文摘gydF4y2Ba
尽管越来越多的患者患有慢性破坏性的肺部疾病,除了移植没有有效的治疗选择。了解生理和再生牙槽分隔作用的机制是先决条件的发展再生治疗肺。我们比较肺产后阶段基因表达的诱导和支气管胸膜alveolarisation识别监管基因两个过程。gydF4y2Ba
我们进行全基因组芯片筛查新生儿和pneumonectomised老鼠出生后肺1和3天或手术。选定的候选人被实时PCR验证,免疫印迹gydF4y2Ba原位gydF4y2Ba杂交。gydF4y2Ba
我们发现58个基因在两个模型与40个候选人被监管同样改变。这些基因参与生长和分化过程。此外,免疫系统、结构分子,呼吸链,信号转导和新陈代谢。一些候选人不与特定功能。观察最高监管一致性(pro)不同亚型的胶原蛋白分子,弹性蛋白和elastin-associated蛋白fibrillin1被共同地调节。gydF4y2Ba
我们的研究结果并不完全支持一个共同的调节机制产后和成人alveolarisation的感应,但两者的交集模型中的某些候选人承诺进行进一步调查。gydF4y2Ba
慢性破坏性的肺部疾病,gydF4y2Ba如。gydF4y2Ba纤维化、肺气肿和慢性阻塞性肺疾病,已经成为越来越多的问题在今天的肺药。严重的肺结构的改变导致不断增加感情的气体交换效率和生活质量的持续损失。尽管患者的数量正在增加,还有很少的治疗选择抑制或者至少减速组织退化和重组过程。通常唯一的“治愈”是肺移植,其固有的急性和慢性并发症。gydF4y2Ba
因此,策略来克服患者的肺组织损伤激活内源性再生项目将是理想的。据我们所知,这通常不发生在人类,但肺补偿性增长的现象,这是一个重新启动的肺组织形成成熟的个体,已经被证明在许多哺乳动物模型,gydF4y2Ba如。gydF4y2Ba小鼠、大鼠、狗和兔子gydF4y2Ba1gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba3gydF4y2Ba。在这些动物,表明单侧肺切除术并没有紧随其后的是一个简单的emphysema-like体积膨胀,但是,真正的肺泡生长和neo-alveolarisation重组的切除组织。组织再生已被证明是完全的兔子、老鼠和老鼠。在狗的模型中,切除前需要超过一个阈值> 50%起始的补偿性增长。所有的动物产生足够的表面积为保证正常生活,即使在身体压力gydF4y2Ba4gydF4y2Ba。一组展示了一种再生∼50%的切除残余肺的肺泡单侧肺切除术后20天的老鼠gydF4y2Ba5gydF4y2Ba。报告的模型肺组织回归和再生,马萨罗gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba显示老鼠的能力完全再生肺泡表面积减少卡路里限制期间,再次显示出一个固有的再生潜力也在不同的情况下。gydF4y2Ba
这些研究结果与推测人类肺增长的重新启动刺激或抑制相应的基因通路。搜索这些候选人,我们执行全基因组RNA表达在两个不同的鼠标屏幕肺生长模型和分析的数据作比较,或表达下调的基因,应该有一个高概率为肺泡分隔作用的重要元素。有了这个打算,我们调查了新生鼠的基因表达发生alveolarisation和成人10周大动物的生理步骤进行补偿肺切除左肺后增长。产后肺相比成年老鼠和支气管胸膜组织与sham-operated动物。我们选择一个小鼠模型,连续执行的可能性与转基因动物研究分析某些候选基因的生理作用是最发达的老鼠。gydF4y2Ba
材料和方法gydF4y2Ba
动物gydF4y2Ba
所有实验的指导方针好的动物实践吉森大学(德国吉森)和地方当局批准的动物实验。我们使用成年人(年龄在10周)和新生儿(P1或P3) C57BL / 6 n小鼠的男女,从查尔斯河购买(Sulzfeld,德国)。gydF4y2Ba
全肺切除术gydF4y2Ba
赔偿肺生长实验,成年老鼠的左肺切除如前所述gydF4y2Ba7gydF4y2Ba。总之,动物是使用3.5毫升·公斤犀牛gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba2:1:1混合物的0.9%氯化钠溶液和麻醉学的克他命(Ketavet®;辉瑞、德国卡尔斯鲁厄)和甲苯噻嗪(Rompun®;拜耳勒沃库森,德国)为一个单一的腹腔内注射。消毒和剃须后,小鼠气管插管(21-gauge防止损伤的套管)和通风(MiniVent老鼠呼吸机;雨果•萨克斯Elektronik March-Hugstetten、德国;150×200μL·敏gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba)。皮肤、肌肉和脂肪组织是雕刻在左边第五肋间隙。打开后的胸膜,左肺被抬出了胸腔。随后,剩下的部分门与丝绸和6/0的结扎肺切除。关闭胸腔和皮肤后,机械通气是终止发作的自主呼吸。所有动物的皮下注射1毫升0.9%氯化钠液替换。在复苏的日子,老鼠使用抗生素治疗(1毫升上边®(拜耳)/ 500毫升饮水)以及subcutanous止痛剂(buprenorphin,每天两次)。gydF4y2Ba
