文摘
间变性淋巴瘤激酶(碱性)在肺腺癌基因重组导致激酶活性通道的crizotinib。虽然荧光原位杂交(鱼)是参考诊断技术、免疫组织化学(包含IHC)可以用作预审。
诊断的产量碱性包含IHC、鱼和定量逆转录酶聚合酶链反应在14日法国病理/分子遗传学平台进行比较。547肺腺癌标本进行分析使用5 a4和D5F3抗体,两个分开鱼探针和TaqMan包。临床病理的数据记录。
140个肿瘤碱性重新安排与≥15%的细胞重新排列(鱼)和400人碱性鱼- (< 15%)。鱼没有可判断的7例。碱性年轻患者(p = 0.003),主要是女性(p = 0.007)和轻型/非吸烟者(p < 0.0001)。13例包含IHC -但鱼≥15%,包括6例与鱼之间的15%和20%;八是包含IHC积极与鱼之间的10%和14%。为5 a4和D5F3敏感性和特异性分别为87%和92%,89%和76%,分别。假阴性包含IHC,观察到2.4%的情况下,鱼> 20%下降至1.3%。变异在36%的未被发现的碱性肿瘤。
不调和的鱼从10%到20%不等的细胞重新排列,中心相关的。包含IHC仍然是一个可靠的计划筛选方法碱性重排检测。
文摘
包含IHC在预审是有用的吗碱性重排,鱼确认诊断http://ow.ly/Iuu5j
介绍
肺癌被全球癌症死亡的主要原因,及其预后仍然显著差,只有15%时可切除的肺肿瘤的诊断。放疗和化疗与常规细胞毒性药物是唯一的选择,直到最近发现的“司机”致癌突变和令人鼓舞的结果和相应的靶向治疗。除了抑制表皮生长因子受体(表皮生长因子受体)由吉非替尼和埃罗替尼,crizotinib间变性淋巴瘤激酶(碱性)/遇见小分子抑制剂,有良好的临床反应和已通过美国食品和药物管理局(FDA)。在2007年代最初报道官方发展援助et al。(1),涉及的易位碱性(2 p23)和棘皮动物microtubule-associated蛋白质像4 (EML4p21)(2)基因检测2 - 7%的肺腺癌和负责一个常数和添加剂ALK-enhanced激酶活性有利于增殖,细胞骨架的变化、迁移和生存2,3]。碱性重组是互斥的表皮生长因子受体和喀斯特突变和多个针对有eml4 - alk描述了变异,所有涉及的外显子20碱性基因。最常见的是变异E13;表达A20(1)变体和E6a / b;表达A20(变体3 a / b),分别在33%和29%的患者(4]。其他合作伙伴EML4,如TRK-fused基因(过渡政府),驱动蛋白家族成员5 b (KIF5B1)或驱动蛋白轻链(KLC1),已报告(5,6]。患者碱性重新安排肿瘤是整体比其他的肺癌患者,年轻女性,从来没有——或者轻度吸烟者(< 10久)(6)和晚期肿瘤。在绝大多数的情况下,肿瘤与固体或腺癌腺泡的建筑和众多的图章戒指粘液性细胞(7,8]。
荧光原位杂交(鱼)是引用技术确认碱性重排,crizotinib因此fda批准在美国,碱性分解鱼作为同伴的诊断测试。然而,这项技术仍是时间和成本消耗和几个测试算法提出了世界范围内(9- - - - - -14通过免疫组织化学方法),有利于大规模事先(包含IHC) [7,15- - - - - -17]。本研究的目的是比较包含IHC使用5 a4和D5F3抗体(Abs)分解鱼和定量逆转录酶聚合酶链反应(存在),547年的一系列从14法国胸的手术标本病理部门和杜国家癌症研究所(印加)医院分子遗传学平台。本研究的目的显然是不进行流行病学分析碱性重排发病率,但提供的收益率的比较三种技术,评估14法国印加平台执行的能力碱性测试。
材料和方法
2012年3月至2013年9月,547 formalin-fixed和石蜡包埋手术标本收集来自14个胸印加医院病理部门和分子遗传学平台。1-13 13中心(中心)负责包含IHC和鱼,两个包含IHC,鱼和存在,只存在之一(中心14)。每个中心都有收集50例在1年左右。只有大型的标本中,为了有足够的材料来执行和比较这三种技术。此外,包含碱性重新排列情况下高度青睐达到统计学意义的比较三种技术。标本肺切除术,淋巴结,胸膜、心包活检以及肾上腺、皮肤、脑或肝脏转移手术活检或切除。
