摘要
在非洲,艾滋病毒感染是结核病的最大风险因素。结核菌素皮试(TST), QuantiFERON-TB金试管(QFT-G-IT)和T-Spot。结核病assays were performed in newly diagnosed HIV-infected individuals with and without active TB and in HIV-uninfected subjects at a university outpatient clinic in Kampala, Uganda.
共有135人被纳入研究:109人新诊断为HIV-1感染但无活动性结核病,19人感染HIV-1并有活动性结核病,以及7名未感染HIV的健康受试者。在对照受试者中,TST和至少一次干扰素-γ释放试验的免疫反应阳性率分别为57.2%和100%。
在HIV-1感染的无活动性结核病患者中,TST (mm)硬化(rho = 0.41, p-value <0.0001)和QFT-G-IT管中干扰素(IFN)-γ浓度结核分枝杆菌-特异性抗原(rho = 0.38;p = 0.0001)与循环CD4+ t细胞数量、IFN-γ产生细胞数量呈负相关(rho = 0.03-0.13;p-value = 0.21-0.77)和T-Spot阳性检测结果的频率。结核病测试among groups of patients with different levels of immunodeficiency remained constant (p-value = 0.46).
在HIV-1感染中,TST和QFT-G-IT免疫应答均与免疫缺陷程度密切相关,而T-Spot的结果。肺结核与CD4+ t细胞耗竭水平无关。
根据世界卫生组织先前的估计,大约三分之一的世界人口感染了艾滋病结核分枝杆菌1. 潜伏性结核感染(LTBI)通常被定义为感染结核分枝杆菌复合物,表现为预先定义的结核菌素皮肤试验(TST)反应和/或阳性的干扰素-γ释放试验(IGRA),没有任何活活性疾病的迹象2。由于成功的免疫反应,只有少数人被认为已潜伏感染结核分枝杆菌曾经患过结核病3.,4。然而,每年约有900万人被诊断为活动性结核病,近200万人死于该病5。
结核病和艾滋病毒感染是非洲的主要公共卫生问题6。这两种疾病的危险相互作用已被记录,包括双重感染对象的发病率和死亡率增加的发现7。事实上,结核病仍然是艾滋病毒感染者死亡的主要原因8。最近的数据还表明,感染艾滋病毒使艾滋病毒血清转化后结核病早期再激活的风险增加一倍9. 此外,在患有LTBI的HIV感染者中,每年发生活动性结核病的风险为5-10%10。因此,快速识别和预防治疗有发展成活动性结核病风险的感染艾滋病毒的LTBI患者是非洲防治结核病的优先事项11。
然而,到目前为止,TST反应性的限制阻碍了这一目标的实现,特别是在大多数晚期HIV-1感染和假定LTBI患者中12- - - - - -15. IGRAs可能被证明对HIV感染者的LTBI诊断更可靠16- - - - - -21。然而,研究将TST与两种商业可用的IGRAs进行了比较,QuantiFERON-TB Gold In-Tube (Cellestis, Melbourne, Australia)和T-Spot。结核病(Oxford Immunotec, Abingdon, UK)在一个艾滋病高流行和结核病流行的国家是有限的21。
为了评估目前LTBI免疫诊断的方法,并了解它们与HIV感染患者免疫缺陷水平的关系,我们比较了一个结核病高发国家不同IGRAs和TST的表现。
材料和方法
研究主题与设计
这项研究是在乌干达坎帕拉的马克雷雷大学传染病研究所的艾滋病门诊所进行的。2006年,乌干达结核病发病率为每10万人355例。近年来,在乌干达接受HIV检测的结核患者中,HIV呈阳性的比率达到了约60%22;然而,目前结核病患者的艾滋病毒流行率估计较低,为45-50% (H. Mayanja-Kizza;个人沟通)。
这项研究得到了Makerere大学(乌干达)、凯斯西储大学(克利夫兰,OH,美国)和Lübeck大学(Lübeck,德国)的伦理委员会的批准。所有受试者均提供书面知情同意书,符合美国卫生与公众服务部良好临床实践和道德准则。
在对艾滋病毒-1感染进行自愿咨询和检测之后,被转到马克雷雷大学传染病研究所的坎帕拉成年居民被邀请参加。所有研究对象均接受抗逆转录病毒治疗naïve。既往结核病、异烟肼预防治疗、类固醇治疗、妊娠和hiv感染者Karnofsky评分≤60分或当前机会性感染是排除标准。如出现任何一种症状咳嗽、胸痛、最近体重减轻、盗汗、发烧、食欲不振、淋巴结肿大或全身疲劳,就会转到结核病研究单位诊所进行痰检以排除活动性结核病。所有患者均接受临床检查并接受胸片检查以排除活动性肺结核。健康的艾滋病毒血清阴性对照者(Makerere大学传染病研究所的工作人员)也参加了该项目。
国家传染病研究所L. Spallanzani(罗马,意大利)招募了没有活动性结核病危险因素的hiv血清阳性个体作为额外对照。
结核菌素
在第一次研究访视时,采血并进行2次检查 TU/0.1 将mL TST(RT23;丹麦哥本哈根斯塔滕斯血清研究所)置于前臂掌侧,并用记号笔在该部位标记一个圆圈。48岁 h、 用圆珠笔和直尺法测定TST硬结的横向直径23。
伊格拉斯
T-Spot。结核病(Oxford Immunotec) and QuantiFERON-TB Gold in tube (Cellestis) were performed according to the manufacturer's guidelines.