sham-operated老鼠,整个执行治疗相同,但不结扎和叶切除术。gydF4y2Ba
制备肺gydF4y2Ba
老鼠牺牲与过量的异氟烷(巴克斯特,Unterschleissheim,德国)。气管切入,插管。第二个插入肺动脉插管。左心室的顶点是切入,肺冲了20毫升的0.9%氯化钠溶液的恒压25而言不啻gydF4y2Ba2gydF4y2BaO与氮气膨胀gydF4y2Ba通过gydF4y2Ba气管。后来,器官摘除,并立即在液态氮冷冻。在新生鼠,冲洗了一根针gydF4y2Ba通过gydF4y2Ba右心室。gydF4y2Ba
RNA提取gydF4y2Ba
从整个肺隔离总RNA, 10μm cryosections高达100毫克的组织细胞溶解在1毫升peqGOLD TriFastgydF4y2BaTMgydF4y2Ba解决方案(peqLab Biotechnologie GmbH,埃朗根,德国)。添加200μL氯仿之后,15秒摇晃,5分钟孵化在室温下,样本离心机20000×gydF4y2BaggydF4y2Ba(15分钟/ 4°C)。结果被转移到一个新的阶段管上部和1:1混合与乙醇(70% /卷卷)。RNA净化,我们使用了RNeasy迷你包(试剂盒、希尔登,德国)制造商的指示。gydF4y2Ba
RNA数量测量使用NanoDrop nd - 1000(费舍尔科学、Schwerte、德国);质量评估与安捷伦2100生物分析仪(安捷伦,Boeblingen,德国)。gydF4y2Ba
微阵列分析gydF4y2Ba
背景gydF4y2Ba
我们使用微阵列发现大约有44000种不同的探针互补可以绑定在一个高度sequence-specific方式。我们总是杂交相同数量的一个控制(成人,虚假的)和一个实验样本(产后,对象)相同的芯片,被贴上了一个红色的,另一个绿色荧光染料。在相同的表达式(gydF4y2Ba即。gydF4y2Banonregulation),斑点出现在黄色;否则,他们变得或多或少的红色或绿色,表明监管变化的方向控制的互补。通过计算表达式的比率,我们能够生成上下文相关的监管档案。gydF4y2Ba
实验设计gydF4y2Ba
概要文件是由基因差异表达的双重色彩杂交比较1)成人的表达谱gydF4y2Ba与gydF4y2Ba产后第1天(P), 2)成年人gydF4y2Ba与gydF4y2BaP3, 3)骗局gydF4y2Ba与gydF4y2Ba支气管手术一天(S) 1, 4)骗局gydF4y2Ba与gydF4y2BaS3。每组由18个人。总RNA从每组6个人池标签之前,导致三个样本对阵列杂交。每一对标签和杂交dye-swap方式(技术复制),导致24数组。gydF4y2Ba
标签gydF4y2Ba
Cy-labelled cDNA生成的逆转录50μg总RNA(汇集从6个人)使用上标二世逆转录酶工具包(英杰公司、德国)。引物退火0.75执行μg oligo-dT引物的体积18.5μL样品加热到65°C的10分钟和随后在冰上冷却。逆转录执行2 h在40μL 39°C上标第一链缓冲区包含20 nmol每个dATP gGTP, dTTP, 8 nmol dCTP 4 nmol Cy3——或者Cy5-labelled dCTP(美国珀金埃尔默,沃尔瑟姆,MA),分别0.4μmol二硫苏糖醇和300 u上标II酶。反应是停止通过添加10μL 1 m氢氧化钠和10分钟加热到65°C。混合物是通过添加10μL 1 m盐酸中和和200年μL TE缓冲(10毫米三,1毫米EDTA, pH值8)。标签使用PCR互补脱氧核糖核酸分离净化设备(试剂盒)后,制造商的指示。gydF4y2Ba
杂交gydF4y2Ba
称为cDNA样本组比较涨跌互现gydF4y2Ba原位gydF4y2Ba杂交缓冲(安捷伦科技、Waldbronn、德国)和应用于G4122A微阵列(整个老鼠基因组44 k阵列发现有60 mer寡核苷酸探针;安捷伦科技公司)。杂交是60°C在安捷伦旋转杂交。幻灯片是用标准的柠檬酸钠(SSC) / triton - x - 102解决方案根据安捷伦协议。gydF4y2Ba
扫描和图像分析gydF4y2Ba
