的参与者核衣壳特异性IgG(图2A)或显示强大体外抗SARS-COV-2活动(图2B.).总之,这些结果证实,PCR阳性的参与者已经感染了SARS-COV-2以及安装到病毒的免疫应答。对于其他参与者来说,是很难确定他们的SARS-COV-2感染状态。一方面,缺乏抗体反应和中和活性的可能表明,他们并没有被SARS-COV-2感染。但在另一方面,由于其高级别SARS-COV-2的曝光,我们不能完全排除SARS-COV-2感染,如同时罕见,COVID-19证实阴性患者抗体的结果已经报告[21].
SARS-COV-2响应CD4T细胞的级别和功能性概况
在测试的31名参与者中,使用所述的全血症(促进所述全血症),58%(n = 18)具有可检测的SARS-COV-2特异性CD4T细胞响应(产生任何测量的细胞因子,IFN1,TNFα或IL-2)(图3A).然后,我们定义的SARS-COV-2特异性CD4根据参与者的临床特征反应的大小和表型(图3B.&C)。与自我报告的症状和SARS-CoV的-2 PCR阳性试验(N = 9)发现所有HCW具有冠状病毒-2特异性SARS-CD4T细胞(中值频率:0.47%,IQR:0.28-0.65)(图3C.).值得注意的是,SARS-CoV-2特异性CD4T细胞的频率与SARS-CoV-2核衣壳特异性IgG (p=0.64, r=−0.18)或血浆中和活性(p=0.46, r=0.28)无关(数据未显示)。有趣的是,在没有检测到SARS-CoV-2核衣壳特异性IgG或中和抗体活性的参与者中,在自述症状的参与者中,有3/7(43%)检测到对SARS-CoV-2有应答的CD4T细胞(应答中值:0.02%,IQR:0.019-0.03)和6/15(40%)无自我报告症状的患者检测到sars - cov -2应答CD4T细胞(应答中位数:0.15%,IQR: 0.05-1.47)。此外,在9例SARS-CoV-2 PCR阳性参与者中,有6例(66.7%)观察到SARS-CoV-2特异性CD8T细胞应答。在报告无症状的参与者(n=15)中,只有一人可检测到CD8反应,而PCR阴性的参与者(n=7)中没有人可检测到sars - cov -2特异性CD8T细胞反应(数据未显示)。
接下来,我们定义SARS-CoV的-2-响应CD4T细胞的多官能轮廓,根据其能力,以共表达IL-2,IFNγ或TNFα(图3d).在PCR阳性参与者中,sars - cov -2特异性细胞的总体功能谱与未报告症状的参与者不同(p=0.0002)。事实上,在PCR+参与者中,sars - cov -2特异性CD4反应的特点是IFNγ有限表达,并在IL-2和TNFα共同表达的细胞中富集。相反,在没有症状的参与者中,大多数对sars反应的CD4细胞分布在三重功能细胞(IL-2+IFNγ+TNFα+)和共同产生IFNγ和TNFα的细胞中。总体而言,在本试验中,TNFα是主要产生的细胞因子,其产生量显著高于IL-2 (p=0.0026)和ifn - γ (p<0.0001) (补充图2).
SARS-COV-2响应CD4T细胞的表型评估
虽然可以使用有限抗体面板进行所提出的测定以鉴定SARS-COV-2响应T细胞的频率,但通过单独测量细胞因子产生,使用更广泛的抗体面板也允许定义这些的表型剖面细胞。为此,我们包括额外的标记,以评估SARS-COV-2响应CD4T细胞的内存分化(CD27,CD45RA),细胞毒性电位(GRB)和激活曲线(HLA-DR,CD38,KI67,PD-1)。
图4一&b显示,在所有有症状的个体中,sars - cov -2特异性CD4T细胞几乎完全(中位数:97.7%)表现出早期分化的记忆表型(ED: CD45RA−CD27+)。相反,在无症状的4/6 HCW中,sars - cov -2特异性CD4T细胞表现出主要的晚期分化表型(LD: CD45RA−CD27−)。
虽然细胞毒性CD4T细胞的作用尚不清楚,但已经在几种病毒感染中描述了这些细胞的存在[22].因此,我们在SARS-COV-2响应CD4T细胞中测量了GRB表达。虽然在PCR阳性参与者中的SARS-COV-2特异性CD4T细胞中勉强可检测到GRB,但在6名参与者中的4种没有症状中观察到升高的GRB表达(图4C.&d)。此外,ED SARS-COV-2响应CD4T细胞与GRB表达(P = 0.002,R = -0.71)与IFNγ和TNFα双产生细胞的比例(P <0.0001,R = -0.84)的比例(图4E.).表达sars - cov -2应答CD4T细胞的GrB表型特征(IE。高度分化并产生ifn - γ和tnf - α)与最近一份描述cmv特异性CD4 CTL T细胞的报告一致[23].
