摘要
先前关于甘露糖结合凝集素途径缺陷与侵袭性肺炎球菌病之间关系的研究尚无定论肺炎链球菌依赖于血清型。我们旨在确定侵袭性肺炎球菌病与MBL2和MASP2关于血清型分布的遗传变异。
2002年6月至2003年11月,对莫桑比克农村住院的儿童进行了一项基于医院的病例对照研究。该研究包括患有侵袭性肺炎球菌病住院的儿童,其中肺炎链球菌从血液中分离,随后进行血清分型。覆盖多态区扩增子的序列分型分析MASP2(外显子3)和MBL2(启动子和外显子1)。
一个整体的高频率的MBL2发现与低血清MBL水平(43%)相关的基因型。MBL缺陷基因型携带者与低侵袭性血清型产生的侵袭性肺炎球菌病相关(OR 5.55,95%可信区间1.4-21.9;p=0.01)。
我们的数据表明,MBL缺乏患者对肺炎球菌疾病的易感性可能受到血清型侵袭性的影响。型特异性荚膜血清型肺炎链球菌需要在侵袭性肺炎球菌病的进一步遗传相关性研究中加以考虑。
侵袭性肺炎球菌病(IPD)是全世界儿童发病和死亡的主要原因,每年造成多达100万人死亡,其中大多数在发展中国家1..发展IPD的已知风险因素是年轻、营养不良、过度拥挤和HIV-1感染,所有这些在撒哈拉以南非洲国家都非常普遍2..此外,肺炎球菌引起侵袭性疾病的能力高度依赖于荚膜血清型3., IPD病例血清型流行率因地理区域和年龄的不同而有很大差异4..除撒哈拉以南非洲地区外,IPD的遗传危险因素主要集中在先天性甘露糖结合凝集素(MBL)缺乏上,但没有明确的结论5.–7..
MBL是补体激活凝集素途径的识别模块之一。MBL识别广泛微生物中发现的特定碳水化合物部分8..MBL可以通过激活MBL相关丝氨酸蛋白酶(MASPs)来促进直接调理和吞噬作用或补体介导的溶解。9,10三个位于外显子1的非同义单核苷酸多态性(SNP)已被描述:Arg52→Cys(D变体(rs50307370),Gly54→Asp(B变体(rs1800450))和Gly57→Glu(C变异体(rs1800451))。野生型变异体被视为A变异体,其他结构变异体在本文中被称为0。所有这些变异体都会损害MBL低聚化,这对于与MASP结合和达到完整功能活性至关重要11此外,启动子区域-550(G→C、 H/L(rs11003125)),-221(G→C、 X/Y(rs7096206))和非翻译区+4(P/Q(rs7095891))影响MBL2转录,具有X等位基因的显性下调作用12. 启动子和外显子1处的SNP处于强连锁不平衡状态,并产生有限数量的流行单倍型:LYPA、LYPB、LYQA、LYQC、HYPA、HYPD和LXPA,可预测MBL血清水平12. MBL单倍型在全世界的分布因种族不同而不同,LYQC仅在撒哈拉以南非洲人群中出现高频率12MBL缺乏与广泛的感染性和非感染性疾病有关,特别是在儿童中13.
MASP-2是与MBL最相关的丝氨酸蛋白酶14.在白种人中发现了CUB-1区域密码子105 (Asp→Gly (rs56392418))的频繁非同义氨基酸替换,并与严重免疫缺陷有关15.我们进行了一项病例对照研究来调查两者之间的联系MBL2和MASP2变异和儿童IPD,考虑血清型分布。这项研究是在莫桑比克南部一个IPD发病率高的农村地区(每10万名高危儿童中有416名)5岁以下的儿童中进行的16.