干幻灯片进行扫描使用GenePix 4100扫描仪(分子设备、Ismaning德国)10μm·像素的分辨率gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba。提高光电倍增管的调整,以利用动态范围和获得类似的波长的强度直方图。图像分析与GenePix Pro 5.0执行软件。gydF4y2Ba
统计分析gydF4y2Ba
提取的特征数据进行分析gydF4y2Ba8gydF4y2Ba使用limma包gydF4y2Ba9gydF4y2Ba的BioConductorgydF4y2Ba10gydF4y2Ba。斑点加权为后续分析根据现货强度、均匀性和饱和。点强度被纠正为当地背景使用爱德华兹的方法gydF4y2Ba11gydF4y2Ba抵消64稳定低强度的方差。LOESS-normalised M /数据gydF4y2Ba12gydF4y2Ba在平均。基因排序的微分表达式使用一个温和的t统计量gydF4y2Ba13gydF4y2Ba。的幂∼90%的错误发现率为10%。微阵列数据从一个类似的研究(四个数组技术dye-swap总共八个数组,RNA汇集从六个老鼠/样本)来执行gydF4y2Ba先天的gydF4y2Ba功率测试。所需的样本大小(即dye-swap对数组)的数量估计使用Ferkinstad的方法。基于这些数据gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba14gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
实时聚合酶链反应gydF4y2Ba
为了验证片上发现,实时PCR应用于从候选人名单中选择6个基因发现监管在实验设置。互补脱氧核糖核酸的合成,试剂(应用生物系统公司Applera GmbH,德国达姆施塔特,德国)和孵化步骤如前所述gydF4y2Ba15gydF4y2Ba。实时PCR进行使用7900 ht快速实时PCR系统(美国应用生物系统公司,培育城市,CA)。胆色素原脱氨酶基因被用作参考gydF4y2Ba16gydF4y2Ba。PCR反应是建立使用铂SYBR绿色qPCR SuperMix-UDG(表达载体)。给出微分表达式作为ΔΔCt值gydF4y2Ba17gydF4y2Ba。循环条件如下:45×6分钟在95°C (5 s在96°C, 5 s在59°C和15秒72°C)。产品被融化曲线分析和琼脂糖凝胶电泳。底漆数据见表1gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
免疫印迹分析gydF4y2Ba
从肺匀浆蛋白质变性在Laemmli缓冲区(5分钟/ 95°C)和由钠十二烷基sulfate-polyacrylamide使用10%聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶(叠加凝胶:5%)在坦克污点系统(BioRad,慕尼黑,德国)。沾上污渍的膜被封锁与牛奶2 h / 5%牛血清白蛋白(BSA)在1×磷酸盐(PBS)。主要抗体(抗(α)-Rras2 /α-c-fos:圣克鲁斯生物技术公司,圣克鲁斯,CA,美国;α-Egr1:我们生物,Swampscott,妈,一夜之间,美国)被孵化(牛奶/ 5% BSA旋转4°C)和二级抗体(结合辣根过氧化物酶)1 h(牛奶/ 5% BSA、房间温度、震动)。可视化的乐队我们使用Amersham ECL +免疫印迹检测试剂(通用电气医疗集团,慕尼黑,德国)。β-actin(抗体从σ,圣路易斯,密苏里州,美国)担任加载控制。表达式计算比率与ImageJ (V1.41a)。gydF4y2Ba
原位gydF4y2Ba杂交gydF4y2Ba
代的探针gydF4y2Ba
小鼠肺cDNA片段(400 - 700完全)subcloned进pGEM-Teasy向量(WI Promega,麦迪逊,美国)。质粒的序列验证后,10μg使用单一限制性内切酶切割(Fermentas、圣Leon-Rot、德国;37°C /隔夜;主要是萨利·或SacII)。使直线化产品清理(PCR净化设备;试剂盒)和转录成RNA探针使用SP6或T7 RNA聚合酶(Promega;37°C / 2 h),分别引入digoxigenin(挖)贴上utp(挖RNA标签组合;罗氏公司)的产品。最后,DNA消化(RQ1 RNase-free DNase;Promega)和探针核糖核酸纯化(illustra ProbeQuant G-50微列; GE Healthcare, Freiburg, Germany).