临床和组织学的数据
所有情况下,性别、年龄、烟草历史、阶段和类型的标本被记录。组织学模式根据2011年国际肺癌研究协会/美国胸科学会/欧洲呼吸学会分类肺腺癌(188bet官网地址18记录,以及筛状区域和印戒细胞的存在。甲状腺转录因子1 (TTF)和P63表达式,得到产品的阳性细胞百分比和染色强度(从1 + 3 +)也被评估。染色被视为积极当≥10%的细胞被染色。
包含IHC
根据当地协议在不同autostainers,两个单克隆Ab (mAb)反对克隆筛选融合蛋白被集中在他们自己的测试例:5 a4鼠标马伯(从三个供应商:Abcam,剑桥,英国;美国CA Novocastra,伯林盖姆;南特,Clinisciences法国)(由所有测试中心)和D5F3兔子马伯(亚利桑那州图森市Ventana医疗系统公司、美国)(测试中心除了中心2,7,8 - 10)。使用了三种类型的autostainers (Ventana医疗系统有限公司;安捷伦科技Dako丹麦,斯特鲁普、丹麦;意大利的佛罗伦萨,Menarini诊断)。D5F3 Ab,两个检测工具被使用:Optiview工具包为中心1、3、4、11和13;和其他的Ultraview装备中心。
染色模式(膜、胞质或膜和细胞质)记录;染色时视为积极≥10%的细胞染色强度与1 +。两个染色提出了分数和比较,一个经典(分数)造成的阳性细胞百分比的乘积和强度(从1 + 3 +)和其他(h值)定义为1×1 +(%细胞)+ 2×2 +(%细胞)+ 3×3 +(%细胞)。
鱼
两种分裂探针用于这项研究中,根据每个中心的经验:Vysis LSI碱性双颜色分开重排探针(雅培分子、Rungis快递、法国)是用于82%的病例和DAKO alaska airlines鱼DNA探针,分裂信号(DAKO、斯特鲁普、丹麦)。杂交的质量,恶性核分析,总数的比例每个融合(F),绿色(G)和红色的数量(R)信号观察(1,2,3,6 F 1 r1g1f xRxGxF)和重新安排核记录的百分比。一个碱性重排时被诊断为≥15%的核怀有一个分裂模式3′,5′间隔信号优于直径最大的信号,或孤立的3′(红色)信号(19]。超过最大的直径的距离信号被选为了考虑两个商业的事实碱性分开调查工具被使用,以及各种类型的荧光显微镜和鱼扫描数字化系统。
中存在
三个参考中心的存在(中心2、4和14)。针对有eml4 - alkTaqMan基因表达分析(费舍尔生活技术,佩斯利,英国)是用于检测V1, V3a / b, V2 E17;表达A20, V5和V7 (Hs03654558、Hs03654556 Hs03654557 Hs03654560, Hs03654559),以及RPL13A,用作参考(控制)基因。恶性肿瘤细胞的比例,提取RNA浓度、类型的变体,循环阈值(Ct)的参考基因和变异的记录。突变的数据有关表皮生长因子受体、喀斯特、HER2, BRAF和PI3KC也可用时记录。
统计分析
比较测试,用于定性数据,卡方测试,定量数据,方差分析测试。敏感性,特异性,包含IHC假积极性和假消极与鱼技术计算95%置信区间。之间的敏感性IHC-positive病例数FISH-positive案件;特异性是IHC-negative病例在FISH-negative病例的数量。假消极是IHC-negative和FISH-positive病例的数量在总人口中,虚假的积极性是IHC-positive和FISH-negative病例的数量在整个人口。
结果
研究的547例病例中,7例(1.3%)病例没有可判断的鱼,140 (26%)碱性重新安排细胞FISH-positive,≥15%,和400年(73%)碱性消极的鱼,< 15%的细胞重新排列。对25例,阳性细胞的百分比是接近积极性常用阈值(15%):在12例,阳性细胞的百分比范围从10%到14%,在其他13个情况下,阳性细胞的百分比范围从15%到20% (表1)。