T-Spot.TB试验
对于T-Spot.TB分析,通过离心法从肝素化静脉血中分离外周血单个核细胞(PBMC),并使用带有96孔板的干扰素(IFN)-γELISpot试剂盒。用植物血凝素(阳性对照)、未刺激(阴性对照)或含有早期分泌抗原靶标(ESAT)-6和培养滤液蛋白(CFP)-10的肽刺激每孔250000个细胞。孵育18天后 h、 根据制造商的方案开发平板,并在免疫斑点分析仪(德国斯特拉斯堡AID)上读取。阳性结果定义为ESAT-6和/或CFP-10面板中的斑点计数减去nil控制面板中至少五个斑点的斑点计数;阴性结果定义为少于五个斑点。如果nil对照孔(高背景)中存在>10个斑点形成细胞(sfc)和/或丝裂原阳性对照孔中存在<20个sfc,则结果被定义为不确定。
QFT-G-IT分析
为进行QFT-G-IT测试,在三个真空管中采集三份1-mL静脉血样本,并预先涂覆结核分枝杆菌检测特异性抗原(ESAT-6、CFP-10和TB7.7),阳性对照为植物血凝素,阴性对照为无抗原。标本是根据制造商的说明进行加工的。如果ESAT-6、CFP-10和TB7.7抗原暴露样本中IFN-γ水平减阴性对照≥0.35 IU·mL,则认为结果为阳性−1阴性对照血浆中IFN-γ浓度≥25%。不确定的结果被定义为非原因IFN-γ水平≥8.0 IU·mL−1在阴性对照血浆或≤0.5 IU·mL−1用TB抗原暴露样本中的IFN-γ水平减去阴性对照组中的水平,即<0.35,刺激植物血凝素 IU·mL1或阴性对照血浆中IFN-γ浓度<25%。
实验室评价
采用Amplicor (Roche Diagnostics, Basel, Switzerland)检测血浆HIV病毒载量,采用流式细胞仪(Becton Dickinson Inc., San Jose, CA, USA)检测血液CD4+细胞计数。
统计分析
采用Stata 9.0 (StataCorp;Stata统计软件发行版9,College Station, TX, USA)。分析反应被评价为连续变量和分类变量(阳性或阴性反应)。比例比较采用Fisher精确检验;在未配对分析中,连续测量使用未配对t检验来检验关系,而假设因变量为正态分布区间变量时使用Wilcoxon Mann-Whitney检验。组均值(>2)采用方差分析进行比较;在适当的时候使用它的非参数版本(Kruskal-Wallis检验)。通过κ-统计评估检验一致性,认为k≤0.20的一致性为“轻微”,0.20
结果
在最初评估的190名患者中,135名患者符合纳入/排除标准并被纳入分析。其中109例为新诊断的无活动性结核病症状或体征的HIV-1阳性患者,19例为新诊断的HIV-1阳性活动性结核病患者,7例为未感染艾滋病毒的健康对照。研究设计、研究参与者的人口学和临床特征以及免疫诊断分析的结果如图1所示⇓和桌子 1.⇓,分别。
循环CD4+T细胞的中位数(四分位间距;IQR)水平为182(118) 细胞·μL-1及283(226)) 细胞·μL-1分别在有和无活动性结核病的HIV感染患者中。在109名无活动性结核病的HIV感染患者中,循环CD4+T细胞的平均(IQR)水平为64(43) 细胞·μL-1, 179(68)个细胞·μL-1和368(206))细胞·μL-1在CD4+ t细胞计数<100 (n = 10)、100 - 250 (n = 33)和>250 (n = 66))细胞的研究对象·μL-1HIV病毒载量与预期的CD4+T细胞计数呈负相关(p<0.01)(表1) 1.⇑).不同CD4+ t细胞计数层患者的性别和年龄分布均匀。
未感染hiv的对照组比hiv阳性个体更年轻(平均25.7岁)(有活动性结核病和无活动性结核病的个体分别为33.4岁和34.1岁)。没有活动性结核病的艾滋病毒感染者组中有20人(18.3%)的TST结果无法获得,因为这些人没有返回进行检测读数。活动性肺结核患者不进行TST治疗。所有7例未感染hiv的对照患者TST硬化≥5 mm, 6例(85.7%)和4例(57.2%)未感染hiv的患者TST硬化≥10 mm和≥15 mm。而对照组的TST结果符合高斯分布,hiv感染者多为TST阴性或TST直径较小(范围5-10 mm)(表1)⇑)在HIV感染患者中,TST硬化与循环CD4+T细胞数量直接相关(Spearmans rho) = 0.41;p值<0.0001)(表 2.⇓).89例非活动性结核病hiv感染者TST硬化0 mm 30例(33.7%)。