抽样gydF4y2Ba
小鼠肺与PBS刷新gydF4y2Ba通过gydF4y2Ba右心室和4%多聚甲醛固定(PFA;卡尔罗斯GmbH,卡尔斯鲁厄,德国;25而言不啻gydF4y2Ba2gydF4y2BaO)gydF4y2Ba通过gydF4y2Ba气管25分钟。切除肺被固定在4% PFA (4°C /隔夜)和脱水,紧随其后的是一夜孵化在丁醇,paraffination和嵌入。肺被切成12-μm片和安装到SuperFrost超+幻灯片(热科学,Schwerte,德国)。gydF4y2Ba
杂交gydF4y2Ba
样本deparaffinised和水化,紧随其后的是蛋白酶K消化。洗后,切片和PFA / 0.1%戊二醛固定(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)与PBS 20分钟,洗。接下来,样本pre-incubated杂交组合(2 h, 70°C;50%(/卷卷)甲酰胺+ 25% SSC (20×, pH = 4.5) + 20% HgydF4y2Ba2gydF4y2BaO + 1‰渐变20 (Sigma-Aldrich)和1%(重量/卷)阻塞试剂,EDTA 5毫米,1毫米皮套裤,20μg·毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba肝素和1毫克·毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2BatRNA),紧随其后的是一个与预热overnight-incubation探头(1 ng·μLgydF4y2Ba−1gydF4y2Ba在杂交组合)在70°C。之后,幻灯片被洗(2×SSC, pH = 4.5)和孵化2×SSC / 50%甲酰胺(2×15分钟,65°C)。“绑定探针被移除(3×10分钟PBT (PBS / 0.1%(卷/期)渐变20)),其次是1 h和屏蔽解决方案(37°C;0.2%阻塞山羊血清试剂(罗氏)+ 10% PBT)和2 h的碱性phosphatase-coupled anti-DIG抗体(1:1,000;罗氏在屏蔽解决方案)。洗后,幻灯片被孵化与特种加工(10分钟,100毫米氯化钠+ 100毫米三羟甲基氨基甲烷(pH = 9.5) + 50 mm MgCl液gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。然后,BM紫色底物在一夜之间解决方案(罗氏)应用和孵化。与PBS最终清洗后,幻灯片是安装;目标RNA分子出现在紫色。gydF4y2Ba
结果gydF4y2Ba
阵列分析gydF4y2Ba
我们发现迄今为止更重要的调控基因(B值≥0)当比较新生和成年小鼠(分别为1669 2032 P1和P3候选人)比手术模型(S1 = 183和S3 = 161),可能由于极端差异在成熟前集体。图1gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba给人一个印象的统计数据(火山墨迹显示日志之间的相关性gydF4y2Ba2gydF4y2Ba倍mRNA表达和监管的概率的变化和德()的差异表达基因印迹相关内设模型变化在不同跨度为)和作为模范地描绘了十字路口的程度最高的调控基因的跨度为每个模型。我们发现40的前50名最重要的差异表达基因在产后跨度为改变,而只有10路口候选人对象肺增长(图。1gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。所有基因的发现改变了1gydF4y2Ba和gydF4y2Ba出生后3天或手术,分别是一致,或表达下调;没有显示开关。gydF4y2Ba
候选基因gydF4y2Ba
图2gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba概述的前50名的功能或表达下调的基因中发现每组(见PubMed / Entrez基因(gydF4y2Ba/ entrez www.ncbi.nlm.nih.gov网站gydF4y2Ba)和GeneOntology (gydF4y2Bawww.geneontology.orggydF4y2Ba))。分类进行无论促进或抑制效应分子的研究。最引人注目的发现是一个独特的控制函数或函数在每个条件的组合。在新生鼠,我们发现主要生长、分化和翻译基因以及酶及其抑制剂调节(图。2gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba),而一大群归因于基因免疫系统和防御机制最集中表达下调与成人相比,新生儿肺(图2 bgydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。类似于新生鼠,支气管肺增长的特点是生长过程和酶的参与。有趣的是,我们也发现了数量可观的调节免疫反应基因在这一类,虽然sham-operated动物对照组被认为“中和”这一效应(图2摄氏度gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。表达下调的基因后,手术治疗是主要由分子中发现线粒体呼吸链的主要成员(图2 dgydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