材料和方法
人口与研究地点
该研究由曼希萨地区医院(MDH)的调查中心(CISM;莫桑比克马普托)进行,该医院拥有110张病床,包括26张儿科病床;该医院是莫桑比克南部马普托省农村地区曼希萨区的转诊医疗机构。在研究期间,Manhiça区估计有13万居民,具有同质种族(西隆加和西昌加纳)。研究地点的详细信息已在其他地方描述17.简单地说,该地区的气候是亚热带气候,有两个明显的季节:11月至4月之间是温暖的雨季,其余时间是凉爽的旱季。疟疾全年流行,在12月至3月之间达到高峰。在研究期间,怀孕女性中HIV-1感染的患病率为19%(未发表的数据)。
临床监测和样本收集
自1997年1月以来,医务卫生署和儿童保健中心联合对所有儿科门诊就诊和所有病房入院进行了24小时监测16。入院时,一名受过培训的医务人员填写了一份详细的临床调查问卷。从发烧儿童(腋窝温度)身上采集了手指穿刺血样,用于在薄血和厚血涂片中检测疟疾寄生虫≥作为常规临床实践的一部分,所有年龄<2岁的儿童和腋窝温度>39℃的较大儿童在入院时进行血液培养。
本研究经莫桑比克伦理审查委员会(莫桑比克马普托卫生部)和Clínic医院伦理委员会(西班牙巴塞罗那)批准,并获得合格儿童家长或导师的书面知情同意。
变量定义
患有IPD的儿童被定义为接受MDH治疗的患者,其中肺炎链球菌是从血液中分离出来的。
呼吸频率增加(IRR)根据年龄组定义为呼吸频率:>60次呼吸·分钟−1.对于2个月以下的儿童;>50次呼吸·分钟−1.适用于2-12个月大的儿童;呼吸次数>40次·分钟−1.适用于1-5岁儿童18根据这一定义,当儿童因咳嗽或呼吸困难以及IRR或胸腔内缩入院时,诊断为临床肺炎18根据PCV水平将贫血分为轻度(PCV 25-33%)、中度(PCV 15-24%)或重度(PCV<15%)。如果体重z评分为≤ -3.sd,中度营养不良,体重z值为-2–-3sd19.恶性疟原虫当观察>200白细胞后,在血液中发现一种或多种无性寄生虫时,就定义为感染。临床疟疾的定义是,根据年龄,发烧加任何恶性疟原虫寄生虫血症(婴儿)或>2500寄生虫·mm−3.(其他儿童)。雨季被认为是11月至4月之间,旱季被认为是日历年的其余时间。死亡率的定义是:在医院发生的特定疾病的死亡人数除以已知结局的儿童人数(死亡加出院)。最终结局不明的儿童,如转院或潜逃的儿童,不包括在死亡率测量中。
根据以前的报告定义了编码MBL高(A/A,XA/A)、中(A/0,XA/XA)和低(0/0,XA/0)血清水平的基因型12,20–22. 具有这些基因型的个体将被称为MBL充足或MBL缺乏(分别为中度和重度)。
高侵入性血清型肺炎链球菌根据先前包括血清型1、4、5、9V、12F和14的报告,被认为是估计发病率>20的血清型23.
研究设计
我们对2002年6月至2003年11月间接受MDH的5岁以下儿童进行了病例对照研究。随机选取同时期入院且无肺炎临床症状或体征且入院时血细菌培养阴性的儿童作为对照,每2个对照中有1个研究病例。匹配标准如下:1)年龄(>1岁儿童的频率±6个月,1岁以下儿童的频率±2个月)和2)入院时的季节(旱季或雨季)。病例按血清型进行分层肺炎链球菌(高侵入性与low-invasive)。
实验室方法
MBL2和MASP2基因分型
使用商业试剂盒(Qiagen DNA血液试剂盒,Qiagen, Valencia, CA, USA)从生物样品中提取和纯化DNA。一个969 bp的片段包含启动子到外显子1的末端MBL2基因通过PCR扩增,使用意义5 ' -GGGGAATTCCTGCCAGAAAGT-3 '和反义5 ' - catatccccaggcagtttcccc -3 '引物和Expand™20kbPLUS PCR系统(罗氏诊断公司,曼海姆,德国)。外显子3 354 bp片段MASP2基因PCR扩增使用意义5 ' -GCGAGTACGACTTCGTCAAGG-3 '和反义5 ' -CTCGGCTGCATAGAAGGCCTC-3 '寡核苷酸和Expand™高保真PCR系统(罗氏诊断公司)。
用于放大两种材料的循环条件MBL2和MASP2基因温度为94°C持续8分钟,35个周期的94°C持续45秒,58°C持续30秒,72°C持续90秒,72°C持续10分钟。5μL产生的PCR反应用ExoSAP IT处理(美国俄亥俄州克利夫兰USB公司)然后使用上述正反义基因特异性引物和BigDye Terminator v1.1循环测序试剂盒(应用生物系统)进行直接测序。测序反应在ABI Prism 3100遗传分析仪(英国沃灵顿应用生物系统公司)上进行。