碱性FISH-positive情况下
140年碱性艾滋病患者(积极性阈值≥15%),平均年龄是62岁,有一个女性优势(77(55%)的女性与63(45%)的男性)。31(22%)前任或现任吸烟者平均40包年烟草消费的人,11(8%)轻度吸烟者(≤15久)和64年(46%)是不吸烟的;烟草对34例(24%)病人习惯是未知的。总的来说,70%的碱性艾滋病患者来说,烟草是记录光或不吸烟者习惯。28(20%)处于阶段I和II在诊断时和77年(55%)在晚期(III和IV)(35个病人数据未知)(表2)。
标本主要是(52%)手术活检,外科切除术占41%。标本主要来自肺(52%),淋巴结(27%)和胸膜(13%),其余从大脑(n = 3;2%)、皮肤和软组织(n = 2;1.5%)和肝脏(n = 1;1%)。均值(范围)的恶性细胞比例为60% (10 - 100%)(表3)。
在组织学,碱性艾滋病患者腺癌主要是(代表≥50%的肿瘤)固体在46%的情况下,在36%,腺泡的乳头在12%,在6%,micropapillary lepidic 4%。筛状区域,代表≥10%的肿瘤,在19%的情况下被观察到。印戒细胞的存在是指出在29(21%)的情况下。TTF1表达涉及≥10%的肿瘤细胞中观察到肿瘤的93%,平均93%的阳性细胞百分比和平均染色强度为2.5。P63表达涉及≥10%的肿瘤细胞中观察到肿瘤的39%,阳性细胞的平均比例为50%,平均染色强度2 (表4)。
碱性包含IHC表达观察127年(91%)的140个FISH-positive病例(有关详细信息,请参阅部分不和谐的情况下七FISH-positive / IHC-negative病例),涉及到细胞的87%和92%,与平均染色强度2.3和2.6 5 a4和D5F3马伯,分别为(表5)。经典均值得分是213和h值是211 5 a4马伯,经典均值得分是255和D5F3马伯的h值是256。一个细胞质膜染色观察58例,和cytoplasmic-only染色观察别人。至少4例负5 a4但正与D5F3(涉及20 - 100%的细胞染色强度从1 + 3 +)和7例负D5F3但正5 a4(30 - 100%的细胞窝藏的染色强度1 + 3 +)(图1)。
关于鱼,意味着90肿瘤细胞核进行分析和重新安排的平均百分比(范围)细胞是63% (21 - 100%)(表5)。在58%的情况下,主要重排模式观察xRxGxF, 36%是1 r1g1f。
关于存在,RNA提取的平均浓度为139 ng·µL−1的意思是Ct碱性变异检测到35,参考基因的平均Ct是26日(表5)。50(36%)情况下没有检测到变异,33(24%)例怀有一种变体1(一个案例展示变体的组合1、2和3 a / b), 29(21%)例怀有一种变体3 a / b(7)与一个变体,9(6%)例呈现一个变种2、3(2%)例5变种,5例(4%)病例不解释和14例(10%)病例数据不可用。关于存在的分布数据,有一个中心作用,说明了图2。
在99例突变的档案记录,只有一个案例了喀斯特突变(见在线补充表S1)。
碱性FISH-negative情况下
关于400年碱性消极的患者(< 15%的细胞重新排列),观察男性的优势(233(58%)的男性与167(42%)的女性)和平均年龄是63岁表2)。最是烟民:200(50%)现任或前任吸烟者平均40包年消费的人,和96年(24%)是光或不吸烟者;为104名(26%)患者数据是未知的。在诊断时,146名(37%)阶段I和II,和174年在第三和第四阶段(43%);数据没有记录80例(20%)患者。
大多数碱性负样本源自肺(n = 284;71%),淋巴结(n = 41;10%)和胸膜(n = 36;9%);剩余的样本大脑(n = 22;6%)、骨(n = 2;0.5%)、心包(n = 2;0.5%)、皮肤和软组织(n = 2;0.5%)和肾上腺(n = 2;0.5%)转移。 291 (73%) were surgical resections, 71 (18%) were surgical biopsies and two specimens were cell blocks. The mean (range) percentage of malignant cells was 60% (5–100%) (表3)。