我们发现一些胶原蛋白分子非例外地调节两种模型,即13个基因在产后六个对象组(重叠:五位候选人)。这强烈凸显了需要的结缔组织代肺。gydF4y2Ba
十字路口的基因列表从新生儿和小鼠肺切除术gydF4y2Ba
总的来说,我们发现58基因表达显著改变在这两个实验设置(至少在一个时间点,见表2gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。19这是相互的,21个表达下调。剩下的18个候选基因显示,新生儿和较低的高表达量在pneumonectomised动物(六)或相反(12)。gydF4y2Ba
考试的这些基因的功能显示许多候选人参与生长和分化,紧随其后的是变量/未知的角色和免疫调节的任务(图3所示gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
实时聚合酶链反应gydF4y2Ba
检查数组中数据的准确性,我们进行实时PCR基因控制的六位候选人出现在十字路口的增长模式(表2gydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba,图3gydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba)。我们评估三个随机选择的候选人一致的支气管和产后监管和三个不同的方向(图。4gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba),分析了跨度为发现显著改变数组中的数据。gydF4y2Ba
总的来说,我们可以复制所有监管倾向阵列实验中发现,大多具有良好的调节因素。gydF4y2Ba
免疫印迹分析gydF4y2Ba
微分规定RNA水平(见表2gydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba和图4gydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba)并不一定意味着适当的蛋白质含量的改变,我们检查三种蛋白质的表达水平,即Rras2 (RAS相关病毒致癌基因同系物(r-ras) 2), c-Fos (FBJ骨肉瘤癌基因)和Egr1(早期生长反应1),在相同的实验环境下其前驱物被检测到的改变。所有的目标分子,我们可以验证相同的监管趋势上发现微阵列(图5gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba和b)。gydF4y2Ba
与所有数组数据给出一个表在线补充材料。gydF4y2Ba
原位gydF4y2Ba杂交gydF4y2Ba
我们作为模范地寻找两个PCR验证候选人的本地化,即c-Fos和Lcn2 (lipocalin 2;急性期反应,上皮发育)(图5 ckgydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba)。mrna表达了在单一间隔细胞在新生鼠和转向成年动物的支气管表达式。在肺切除术模型中,我们发现两位候选人的密集upregulation单个细胞周围肺的最大变化由于扩张可以预期。gydF4y2Ba
讨论gydF4y2Ba
实验设计gydF4y2Ba
我们进行了进一步研究老鼠基因表达屏幕候选基因在转基因动物在未来。产后和支气管肺增长我们选择第一天和第三天进行分析。我们的目的是分析基因表达的诱导阶段负责监管途径,这可能是潜在的治疗干预措施的关键。P1老鼠可能被视为衡量一般肺增长;看表2gydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba,我们发现20(58中总)差异表达基因在P3,但不是在P1,虽然只有八个候选人相反的变化。这可能被视为一种专业化(gydF4y2Ba即。gydF4y2Ba感应新基因)指导二级分隔作用,我们的目标的过程。相比之下,我们似乎已经找到了一个补偿性增长模式中感应阶段早些时候,这里甚至37(58)基因专门监管后1天。gydF4y2Ba
先前的调查gydF4y2Ba
其他组也在全基因组研究肺生长和再生方法,专注于特定方面,药物治疗效果或细胞类型,分别。gydF4y2Ba
马里安尼gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba18gydF4y2Ba分析了时间进程从胚胎第12天到成年专注于细胞外基质分子和生成功能基因簇。这里,最有趣的一个调节候选人在产后阶段(对流层)弹性蛋白,也是我们最强烈地改变分子之一在产后对象动物(表2gydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba)。集团进一步分析几种胶原蛋白发现更强烈地表达了在间质组织或基底膜。在我们的模型,我们可以确认间隙的upregulation I型和III胶原蛋白(表2gydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba),而基底膜胶原蛋白(IV)只是稍微升高在肺切除术后1天(见在线补充表)。gydF4y2Ba
