抽象的
就像多功能瑞士军刀,Deeplex提供了前所未有的多功能性,直接从临床样本,代表了一个受欢迎的诊断和流行病学工具箱https://bit.ly/38s6ukf.
介绍
属分枝杆菌包括近200个物种,可分为四大类[1].具体来说,这结核分枝杆菌复合菌(MTBC)是结核病(TB)的病原体,是由单一感染病原体引起的主要死亡原因,与引起布鲁里溃疡和麻风病的分枝杆菌不同[2,3.].剩余的物种被称为不泛滥的分枝杆菌(NTM),主要引起肺病,并且在世界许多地方变得更频繁,特别是在老年患者中[4].
用于实验室诊断的工具诱惑的工具箱
分枝杆菌的微生物学诊断包括四大支柱:检测、鉴定、药敏试验(AST)和聚类分析[5].传统上,首先使用显微镜检查临床样品中的高量酸 - 快杆菌(AFB)(通常是痰液)。培养物也接种,这可能在几天至周内变为阳性,这取决于分枝杆菌物种和细菌载荷。此时,执行对物种级别的快速识别。对于大多数NTM,这是最后的诊断步骤,因为通常可以基于单独的物种鉴定推断出适当的验证处理[2].相比之下,需要常规AST时体外药物的活性预测在活的有机体内结果,对某种特定药剂有显著的耐药性[2].对于一些NTM来满足两个标准,对MTBC尤为重要[6].最后,一些资源良好的国家常规进行集群分析,告知TB控制权[7].最近,聚类分析已经扩展到脓肿分枝杆菌和分枝杆菌intracellulare无性系种群。Chimaera.[8,9].
一个妥协的故事
综合概述了分枝杆菌的变化诊断景观超出了这一编辑的范围3.].相反,我们将重点关注采用核酸扩增检测(NAATs)的影响[10].一般来说,这些已经被开发用于加快周转时间,并在理想情况下结合多种诊断功能(图1).然而,由于第一代NAATs (如。线探针测定和实时PCR)通常分析少于200个碱基对(BP),可以用单一测定来解决的诊断问题的数量有限。事实上,这些测定不适合于德拉曼尼德的基因型AST,并且伪造的紫罗兰咪唑抗性可以通过六个基因的突变产生约7500磅的突变,包括启动子[11,12].
尽管存在这些限制,目前仍有超过45种第一代NAATs被批准用于临床,用于同时识别MTBC并直接从临床样本中进行AST基因型测定(S. Mohamed及其同事在第50届联盟世界肺健康大会上展示的海报;可以在请求)。通过克服AFB涂片镜检缺乏敏感性和特异性,这彻底改变了结核病治疗。此外,与表型AST相比,AST的周转时间从数周缩短到数天甚至数小时,这受到MTBC生长速度缓慢和通常顺序进行的限制(即。仅在发现与一线药物的抗性时仅测试二线药物[5,10].然而,应该指出的是,在这些NAATs的设计过程中做出了一些妥协,这在Nipro Genoscholar PZA-TB II中得到了最好的说明。为了使这种检测方法对吡嗪酰胺耐药的敏感性最大化,必须覆盖近600 bp,这只能依靠一系列与野生型序列结合的探针来实现[13,14].这意味着至少有一些耐药是由大多数NAATs间接推断出来的,具有不带来耐药的中性突变的局部频繁克隆可能导致阳性预测值较差,具有显著的治疗意义[15- - - - - -17].
最大限度提高基因型AST敏感性的另一个结果是,只有少量的试验同时识别最常见的NTM (如。Nipro Genoscholar NTM+MDRTB II [10])。因此,即使在培养的情况下,NTM通常在许多具有有限的实验室容量的情况下没有区分即。它们仅仅是由mtbc特异性NAAT或抗原阴性结果推断出来的[18])。在具有足够的诊断能力和较高的NTM相对流行率的环境中,单独的NAATs被用来区分常见的NTM,尽管不太常见的物种没有被识别出来,甚至被错误地识别出来,因为这些分析只检查了基因组的一小部分[19].该因素还限制了传统集群方法的解决,例如Spoligotyping [5].
救援下一代测序?
从理论上讲,对分枝杆菌诊断的最灵活的解决方案将是全基因组测序(WGS)直接来自临床样品。然而,尽管最近在下一代测序(NGS)和样品制备中进行了进展,但这仍然是不可靠的,并且在短期内使用常规使用昂贵[20.].即使直接NGS对分枝杆菌样本具有成本效益,在可预见的未来也不太可能适合检测,特别是在阳性率较低的环境中[5].相反,公共卫生英格兰采用了所有新的阳性分枝杆菌培养的常规WG,以将物种鉴定与基因型AST结合在最终分辨率下的所有TB药物和聚类分析(图1).鉴于WGS极好的阴性预测价值,这种方法加快了基因型AST的转换时间,并减少了一线药物对表型AST的需要,但这是以NTM物种形成的更长的转换时间为代价的[21].纽约州避免了这个问题,只采用常规的WGS用于阳性的MTBC培养,并依赖于更快、更便宜的NTM (即。基质辅助激光解吸/电离 - 飞行时间(MALDI-TOF)识别约70%的NTM和Sanger测序用于其余[3.,22])。
在这一期的欧洲呼吸杂志,J.out.等.[23[生物谷bioon]报道了基因筛选Deeplex Myc-TB (Deeplex)的性能,Deeplex是第一个通过满足CE-IVD要求而被欧盟批准用于临床的新一代NAATs的代表。该靶向NGS检测可检测超过13 000 bp (即。两个数量数量超过大多数第一代NAATS)。结果,它可以使用NTM识别HSP65.并询问19型和二线抗结核药物/类别的基因型AST的19个抗性基因,包括用于治疗多药TB的大多数关键药物(即。Bedaquiline,Clofazimine,Levofloxacin / Moxifloxacin和Linezolid)。其对杂项的检测极限低至3%,这对于某些药物来说是重要的[24].此外,Deeplex将这些抗性基因的系统进化信息突变与spoligotyping结合,从而提供同时的聚类结果。它适用于afb阳性样本,但必须在参比实验室水平进行,因为它依赖于Illumina在最初的24倍PCR后的测序。生物信息学分析的计算基础设施是不需要的,只要有合适的互联网连接,可以上传测序数据到Deeplex web应用程序[23].