QFT-G-IT测试和T-Spot。结核病results were positive in all seven healthy controls and five (70%) healthy controls, respectively. The HIV-infected individuals without TB were stratified according to CD4+ T-cells counts of >250, 100–250 and <100 cells·μL−1。QFT-G-IT检测的阳性结果频率分别由77.3%显著下降至66.7%和10% (p<0.0001),而T-Spot检测的阳性结果频率显著下降。TB分别为50%、57.6%和70%,与T-Spot阳性率无显著性差异。未感染艾滋病毒的对照组出现结核病(p = 0.76)(表1)⇑,图2⇓).
QFT-G-IT和T-Spot测试结果不确定。结核病were observed in a total of three (2.8 %) and four (3.7 %) of the 109 HIV-infected patients without active TB, respectively. Indeterminate test results were not related to levels of circulating CD4+ T-cells (p>0.45). In HIV-infected patients, the concentration of IFN-γ in the tube with the specific antigens QFT-G-IT was directly correlated to numbers of circulating CD4+ T-cells (Spearman's rho = 0.38; p-value = 0.0001). In contrast, numbers of spots in the ESAT-6 or CFP-10 antigen wells in the T-Spot.TB were not correlated to numbers of circulating CD4+ T-cells (Spearman's rho = 0.03 and 0.13, respectively; p-value = 0.77 and 0.21, respectively) (table 2⇑).
免疫诊断试验之间的一致性如表所示 3.⇓。在无活动性结核病的hiv感染者组中,T-Spot检测结果总体一致。TB和QFT-G-IT,在t点之间。结核病and the TST and between the QFT-G-IT and the TST were observed in 60.8% (κ = 0.17;东南方= 0.09), 40.4% (κ = 0.37;东南方= 0.11)和66.3% (κ = 0.34;东南方分别为= 0.1)。在hiv感染个体中,>250循环CD4+ t细胞组的总体检测结果一致性最好。在本组中,TST和T-Spot之间的检验结果一致性最高。结核病(73.1%;κ= 0.46;SE = 0.14)(表3⇓).
在活动性结核病患者中,19例中有17例(89%)和2例(11%)T-Spot呈阳性和不确定。分别为结核检测结果(图1)⇑).在19名活动性结核病患者中,QFT-G-IT结果为阳性(68%),阴性(32%)的有6人。
来自意大利的10名男性hiv血清阳性个体作为额外的阴性对照,以证明检测的特异性,患者的中位(IQR)年龄为41.4(34-51)岁,循环CD4+ t细胞计数的中位(IQR)数为480(303.5-778)个细胞·μL−1。TST (>5mm)、QTF-G-IT、T-Spot测试结果结核病were positive in zero, zero and one patient, respectively. Indeterminate results in the QTF-G-IT and T-Spot.TB assays were observed in no patients in both tests (fig. 1⇑).