为了确定sars - cov -2应答CD4T细胞的整体表型是否允许根据参与者的临床特征对其进行区分,我们进行了分级聚类分析(图5一个)和主要成分分析(PCA)(图5 b),包括四个参数(例如IFNγ+TNFα+IL2+和IFNγ−TNFα+IL2+细胞的比例,ED和GrB的表达比例)。两项分析都表明,报告无症状且SARS-CoV-2抗体阴性的参与者与PCR阳性参与者明显分离。相反,PCR和SARS-CoV-2抗体阴性的HCW报告症状不能从PCR阳性的参与者中分离出来。负载图显示,GrB表达和三阳性细胞比例是允许分离无症状和SARS-CoV-2抗体阴性的参与者的主要驱动因素(图5 c)
最后,作为抗原特异性T细胞上的活化标志物(HLA-DR,CD38,PD-1或Ki67)的表达,指示有源感染[24那25[我们定义了在SARS-COV-2响应CD4T细胞上表达这些标志物。在不同组中的任何测量标记中没有观察到显着差异,尽管在PCR阳性参与者组中观察到了几个异常值(图6).一世nterestingly, regardless of the participants’ clinical characteristics, PD-1 expression was highly expressed on SARS-CoV-2-responding CD4T cells, We then defined the relationship between the activation profile of SARS-CoV-2-specific CD4T cells and time post positive PCR test.图6 bshows that in PCR positive participants, the expression of CD38 associated strongly with the time post PCR testing (p<0.0001, r=−0.91), where CD38 expression decreased sharply in the first 2 to 3 weeks post testing, suggesting a rapid clearance of the pathogen. Similar associations where observed for all tested activation markers, with CD38 expression showing the strongest correlation (图6 c).
讨论
在验证的概念,这种分析评估使用简单的全血检测来衡量在一个小保健工作者人群SARS-COV-2特异性T细胞反应,我们表明,SARS-COV-2特异性CD4T细胞(表达IFNγ,TNFα或IL-2)在所有测试的恢复期COVID-19参加者容易地检测到。但是,与会者谁没有遇到任何COVID-19相关的症状或检测SARS-COV-2 PCR阴性(尽管报告的症状),9/22(40.9%)也表现出可检测SARS-COV-2特异性的CD4T细胞回复。然而,在后者的基团SARS-CoV的-2特异性CD4T细胞的中值频率为〜5倍相比SARS-CoV的-2 PCR阳性参与者降低。重要的是,不同于恢复期COVID-19参加,没有与会者没有症状或谁测试PCR阴性具有可检测SARS-CoV的-2核衣壳特异性IgG或显示健壮中和活性。几个假设可以解释在不存在可检测的抗体应答的SARS-CoV的-2应答细胞的检测。由于包括在此研究的参与者最有可能高度暴露于SARS-COV-2由于他们的职业,人们可以说,无症状COVID-19事件期间生成1)SARS-COV-2 CD4T细胞反应,看到没导致可检测的抗体应答;2)反映最近暴露于SARS-CoV的-2;或3)对应于SARS-CoV的-2交叉反应性存储器CD4T细胞。 A number of studies have demonstrated the presence of SARS-CoV-2-reactive CD4T cells in 40 to 60% of SARS-CoV-2-unexposed individuals in different populations around the world [26-29].另外,重要的是指出所有这些研究都使用PBMC进行,并且令人抱歉发现使用有限量的血液(<1mL)的全血基测定产生可比的结果。
进一步分析SARS-COV-2特异性CD4T细胞的多官能和表型分布显示,无论参与者的临床特征如何,响应于SARS-COV-2肽检测到最普遍的细胞因子是TNFα。这些观察结果符合其他研究,指出SARS-COV-2适应性免疫应答的损害,其特征在于I型和II型干扰素[30.那31].但是,它也有可能是有限的IFNγ生产,我们在这项研究中观察到的,是关系到短期刺激时间(例如5. h) used in the assay. Nevertheless, this suggests that TNFα could be a more reliable target than IFN-γ, to detect SARS-CoV-2-specific CD4T cell responses. Additionally, SARS-CoV-2-responding CD4T cells in all participants were characterised by elevated of PD-1 expression. Such profiles have been observed in acute SARS-CoV-2 infection and is likely driven by ongoing viral replication [27那32那33].PD-1对在没有急性感染的抗原特异性记忆T细胞中的表达可能是令人惊讶的。然而,依赖于它们的特异性,抗原特异性记忆T细胞可以显示高度可变的分化轮廓[34]甚至在感染清除后甚至报告了在一些病毒特异性记忆T细胞(例如CMV或HCV)上升高的PD-1表达的维持[35-37].此外,最近的出版物表明PD-1表达SARS-CoV的-2特异性CD8T细胞没有耗尽,但在恢复期官能COVID-19名患者[38].需要进一步的实验来了解PD-1表达升高对sars - cov -2应答CD4T细胞的影响。