福斯特gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba19gydF4y2Ba生成的mRNA表达数据的技巧越来越P6 septae孤立laser-capture显微镜。有趣的是,只有三个最密集的25个基因调节也大大改变了我们的数据(见在线补充表),即tenascin-XB和C以及drebrin 1,而tenascin-XB肺匀浆中表达下调。还galectin-1,感兴趣的主要焦点在这项研究中,我们无法确认。这些表达谱的差异可能是由于不同跨度为调查(P1和P3gydF4y2Ba与gydF4y2BaP6),但是我们也必须考虑,使用肺匀浆可以隐藏某些结果,gydF4y2Ba如。gydF4y2Ba不同的细胞调节基因在不同方向上由于不同需要在同一时间。gydF4y2Ba
研究大鼠成纤维细胞,BoucheratgydF4y2Baet al。gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba寻找基因被上升或下调P7(二次隔形成的阶段)与P2和P21gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba。141名候选人中有重大变化,我们发现38的重叠基因(27%;与在线补充材料)。其中,新生儿35只监管模型和16人改变方向不同。虽然常见的基因是相对较高的数量,我们必须小心在比较这些数据是1)使用一个不同的物种,2)只有一个细胞类型进行了研究,和3)分隔作用的另一个(相对)时间点选择。这也反映了10基因研究感兴趣的焦点:只有Wnt5a Fzd1和Tnx认识提高监管在我们的筛选,而剩下的候选人,gydF4y2Ba如。gydF4y2Ba民主党和Hox 1、2和5,没有改变在匀浆。gydF4y2Ba
马萨罗和同事gydF4y2Ba21gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba23gydF4y2Ba执行一些基于数组的肺生长研究,要么corticosteroid-triggered抑制alveolarisation在年轻小鼠或热量控制和重新喂料。在前实验,dexamethasone-treated动物管理视黄酸导致46 drug-influenced基因“纠正”监管的趋势gydF4y2Ba21gydF4y2Ba。我们发现只有四个候选人,即Ly6a(6复杂,淋巴细胞抗原位点),Chi3l3, Clca1 Rnf2,明显改变了正常的产后(对象),没有一个老鼠的肺,和只有后者两个显示相同的监管趋势。特别是Flk-1,马萨罗和同事的主要焦点gydF4y2Ba21gydF4y2Ba,并没有改变在我们的模型。这些发现支持了假设皮质类固醇似乎防止肺增长正在通过抑制途径不仅在次要的分隔作用,但整个过程。gydF4y2Ba
在另一个系列的实验中,该集团专注于与时间相关的监管改革由于热量限制gydF4y2Ba22gydF4y2Ba。在数组列表中,我们发现10 63 (16%)apoptosis-related基因也在肺泡增长,改变了大多数这些候选人(gydF4y2Ba如。gydF4y2BaCasp1和3,Birc2)监管的相反的方向与早期相比(4 - h)缺乏食物的影响。关于proteolysis-related基因,我们甚至看到了重叠在24的78个基因(31%),再次与大多数的候选人(gydF4y2Ba如。gydF4y2BaPsmb8, Gzma和Gzmb)有相反的变化。发现很多常见的肺与生长有关的基因被改变了相反的方向相反由于刺激升级我们的数据的有效性,以及马萨罗的数据。gydF4y2Ba
在最近的方法,深入研究了小鼠2周后被re-fed卡路里限制的关注血管生成、细胞外基质和细胞replication-related基因,以及转向引导细胞运动的元素gydF4y2Ba23gydF4y2Ba。,我们发现一个非常高度的重叠(30 - 50%)在整个组织,特别关注血管生成和细胞复制。发现几个候选人显示规定相反的方向可能是由于肺生长的不同阶段在跨度为正在进行的研究(1 - - - 3 - h重新喂料与产后1和3天)。gydF4y2Ba
关于基因已知影响到正常alveolarisation和/或补偿肺增长(gydF4y2Ba如。gydF4y2BaPdgfA、Hox NeuroD, Fizz1和以挪士),我们只发现Fibrillin1显著监管。原因发现可能,例如,不同细胞类型的重叠配置文件在我们的匀浆或不同的统计和研究方法论的方法。gydF4y2Ba
功能基因组织gydF4y2Ba
新生鼠gydF4y2Ba