在组织学,碱性-腺癌主要是腺泡的在42%的情况下,固体在40%,乳头在16%,3%和3% micropapillary lepidic, 37例包含micropapillary > 5%的地区(表4)。筛状区域被发现在11%的情况下。印戒细胞中观察到只有5%的病例。TTF1表达式中观察到300(78%)例,阳性细胞的平均比例为80%,平均染色强度2.6。P63表达在肿瘤75例(22%),平均33%的阳性细胞百分比和平均染色强度为1.7。
碱性包含IHC表达观察42例5 a4 Ab和62例D5F3 Ab,但阳性细胞的平均比例分别为12%和25%,染色强度均值分别为1.7和1.2 5 a4和D5F3 Abs,分别。经典的均值和h值是81年和81年5 D5F3 a4和77年和81年(表5)。
关于鱼分析,意味着86核分析,重组细胞的百分比从0%到9%不等,平均为2% (表5)。
存在,提取RNA的平均数量是174 ng·µL−1和绝大多数(95%)的情况下,没有发现除了一个变体情况(版本1),既保持D5F3/5A4包含IHC和鱼负的。10箱,数据没有解释和没有对其他九例(表5)。
在256碱性阴性肿瘤突变数据可用,13 (5%)表皮生长因子受体外显子19删除,9 (4%)表皮生长因子受体21外显子突变,53 (22%)喀斯特突变,一个(0.4%)BRAFV600E突变,一个(0.4%)HER2突变和5 (2%)PI3KCA突变(在线补充表S1)。
不和谐的情况
25例提出了10 - 20%的肿瘤细胞重新排列(表6)。12例中有10 - 14%的细胞重新排列,八被包含IHC正面和两个变体1或3中存在。13例中鱼介于15%和20%的重组细胞,6例被包含IHC -与Abs (5 a4和D5F3);的,四个被存在消极,有一种变体1,在一个案例中,存在的结果目前还不清楚。7例鱼显示重组细胞被包含IHC - > 20%;重新安排细胞的百分比分别为22%,30%,40%,54%,60%,70%和92%。4 7例(57%)来自一个中心,中心10;其他三个病例分布在中心6、11和13。两个怀有一种变体1。总的来说,在13个鱼+/包含IHC- - - - - -情况下,8(62%)来自中心10;其他五个病例分布在中心4、6、11和13所示。该中心效果了图3根据Abs,显示不一致的分布,每个中心包含IHC和鱼的结果。在线辅助表S1细节患者的特点碱性重组或不和谐的包含IHC /鱼数据及其应对crizotinib时可用。
统计分析
总的来说,统计差异被发现有关女性的优势碱性艾滋病患者(p = 0.007),年轻的年龄(p = 0.003),烟草消费降低(p < 0.0001),晚期(p = 0.003),和样本的分布(p < 0.0001)。没有观察到的统计差异碱性阳性和阴性肿瘤组织学,除了有小孔的地区,印戒细胞,这是最频繁的碱性阳性的肿瘤(p = 0.001, p < 0.0001,分别)。TTF1和P63表达水平也显著提高碱性阳性的肿瘤(p = 0.0001, p = 0.0008)。
与积极性阈值包含IHC和鱼的10%和15%,分别5 a4克隆敏感性为87% (95% CI 79 - 92%)及其特异性为89% (95% CI 85 - 92%)。5 a4包含IHC的假消极与鱼是3% (95% CI 1 - 5%)和虚假的积极性为9% (95% CI 6 - 11%)。D5F3克隆敏感性为92% (95% CI 83 - 97%)及其特异性为76% (95% CI 70 - 82%);虚假的消极D5F3包含IHC与鱼是2% (95% CI 0 - 4%)和假积极为18% (95% CI 14 - 23%)。总的来说,通过结合两种Abs,获得的数据包含IHC的假消极与鱼是2.4%,错误的积极性是20%。然而,如果鱼从10%到20%不等的情况下不考虑,包含IHC的假消极会下降到1.3%。