尽管DEEPLEX具有相当大的功能,但其利基在不同的环境中高度依赖于当地流行病学(如。样品阳性率,NTM比值相对MTBC和耐药性的患病率)以及更广泛的诊断优先级和实验室推荐途径,因为可能需要批量来降低测序成本。它是世界卫生组织(世卫组织)经营的国家耐药监测项目有吸引力技术[25].常规诊断方法、Deeplex是最合适的后续测试AFB-smear阳性患者,可能耐药结核病快速统治电阻由于错过了最初的NAAT机制,要么因为这些耐药性的目标不是审问,或者他们是heteroresistance检测极限以下。然而,值得注意的是,bedaquiline对基因型AST的敏感性目前特别有限,因为atpe.不包括在内,因为在RV0678.,从而无法解释后一种基因的大多数突变[26].Deeplex的第二个特点是,它提供了仅由第一代NAATs推断的关于耐药性的额外信息。例如,中性突变导致的系统性假耐药结果可以被识别出来,莫西沙星的低水平耐药突变可以与高水平突变区分开来,这在Hain Lifescience基因型MTBDR中并不总是可能的sl版本2.0 (15].此外,Deeplex鉴定的样品中同时含有MTBC和NTM,这可能导致表型AST对MTBC的假抗性结果。最后,聚类分析结果将使高发病率环境补充其他流行病学信息,以监测主要克隆的传播,这在某些情况下可能被证明是有价值的(如。在北京菌株不占优势的地区,Deeplex的分辨率降低为系统遗传信息突变[16,27])。
其他靶向NGS检测方法正在开发中,或仅供研究使用(图1).ABL DeepChek Assay 13-Plex KB药敏试验V1使基因型AST适用于与Deeplex相同的药物,但利奈唑胺除外,它将作为下一个版本的一部分添加。DeepChek覆盖超过10,000 bp,其中包括与Deeplex共享的11种药物的一组稍微不同的基因(即。缺乏ahpC,GIDB.和ethA).NTM物种鉴定是不可能的,聚类分析仅限于抗性基因的信息,尽管这不是该软件目前的特点。ABL也在开发另一种基于TGen技术的靶向NGS分析方法[28].相比之下,Clemedi Tuberculoni检测旨在对100个基因进行分析,以扩大抗结核药物覆盖的数量,此外还可以区分NTM,并为聚类分析提供更好的分辨率。如此多靶点的扩增是否可靠,以及对大约20万bp进行测序的成本能否充分降到最低,仍有待观察(即。这相当于4.5%的基因组,而Deeplex约为0.3%)。类似的问题仍然存在于富集整个基因组的Medgenome Spit Seq分析玉米菌菌基因组使用分子诱饵[29].值得注意的是,作为unitaid资助的Seq&Treat项目的一部分,创新新诊断基金会目前正在对其中一些检测方法进行评估,以告知世卫组织可能支持它们。
结论
就像多功能瑞士军刀,Deeplex提供了前所未有的多功能性,直接从临床样本,代表了一个受欢迎的诊断和流行病学工具箱。然而,它不是一种接近病人的技术,是劳动密集型的,而且可能很昂贵。到目前为止,还没有一种适用于所有人的方法,常规诊断仍然依赖于手头任务的多种分析。然而,随着更便宜、更快、随机访问测序仪的引入,目标NGS的利基几乎肯定会扩大[30.].
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确认
我们感谢Vincent Escuyer和Vladyslav Nikolayevskyy分别澄清纽约和英格兰的诊断算法。SebastianDümcke,索非亚国莫姆克拉姆,弗普拉斯德,卡米拉罗德里格斯和Anita Suresh提供了有关各种有针对性的NGS测定的细节。
脚注
利益冲突:穆罕默德没有什么可披露的。
利益冲突:C.U. Köser报告了来自世界卫生组织、TB联盟、Becton Dickinson、QuantuMDx和创新新诊断基金会(包括为Cepheid Inc.和Hain生命科学工作)、Hain生命科学的其他(参加会议的旅行和住宿支持)、YD诊断公司的其他(合作)的个人费用。提交作品之外;是基因筛选公司的无偿顾问。
利益冲突:M. Salfinger没有什么可披露的。
利益冲突:W.Sougakoff没有任何披露。
利益冲突:S.K.Heysell没有披露。
支持声明:S. Mohamed得到NIH T32AI007046的支持。
- 收到了2020年11月4日。
- 接受2020年12月9日。
- 版权©2021人队