最大的发现是调节基因是编码分子的生长和分化(31%;图2gydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba)。所有这些(gydF4y2Ba如。gydF4y2BaIgf2(胰岛素样生长因子2),Cdc2a(细胞分裂周期2同族体),Tcf21(转录因子21)),有刺激作用,拟合成长的必需品促销和器官发生在这段时期的生活。此外,有一些结构分子比成人更强烈地表达了动物(弹性蛋白,fibrillin),提供稳定和新兴组织指导支架组件。组的酶及其监管机构,我们发现许多分子抑制效果调节(gydF4y2Ba如。gydF4y2BaStfA1 (Stefin A1) LOC268885),这主要是防止基质降解蛋白酶破坏至关重要,是建立细胞外基质材料,也是合理的。gydF4y2Ba
相反,有几个表达下调与酶分子的活动,gydF4y2Ba如。gydF4y2Ba胶原肽链内切酶增强剂(Pcolce2gydF4y2Ba24gydF4y2Ba)或proapoptotic allyldehydrogenase Aldh1a1;这些发现也匹配的需求增长和稳定。另一个有趣的问题是找到10个不同的细胞色素P450氧化酶(CYP)分子表达下调。随着这些酶发挥作用通过外源性物质在预防损伤gydF4y2Ba25gydF4y2Ba,可以推测,在生命的早期阶段,外源性物质代谢的干涉将大大损害CYP水平较低的结构和防止这种伤害。关于这一点,缺乏Cyp2f2,表达下调3.4倍于P3肺,已被证明在naphthalene-induced克拉拉细胞损伤有保护作用gydF4y2Ba26gydF4y2Ba。的差别,对这些微粒体环氧化物水解酶1 (Ephx1),也在解毒过程中发挥作用,进一步支持这一论点。相反,最近表明,克拉拉特异性稳定β-catenin导致不成熟的“祖”——呼吸道上皮细胞的上皮细胞显著减少P450细胞色素的表情gydF4y2Ba27gydF4y2Ba。因此,低CYP表达式也可以反映出不成熟的上皮细胞在细胞迅速扩张的状态。发现Xdh(黄嘌呤脱氢酶)和Ly6a,都有一个pro-differentiative影响,表达下调,此外证实了不成熟的状态。表达下调集团中最惊人的发现是许多基因参与免疫反应机制。国防的子组覆盖了很多领域,gydF4y2Ba如。gydF4y2Ba抗原表达gydF4y2Ba通过gydF4y2Ba主要组织相容性复合体分子,白细胞表面受体和部分补充系统。我们推测,免疫系统仍处于不成熟的状态,相对一些炎症细胞存在于肺的发育时期,这可能是可以接受的,只要婴儿获得抗体gydF4y2Ba通过gydF4y2Ba牛奶。与cyp,这可能也会发生“故意”发展一定程度的宽容对自己的组织组件。gydF4y2Ba
手术模型gydF4y2Ba
在调节基因,我们发现大多数全球分子的相对同质分布函数。再次,最大的基因包括生长和分化的分子,尤其是转录因子和介质的前导通路(gydF4y2Ba如。gydF4y2BaEgr1,安全系数)。此外,六种不同的胶原蛋白更强烈地表达了(五人与新生儿并行模型;比较表2gydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba),突显出结缔组织的需要代肺补偿性增长。有趣的是,我们发现了一些免疫调节基因被诱导,尽管虚假的操作进行控制的动物。其中一些可能确实被潜在的更严重的伤害比调节控制动物,而且基因表达下调和/或二次(方面)影响被检测到,这可能是强调在我们的模型中,gydF4y2Ba如。gydF4y2BaZ49206 (= Hsf1热休克因子1;抑制肿瘤坏死factor-α生产和是一个转录因子)gydF4y2Ba28gydF4y2Ba或Lcn2gydF4y2Ba29日gydF4y2Ba,gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba。相反,一些免疫系统的刺激器也发现表达下调,至少在一定程度上减少一些前促炎基因的影响。gydF4y2Ba
组中表达下调的基因,我们再次发现了几种生长和分化的分子,通常与抑制功能(gydF4y2Ba如。gydF4y2BaFabp4(=脂肪酸结合蛋白4;抑制转录)和Srp9(= 9信号识别颗粒;抑制剂的转录延伸)gydF4y2Ba31日gydF4y2Ba)。一个非常有趣的发现是,露出的几位呼吸链/肺切除术后线粒体代谢被下调。乍一看,这发现是奇怪的,因为我们可以假设在肺生长高度的能源需求,需要补偿呼吸道表面的三分之一。有人可能会考虑一个相对效应,线粒体可能不尽快把自己的“母亲”细胞,但我们发现所有的17个基因编码的细胞线粒体基因组和没有的自己。可能是差别的对这些解释为自噬现象:对心脏,众所周知,在极端需求时期,细胞能够“烧掉”他们的线粒体迅速获得大量的能量和氨基酸gydF4y2Ba32gydF4y2Ba,gydF4y2Ba33gydF4y2Ba。类似的事情也可能认为补偿肺癌的发病增长。gydF4y2Ba
基因调控在产后和支气管肺增长gydF4y2Ba