讨论
目前的研究是第二个最大的研究到目前为止碱性重组腺癌在法国白人患者(20.]。然而,我们的研究并不能反映碱性重排流行病学或印加分子遗传学的常规实践平台,只作为本研究的目的是评估使用的三种技术的产生碱性重排检测和评估多个平台执行的能力碱性测试使用自己的协议和设备。14胸专家病理学家和分子生物学家在病理工作部门和分子遗传学分析平台在法国领土547肺腺癌手术标本使用碱性包含IHC和鱼。存在分析也与此同时执行由三个有经验的实验室。我们的系列故意丰富碱性重新安排情况和手术标本,为了有足够的材料来比较三种技术和限制小样本的数量。我们强调的角色包含IHC预审方法检测碱性重排,表明鱼需要严格和均匀评估和解释,尤其是在边缘案例窝藏10 - 20%的细胞重新排列。
我们确认此有关的文献碱性艾滋病人口(6,7,21- - - - - -23),碱性病人比其他肺癌患者年龄更小,最常见的妇女和非或轻度吸烟者。然而,22%的病例以前或现在吸烟者,与一个病人吸烟60久,证实吸烟习惯不是一个可靠的标准来预测或排除碱性重排。我们的病人更频繁地在晚期碱性消极的病人,但我们的系列是有偏见的手术标本的多数肺切除术,患者进行疾病诊断的时间有限。我们没有注意到更多的大脑或浆液性转移,由我们的样本选择又有偏见。
关于组织学,虽然碱性艾滋病与固体肿瘤最常呈现模式,没有相关的典型模式碱性重排。然而,正如先前报道(8),筛状和印戒细胞种类丰富,特点碱性肿瘤,观察近20%的肿瘤,但没有具体的,因为他们也观察到5%的碱性消极的肿瘤。碱性阳性的肿瘤更经常TTF1积极比碱性消极的肿瘤,但有些TTF1消极;因此不应使用这一标准来选择腺癌是由鱼进行测试。碱性阳性的肿瘤也P63积极,2 +的平均强度,但这并不具体。不幸的是,我们没有评估P40表达式,这种蛋白质被报道比P63鳞状分化,更具体的,我们并没有测试碱性关于P63扩增阳性的肿瘤。
127的140碱性FISH-positive肿瘤被包含IHC坦白说积极的5 a4或D5F3 Abs,我们没有看到任何差异使用经典的或Abs的h值。在389年碱性细胞-肿瘤< 10%的重新安排的鱼,95也沾染了5 a4或D5F3 Abs, 12 - 25%的阳性细胞1 +和2 +之间的强度。使用的两种Abs显示类似的敏感性和特异性,即使D5F3略少具体但更敏感。背景染色与D5F3 Ab已经报道的制造商,可能与酪胺放大所使用的几个中心,的确表现出比例最高的虚假的积极性。然而,我们应该指出,我们研究初D5F3商业化和病理学家现在意识到不考虑非特异性粘液染色。同时,可以说没有偏见包含IHC过度诊断的病例的筛选策略,当重组进一步证实了鱼,也有越来越多的证据表明,在文献碱性IHC-positive但可以先后被crizotinib FISH-negative肿瘤。例如,2014年,只有积极通过包含IHC展示了一个非常奇特的重排非常小的插入,不能检测到鱼但被测序显示(24]。只有7例不解释的鱼,而高达20%的鱼失败是在文献中报道,由于技术问题和样本限制。通过研究手术标本包含平均只有60%的肿瘤细胞,因此我们non-interpretable鱼的数量有限样本问题。所有情况下,意味着90细胞分析鱼的数量,与C协议amidgeet al。(19)推荐至少60细胞的分析。