最后,在康复期COVID-19参与者和没有经历COVID-19相关症状的参与者之间,sars - cov -2应答CD4T细胞在质量上是不同的。在前一组中,sars - cov -2特异性CD4T细胞几乎完全表现出早期分化的记忆表型;而在后者中,sars - cov -2应答CD4T细胞表现出晚分化的记忆表型,GrB富集。
我们的研究有一些局限性。我们的结果依赖于少数参与者,并且需要在较大的队列中确认。在没有低SARS-COV-2暴露对照组的情况下,我们不能推测SARS-COV-2响应于作为血清学阴性的参与者检测到的CD4T细胞的确切特异性。
此外,技术优化和验证是必要的简化提出的试验和测试其性能。使用全血的IFN-γ释放分析(IGRA)可比较的方法中,通常使用的用于检测的结核分枝杆菌感染,最近已应用到检测SARS-CoV的-2特异性T细胞应答[39].虽然两种技术具有相当的成本(〜30-40〜40美元),但在本研究中提出的流式细胞术的测定法具有较低的周转时间(~7小时)相对18小时,但更重要的是我们的方法更加灵活。它可用于简单地量化SARS-COV-2响应CD4和CD8T细胞(使用最小的4色面板)来监测流行病学研究或疫苗试验中的T细胞应答的频率,或用于更多探索性工作评估SARS-COV-2特异性T细胞的表型和功能。关于每个测定的敏感性和特异性,需要进行并行分析以比较两种测定的性能。另外,应进行进一步的优化以提高所提出的SARS-COV-2特异性全血症的标准化和灵活性,包括使用含有冻干试剂的管用于细胞刺激,预混合抗体鸡尾酒用于细胞染色和自动化术语进行流动分析.缓解收集时间和运输限制和限制资源位点的另一种替代方案是使用冷冻保存溶液直接冷冻验收全血样品,例如Cryostor®CS10溶液[40],允许进行细胞刺激,并在足够的装备位点以分批染色。最后,在这项研究中,使用肽覆盖SARS-CoV的-2 S,N和M蛋白的池进行细胞刺激。在示出之间的区分预先存在的交叉反应性应答和COVID-19诱导的应答的最近的出版物的光依赖于所使用的SARS-CoV的-2抗原的特异性[41.[似乎本研究中使用的肽组合对于将预先存在的交叉反应性SARS-COV-2-反应性T细胞与CoVID-19诱导的反应区分开而不是最佳的。因此,通过使用具有用于SARS-COV-2或季节性冠状病毒的特异性的更多靶向的肽池可以进一步增强所提出的测定。
然而,本研究的主要目的是描述作为一个概念,一个快速和灵活的全血化验,要求非常有限的血液,这将是一个强大的工具来调查SARS-CoV-2特异性T细胞反应定量和定性甚至在COVID-19儿科病例。
承认
作者感谢所有参与者。
脚注
本文提供了补充材料www.qdcxjkg.com.
支持声明:通过Wellcome [Grant Number:104803和203135]支持这项工作并与Rosetrees Trust合作的创新(I2I)计划的克里克理念[赠款编号:2020-0009]。CR由欧洲和发展中国家的临床试验伙伴关系支持欧盟(欧盟)的地平线2020计划(欧盟)的地平线2020计划(培训号:培训和移动动作TMA2017SF-1951-TB规范)和国家机构的临床试验健康(NIH)[授予号码:r21ai148027至cr]。GS由欧洲和发展中国家提供支持临床试验合作伙伴关系EDCTP2计划[赠款编号:培训和移动动作TMA2018SF-2446至GS]。RJW和KAW获得弗朗西斯克里克研究所的支持,该研究所由英国医学研究委员会Ukri,癌症研究英国和Wellcome获得了资助[赠款号码:FC0010218]。出于开放访问的目的,作者已通过公共版权188滚球软件许可证向任何作者接受从本提交产生的稿件版本应用了CC。rosetrees信任;doi:http://dx.doi.org/10.13039/501100000833;格兰特:2020-0009;医学研究委员会; DOI: http://dx.doi.org/10.13039/501100000265; Grant: FC0010218; NIH Clinical Center; DOI: http://dx.doi.org/10.13039/100000098; Grant: R21AI148027; European and Developing Countries Clinical Trials Partnership; DOI: http://dx.doi.org/10.13039/501100001713; Grant: TMA2017SF-1951-TB-SPEC, TMA2018SF-2446 ; Wellcome; DOI: http://dx.doi.org/10.13039/100010269; Grant: 104803, 203135.
作者捐款: CR, KAW和RJW设计了这项研究。CR进行全血检测和流式细胞术实验,并对数据进行分析和解释。GS进行中和试验。EdB, RTG和CS招募了研究参与者。KAW、HM和DH为关键试剂。CR和KAW与所有作者一起撰写了手稿,提供了关键的反馈。
利益冲突:Riou的博士没有透露。
利益冲突:Schafer博士没有披露。
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利益冲突:歌利亚女士有没有透露。
利益冲突:STEK博士没有透露。
利益冲突:MOU博士无需披露。
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利益冲突:威尔金森博士没有透露。
兴趣冲突:威尔金森博士报告来自康布的赠款,来自癌症研究英国的赠款,来自英国研究和创新的补助,从EDCTP进行授予,在该研究期间。
- 收到了2021年1月29日。
- 公认2021年5月26日。
- 版权所有©作者2021。
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