讨论
防治艾滋病毒与艾滋病的共同感染结核分枝杆菌是非洲卫生保健干预的主要目标26。在发展中国家,结核病仍然是导致艾滋病相关死亡的主要原因。早期识别和治疗hiv感染者LTBI是有效的27这对于减少结核病在非洲的传播非常重要28。LTBI的检测依赖于免疫诊断试验、TST和最近的IGRAs,但关于它们在结核病高发国家个人中的表现的比较数据仍然有限20,21。
在这项研究中,来自结核病高发国家的艾滋病毒感染者被招募来直接比较TST, T-Spot的诊断准确性。TB试验和QFT-G-IT试验诊断LTBI。这一比较的结果大大增加了目前对艾滋病毒感染中免疫缺陷程度不同的个体进行这些测试的知识。在一群非洲人从一个社区在乌干达,结核病是高度流行,我们发现没有活动性结核病患者,57.2%的个体免疫产生了积极的结核菌素反应的硬化> 15毫米,推荐截止据美国胸科学会标准29。在所有未感染hiv的对照中,TST硬化为>5 mm,这是hiv感染个体推荐的临界值29.只有12.5%的循环CD4+T细胞<100的HIV感染者表现出TST反应阳性,TST硬化的直径与HIV感染者的循环CD4+T细胞数量显著相关,如前所述30。
所有没有活动性结核病的HIV未感染者对其中一种药物均呈阳性反应离体IGRAs用于测试记忆是否与结核分枝杆菌即QFT-G-IT或T-Spot。结核病测试。健康人群LTBI高频检测为研究提供了基础结核分枝杆菌同一社区HIV感染者的特异性免疫反应与免疫抑制程度的关系31。
我们发现,在没有活动性结核病的hiv感染个体中,在循环CD4+ t细胞计数的不同水平上,通过不同的检测方法测定的阳性免疫反应频率存在显著差异。当我们比较了TST的硬度大小和含IFN-γ的管结核分枝杆菌在QFT-G-IT中,特异性抗原ESAT-6、CFP-10和TB7.7与hiv感染个体循环中的CD4+ t细胞数量呈负相关。在t点的抗原特异性斑点水平上没有发现这种相关性。结核病测试。当我们评估不同免疫缺陷水平的患者组的阳性免疫反应频率时,同样,TST和QFT-G-IT依赖于循环CD4+ t细胞计数的水平,而T-Spot没有观察到这种关系。结核病测试。CD4+细胞浓度为>250·μL的hiv感染者TST和QFT-G-IT阳性频率最高−1,表明这些检测依赖于循环中的CD4+ t细胞的绝对数量。相反,t点阳性免疫反应的频率。结核试验与免疫缺陷程度无关。t点阳性的比率。结核病results were comparable in HIV-infected patients with <100, 100–250 and >250 CD4+ cells·μL−1和未感染艾滋病毒的对照组。
因此,在检测HIV感染者LTBI的免疫诊断试验中,存在着高度不一致的结果21,32- - - - - -35. 在我们的研究中,在没有活动性结核病的HIV感染者中,所有三项测试结果之间的总体一致性并不公平。与前面提到的德国研究结果类似,两个IGRAs(κ = 0.17). 只有循环CD4+T细胞>250(κ = 0.46).