统计方法和计算分析
描述性结果以比例或平均值表示±sd,视需要而定。卡方统计用于比较2×2表关联或较大表中的趋势,当数字较低时(一个类别中<5),使用Fisher精确检验。在比较两个连续变量时,使用非配对t检验。我们对多变量分析进行logistic回归分析,并对不同结果组(高侵袭性血清型病例和低侵袭性血清型病例)进行多层面logistic回归分析,计算OR和95%CI。最终的逻辑回归模型包括设计变量(年龄和季节)和原始分析后具有显著相关性的变量。估计每个变异位点的等位基因和基因型频率以及Hardy–Weinberg平衡。当p≤0.05. 使用ClustalW软件(英国剑桥欧洲生物信息学研究所)进行多序列比对。数据采用STATA 10.0软件包(美国德克萨斯州大学站STATA公司)进行分析。
结果
描述性的结果
185名儿童(64名病例和121名对照组)符合研究条件。共扩增了161份样本进行分析MBL2对173份样品进行了扩增分析MASP2(回收率为87%MBL294%的人是女性MASP2由于DNA质量差,分别有24份和12份样本未扩增。总共有55例(86%)和106例对照组(88%)都有扩增MBL2和MASP2基因分型结果。平均值±sd年龄为26.4±15.8个月,约半数患者为男性(51%),研究病例中营养不良和死亡率更高(45%)与27%,p=0.01和11与2%,分别为p=0.02)。疟疾主要在对照组中诊断(69%),因此,寄生虫病在对照组中更为普遍。表1提供病例和对照组变量流行情况的完整描述。
有和没有基因分型数据的儿童在所有研究变量中没有差异表1.总的来说,161名儿童中有70名(43%)具有导致低MBL缺陷的基因型,161名儿童中有19名(12%)具有与严重缺陷相关的基因型(10名包括结构突变的单倍型纯合子,9名LXPA单倍型结合LYQC单倍型杂合子)。整个样本A/C (p = 0.48)、H/L (p = 0.26)、p /Q (p = 0.82)、Y/X (p = 0.13)以及对照组(p = 0.33、p = 0.08、p = 0.93和p = 0.28)的等位基因Hardy-Weinberg平衡是保守的。67名儿童(38.7%)携带非同义基因MASP2变体。对疾病的完整描述和患病率MASP2多态性和MBL2其他地方也报道了发现的基因型25.
IPD和MBL途径变异
在研究儿童中,IPD与MBL缺乏症(OR 1.44,95%可信区间0.6-3.6;p=0.4)或MASP2变异(或1.59,95%可信区间0.6–3.9;p=0.3),即使在检查不同暴露组(严重MBL缺陷)时也是如此与正常(p=0.4)或中度MBL缺陷与正常(p=0.2))或分析不同MASP2单独变体。
IPD和MBL缺乏根据血清型分布
根据血清型分布进行的分析包括64例(73%)病例中的47例,这些病例有可用的血清型和血清学数据MBL2基因分型。MBL缺乏症的血清型分布如表2.总体而言,21例是mbl缺陷(18例中度缺陷,3例严重缺陷),29例是高侵袭性血清型感染。最终logistic回归模型显示,MBL缺陷在由低侵袭性肺炎球菌血清型引起的IPD个体中比对照组更普遍(OR 3.93, 95% CI 1.1-14.5;p = 0.04)。
在高侵袭性血清型引起的IPD病例和对照组之间,MBL缺乏的患病率没有差异(OR 0.82,95%可信区间0.3-2.2;p=0.7)。
当根据MBL缺陷(中度和重度)对数据集进行分层时,在单因素和多因素分析后,低侵袭性血清型感染的中度MBL缺陷个体的结果仍然显著(OR 3.56, 95% CI 1.1 -.11.2, p = 0.03, OR 5.55, 95% CI 1.4-21.9, p = 0.01)。只有2例低侵入性血清型感染有严重缺陷。此外,所有感染低侵入性血清型(n = 8)的婴儿(1岁以下儿童)携带mbl缺陷基因型(8 / 8)与10人中有4人;p=0.001)。表3和4.显示了根据高侵袭血清型和低侵袭血清型分别分层的单变量和多变量分析数据。克服中间血清型(攻击比为>20但CI大,包括截断值为20 (4,9v和12F;N = 6),我们进行了额外的分析,排除或分类为低侵袭菌株。我们在这个附加分析中没有发现任何显著的变化(p = 0.03)。
当比较具有高度侵袭性血清型的病例时与低侵袭性血清型,按MBL基因型分层(充分、中度缺陷和严重缺陷),我们发现趋势几乎显著的p值(p=0.054),表明根据MBL缺陷的程度,易感性增加(图1).分析时未发现关联MASP2变体与MASP2具有IPD和血清型侵袭性的野生型(表3和4.).