关于140年碱性重新安排肿瘤≥15%重新排列的细胞,只有13被包含IHC不积极。这代表了2.4%的情况下,如果边缘鱼1.3% 15%和20%之间不考虑。8(62%)例13的鱼+/包含IHC−来自相同的中心。两个鱼+/包含IHC−变体1的情况下,存在被存在了。总的来说,我们的冲突率远未报告的Cabillicet al。(20.]。这之前的研究中,基于两个法国分子遗传学的日常实践平台,报道一个非常低的水平阳性病例由鱼和包含IHC(80(53%)的150个),达到59%(80 135)如果noncontributive病例被排除在外。在这项研究中,作者报道36不整合FISH-positive和IHC-negative病例3244例与此同时由两种技术进行了分析。然而,在这项研究中,通过仔细11碱性鱼+/包含IHC−例(150 FISH-positive病例的7%)也变异了表皮生长因子受体和喀斯特基因,而没有鱼+/包含IHC+例co-mutated这些基因。7%是一个很高的,因此怀疑率,以前从来没有在文献中报道。相比之下,在多中心系列我们发现只有一个140,怀着一个喀斯特突变相伴的碱性重排。研究的另一个问题点abillicet al。(20.大量的鱼+/包含IHC−例窝藏15 - 20%的细胞重新排列的鱼,特别是在一个中心,提出了17例15 - 20%的细胞重新排列的共有23所示碱性鱼+/包含IHC−。总的来说,Cabillicet al。(20.)报道,34 (23%)FISH-positive肿瘤与一条鱼从15%到20%不等的150 FISH-positive肿瘤,而我们只找到6个(4%)这种情况下的140年。
由于这些不和谐,虽然清楚地证实了阈值的15%重新排列细胞临床重要的Camidgeet al。(19),我们还分别分析了肿瘤与鱼数据从10 - 14%和15 - 20%。在我们的研究中,13例中15 - 20%的细胞重新排列的鱼,七是包含IHC积极和六是包含IHC -,和12例中10 - 14%的细胞重新排列的鱼,八是包含IHC积极和四个消极;这意味着大多数冲突发生在边缘区域重组细胞的10 - 20%的鱼,我们必须仔细检查这样的结果和权衡的结论。此外,在这项研究中,Cabillicet al。(20.),我们还观察到一个“中心效应”有关的分布不一致的情况下,一个中心呈现八13的鱼+/包含IHC−情况下,因此收集62%的不调和。
不幸的是,在我们的“边缘性”或不和谐的情况下,存在没有歧视性。总的来说,存在与≤36%的病例没有变异检测没有说服力碱性在常规情况下诊断在不和谐的情况下并没有帮助。这种低的变异检测可能是由于罕见的变异针对有eml4 - alk重排不被使用的引物,或涉及基因以外的罕见的易位EML4。质量差的也可能是有关的一些标本和RNA提取formalin-fixed和石蜡包埋组织,尽管我们决定只分析外科肿瘤标本有足够的材料,导致140 - 175 ng·µL的提取−1每个标本的RNA。当检测到,大多数变异都1和3 a / b,在文献中报道,其他的变种2(9例),5(3例),7(1例);两例怀有两个或三个变体。这一发现迄今尚未公布,需要确认在其他更大的系列。当只有一个1在一个其他的变体碱性消极的肿瘤,这种技术的特异性仍然很高,但其敏感性低于包含IHC和鱼,有36%的假阴性结果。存在是有用的在极少数情况下non-interpretable鱼结果,确认在两例IHC-positive变体1和2的存在。在我们的系列中存在的敏感性低于先前所描述的文学,在只有12%的假阴性结果报告(25),敏感性和特异性范围从94%到100%,这是比得上包含IHC或鱼(25- - - - - -28]。然而我们的结果不同于一个实验室转移到另一个,我们也注意到一个中心效应对存在的结果。
总之,我们的多中心研究表明,法国14印加分子遗传学平台涉及了类似的结果,即使他们之间的不整合技术和一些解释确实存在,往往依赖中心。这项研究还恳求包含IHC预审是常规做法,与鱼的确认碱性重排(图4)。我们的研究也表明,即使对专家胸病理学家和分子生物学家,不整合或边缘鱼和包含IHC数据的解释是一个问题,需要严格的准则和建议。
脚注
可以从本文的补充材料www.qdcxjkg.com
支持声明:本研究从辉瑞公司支持的一种无限制的补助金。为这篇文章一直存放在资助信息FundRef。
利益冲突:披露可以找到与本文的在线版本www.qdcxjkg.com
- 收到了2014年6月30日。
- 接受2015年1月6日。
- 版权©2015人队