我们的结果有力地支持了先前的观察结果,即无论HIV感染患者的T细胞分层如何,ELISpot分析显示抗原特异性免疫反应的鲁棒性20,34,36,37.在Rangaka的最大可比试验中et al。21在南非开普地区的一个小镇登记了74名艾滋病毒感染者和86名未感染者,这是T-Spot的频率。结核导致hiv感染者体内有>250 CD4+细胞·μL−1与<250个CD4+细胞·μL的个体相比−1,而晚期HIV感染患者QFT-G-IT检测结果的频率较低。然而,该研究的结果并没有达到统计学意义21。
最近,在结核病发病率较低的德国,对艾滋病感染者的LTBI免疫诊断试验进行了比较34。与本研究的结果一致,T-Spot的阳性结果。结核与循环CD4+ t细胞的数量无关。
与这些观察结果形成对比的是,有积极反应的患者的比例结核分枝杆菌塞内加尔达喀尔HIV感染者的特异性ELISpot随着循环CD4+细胞数量的增加而减少38。这种效应在循环CD4+ t细胞计数<50个细胞·μL的个体中尤其明显−1,表明对严重免疫抑制个体LTBI免疫诊断的不确定或阴性ELISpot试验结果需要谨慎解释。
在我们的队列中,晚期CD4+ t细胞衰竭患者中QFT-G-IT试验阳性结果的频率较低,不能用该组中大量的不确定结果来解释。无论采用哪种IGRA方法,仅在3.6%的hiv感染者中观察到不确定结果的频率,且与循环CD4+ t细胞计数无关。这些数据与其他研究不同,其他研究通过QFT-G-IT分析发现了大量不确定结果39,40或通过ELISpot化验的“室内”试验33,41。这可能是因为在本研究中,CD4+ t细胞<100 cells·μL的患者组−1与其他研究相比,对不确定结果数量的影响相对较小,并且大多数循环CD4+T细胞>100个细胞的HIV+患者··μL−1没有活动性疾病。因此,这些人不太容易出现结核病引起的免疫缺陷本身42- - - - - -44。
在目前的研究中,我们证明了T-Spot。结核病positive results were independent from CD4+ T-cell counts, differing from QFT-G-IT results. These data can be explained by the fact that the detrimental effects of lymphopaenia associated with the late stages of HIV disease in reducing the efficiency of IGRA tests can be overcome or reduced by the ELISpot procedure. In fact, ELISpot involves a normalisation of the input of PBMC used in the assays (250,000 PBMC are always plated in each well). Therefore, although QFT-G-IT produces easier logistic calculation in which the cell input is not normalised, it could suffer from a high rate of negative results among those HIV-infected patients with advanced immunodeficiency19,40,45,46如本研究所示。
我们研究的局限性需要得到解决。虽然我们目前最大的三个比较immunodiagnostic执行测试艾滋病毒感染者潜伏结核感染结核病高发的国家到目前为止,感染艾滋病毒的患者的数量< 100循环CD4 + t细胞和免疫控制的数量仍相对较小的在我们的研究中。然而,这些结果是可靠的,并通过不同的统计方法得到了加强,包括TST和QFT-G-IT免疫反应的大小与血液中CD4+ t细胞数量之间的高度相关性。未感染艾滋病毒的对照组比感染艾滋病毒的人更年轻,这可能导致这一组的阳性免疫反应频率存在偏差。然而,艾滋病毒感染者的平均年龄小于35岁,预计年龄不会对检测结果产生重大影响。
现在有越来越多的研究报告了IGRA在无活动性结核病的免疫缺陷个体中免疫反应频率的横断面数据。虽然这些数据提供了重要的信息,但目前迫切需要对IGRA对活动性结核病发展的预测价值进行纵向研究47。
综上所述,在hiv感染中,TST和QFT-G-IT的免疫应答均与免疫缺陷程度密切相关,而T-Spot的免疫应答与免疫缺陷程度密切相关。肺结核似乎与CD4+ t细胞耗竭水平无关。
支持声明
这项研究得到了HW对C. Lange的个人资助。和J. Hector基金会(Weinheim, Germany),以及国家卫生研究所(Bethesda, MD, USA)授予Z. Toossi HL 51636和AI 70022给凯斯西储大学(Cleveland, OH, USA)结核病研究单位。ELISA检测试剂盒(Quantiferon-TB金试管;celestis Ltd., Carnegie, Australia)和ELISpot检测试剂盒(T-SPOT®。结核病;Oxford Immunotec, Abingdon, UK)由制造商提供。酶联免疫吸附试验(ELISA)和酶联免疫吸附试验(ELISpot)的制造商对研究设计、参与研究的临床医生和/或科学家、研究中心的选择、数据收集、数据分析或发表手稿的决定没有影响。
感兴趣的语句
有关C.Lange的利益声明,请访问www.www.qdcxjkg.com/misc/statements.dtl
脚注
编辑评论见第475页。
- 收到了2009年3月20日。
- 接受2009年7月7日。
- ©ERS期刊有限公司