讨论
我们的分析结果提出了一个假设,即儿童血清型特异性IPD可能受MBL缺乏的影响。与MBL充足的儿童相比,MBL缺乏的儿童可能更容易感染低侵袭性血清型,但不易感染高侵袭性血清型。obse支持了这一假设的合理性认为调理素活性已被证明影响细胞内转运和杀死肺炎链球菌通过人肺泡巨噬细胞26.高侵袭性血清型逃避调理吞噬作用的能力可能是主要的策略。相反,与真正的主要病原体相比,低侵袭性血清型需要易感宿主因素(如MBL缺乏)才能致病(即高侵袭性血清型),受任何光声吞噬功能缺陷的影响较小。与低侵袭性或机会性血清型相比,高侵袭性血清型独立于其他共病27.
如果MBL缺乏与IPD之间的关联取决于血清型的侵袭性,那么在一项进行良好的研究中观察到关联的机会(在最终分析中不考虑血清型的分布)在很大程度上取决于不同血清型的患病率。关联可能会被稀释,在大型研究中会发现意义。这可以解释以前发表的研究中未考虑血清型分布的不一致发现5.–7..此外,有报道称,MBL缺乏的表现在幼儿更为突出,因为幼儿的免疫系统还不成熟28. 在感染低侵袭性血清型的婴儿中,MBL缺乏的受试者人数过多,这一观点得到了支持。
或者,HIV感染可以解释观察到的MBL缺乏与低侵袭性血清型之间的关联。HIV已被确定为肺炎和IPD的一个重要危险因素2.,29.来自该医院的最新数据显示,2005年3月至2006年因严重肺炎入院的2岁以下儿童中,艾滋病毒感染率为26%30.考虑到肺炎链球菌是儿童重症肺炎的主要原因,我们可以假设,在我们研究的病例中,艾滋病毒感染的流行率将是显著的。MBL缺陷基因型已被证明影响HIV感染的垂直传播和AIDS进展,以及HIV感染儿童的AIDS进展31.与其他儿童相比,HIV感染者可能对低侵袭性血清型具有更高的易感性。因此,MBL缺乏症和低侵袭性血清型之间的关联可能会被HIV感染所混淆。然而,HIV的贡献应该随着年龄的增长而减少,对于年龄较大的病例(5-15岁)来说是微不足道的,因为当该年龄组缺乏治疗时,HIV感染儿童的死亡率很高。这可能解释了婴儿(1岁以下儿童)MBL缺乏症的过度表现受低侵袭性血清型感染。需要进一步研究来探索这一假设,因为本研究中未包括儿童的HIV数据。
总之,我们的结果表明,儿童IPD的血清型侵袭性可能受到MBL缺乏的影响。这一观察结果符合IPD的生理病理学和流行病学的现有知识,可以解释以前研究的非结论性结果5.–7.,并可启发未来IPD和遗传危险因素的研究。考虑到我们设计中提到的局限性(如数量少、缺乏艾滋病毒数据和基于医院的控制来源),进一步的研究是必要的,以确认这些发现,并确定这些结果是否可以外推到其他地理区域。
致谢
作者希望感谢CISM和MDH(莫桑比克马普托)的实验室和临床工作人员在收集和处理临床样本方面所起的作用。我们感谢A.Andrés、A.Ramírez Soriano和J.Bertranpetit(西班牙巴塞罗纳庞贝法布拉大学生物进化研究所)、V.Moreno和K.Louie(西班牙洛布雷加特医院加泰罗尼亚肿瘤学研究所)和J.J.Aponte(西班牙巴塞罗那巴塞罗那国际卫生研究中心),感谢他们的建议和贡献。
脚注
有关编辑评论,请参阅第712页.
支持声明
本研究由2009年SGR 911、Ciber de Enfermedades呼吸器(Ciberes CB06/06/0028)资助,Ciberes是ISCIII的一项倡议。F.Lozano和B.Suárez的工作由西班牙传染病研究网络(REIPI;RD06/0008/1013)资助。这项研究的初步结果发表在2006年美国胸科学会会议(2006年5月)上。A.Roca的工作得到了西班牙科学和创新部的资助(Ramón y Cajal:RYC-2008-02777)。
感兴趣的语句
没有宣布。
- 收到2009年10月29日。
- 认可的2010年1月27日。
- ©2010年版权所有