总的来说,我们发现40想法一致,或表达下调基因在两个实验组,每组和18候选人的相反的方向变化(表2gydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba)。在前的基因,我们可以假设已经发现一些重要的监管机构或运营商alveolarisation作为统一的“偶然”发现表现的变化没有任何覆盖功能相互关系的两个独立的模型可以被看作是不可能的。讨论的不和谐的基因必须更差异化的方式:一些人,如果不是他们中的大多数可能不扮演重要角色在肺的增长。一些候选人可以反映不同的跨度为在漫长的监管途径需要反对或完全不同的影响,gydF4y2Ba如。gydF4y2Ba转录因子如Egr1:这种分子可以诱导增殖,分化,血管生成,诱导和抑制细胞凋亡等。gydF4y2Ba34gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba36gydF4y2Ba。所有这些特性肺增长是必要的,但必须以正确的顺序出现。gydF4y2Ba
在十字路口的候选人名单中,迄今为止最大的官能团是“生长和分化”:10个19(53%)共同地,21例(43%)的表达下调基因,至少在某种程度上,参与这些过程,gydF4y2Ba如。gydF4y2BaRbm3 (= RNA结合主题蛋白质3),这对有丝分裂过程是必要的gydF4y2Ba37gydF4y2Ba。调节基因的另一个例子是Fstl1 (follistatin-like TSC36)。蛋白质具有抗凋亡,heart-protecting效应和在器官形成中发挥作用。普遍表达,越来越本地化,已经被描述为胚胎鼠肺和肾脏的发展gydF4y2Ba38gydF4y2Ba。Uhrf1 (= ubiquitin-like,包含博士和无名指域,1;Np95)我们发现分子负责s阶段进入和基因组稳定升高在两种模型gydF4y2Ba39gydF4y2Ba。Rras2 (TC21)是已知的刺激迁移;在某些情况下,它甚至可以诱发肿瘤gydF4y2Ba40gydF4y2Ba。两种模型中发现upregulation指向肺细胞迁移的需要适当的增长。gydF4y2Ba
除了这些刺激因素,有几个结构分子,都是至关重要的,合理的肺架构,也自如调节,gydF4y2Ba如。gydF4y2Ba五个不同的胶原蛋白、弹性蛋白和fibrillin1。gydF4y2Ba
中表达下调的基因,我们发现几个候选人负责维护程序的分化细胞,但也增长抑制分子,gydF4y2Ba如。gydF4y2BaPla2g16(=磷脂酶A2组十六= Hrasls3 = H-rev107),这是一个众所周知的细胞周期抑制剂gydF4y2Ba41gydF4y2Ba。再一次,这些发现可以合理的增殖和分化,当肺生长的需要。gydF4y2Ba
有趣的是,这两种模型之间的重叠度相对较小,尽管我们发现> 150(肺切除术)和> 1500(产后)基因显著监管每一个设置,分别。这一结果有两种不同的解释:一方面,整个alveolarisation过程可能取决于很少启动和/或执行分子。在这种情况下,我们可能已经发现了至少大部分的关键基因。另一方面,这两种模型可以相对独立,显示类似的功能由不同的途径。肺组织再生的思想在人类必须意识到基因从一种或另一种模型,与肺切除术候选人最好,这个问题更接近成人预计会发生什么。gydF4y2Ba
我们的研究结果缩小了基因的数量可以被视为潜在的候选人分隔作用的规定,但是这些基因的功能研究揭示其实际作用和回答这个问题的确是否有一个共同的背景模型。gydF4y2Ba
在第一步,我们可以本土化c-Fos——Lcn2-specific mRNA的表达在产后和对象肺(图5所示gydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba)。两分子显示开关的表达被表达在单一间隔细胞出生后,但在成年老鼠的支气管。关于手术模型,我们发现特定的信使rna pneumonectomised另外出现在外围,但不是sham-operated动物。这可能解释的需要外肺集约增长比内部的一部分地区和适合我们在数组中发现的明显upregulation基因实验(表2gydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
总结gydF4y2Ba
研究两个肺增长模型中,我们使用芯片屏幕发现基因表现的重大变化可能涉及在产后和/或支气管胸膜alveolarisation。虽然有大量的候选人发现特别是在新生鼠,我们只看到一个十字路口小程度的模型,由于一些关键的监管机构的重要性或由于广泛的独立的过程。gydF4y2Ba
感兴趣的语句gydF4y2Ba
没有宣布。gydF4y2Ba
确认gydF4y2Ba
作者要感谢d Fuchs娴熟的技术援助。gydF4y2Ba
脚注gydF4y2Ba
可以从本文的补充材料gydF4y2Bawww.www.qdcxjkg.comgydF4y2Ba
- 收到了gydF4y2Ba2009年8月9日。gydF4y2Ba
- 接受gydF4y2Ba2009年8月13日。gydF4y2Ba
- ©人期刊有限公司gydF4y2Ba
引用gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba