摘要
在患者的囊性纤维化(CF)和非CF支气管扩张,铜绿假单胞菌是最重要的呼吸道病原体。它是能够合成氰化氢,细胞呼吸的有效抑制剂。
本研究调查了感染丙型和非丙型支气管扩张症患者的痰中是否存在氰化物铜绿假单胞菌,以及氰化物的检测是否影响肺功能。用氰化物离子选择电极在痰中测定氰化物。
25例支气管扩张症和非支气管扩张症患者中有15例痰中检出氰化物铜绿假单胞菌感染;然而,这不是在任何10例患者中检测到没有这种有机体。Maximum levels were 130 µM (mean±SE72±6.6 µM). Concurrent lung function data were available on all 21铜绿假单胞菌来华的CF患者;在年龄或性别上,有可测的氰化痰者(n = 11)与无氰者(n = 10)并无差异。然而,检测到氰化物者的肺功能明显低于未检测到氰化物者(一秒钟用力呼气量(%预测)26.8±3.8与46.0±6.7%;用力肺活量(%预解码值)44.4±4.9与60.1±7.7%)。
囊肿性纤维化和非囊肿性纤维化支气管扩张症患者的痰中可检出氰化物铜绿假单胞菌和也与肺功能受损相关联。
囊性纤维化(CF)中,铜绿假单胞菌是最重要的呼吸道病原体,它的存在带来更高的发病率和死亡率1- - - - - -4。慢性感染患者有显著较差的肺功能和死亡的风险比非感染患者增多2,3.,5。慢性感染和炎症的最终结果是支气管扩张,支气管树不可逆扩张,粘液堵塞。其他非cf性支气管扩张的患者也有很高的感染率铜绿假单胞菌,这同样与疾病严重程度的增加和生活质量的下降有关6。
被接受的解释慢性的成功建立的因素铜绿假单胞菌CF患者肺部感染的主要原因是黏液纤毛清除和黏液样物质的诱导铜绿假单胞菌。高水平的炎症的细菌脂多糖和其他因素的诱导促进恶化的恶性循环,这有助于渐进肺破坏2,3.,5。生理学中一个有趣的方面铜绿假单胞菌是因为它是能够合成氰化氢的细菌中数量有限的一种吗7。In culture, the levels of cyanide can reach 300–500 μM7- - - - - -9。氰化物生产的目的铜绿假单胞菌目前尚不清楚,但它已被证明是麻痹致死模型的中介因素秀丽隐杆线虫通过铜绿假单胞菌,提高了其致病性的可能性10。此外,氰化物已被发现在烧伤伤口感染引起的P。绿脓杆菌11。氰化物是一种剧毒化合物,它迅速扩散到组织中,不可逆地与目标物结合。氰化物可以抑制许多细胞过程,但它最广为人知的作用是通过与好氧呼吸链末端氧化酶的相互作用来抑制好氧呼吸。铜绿假单胞菌可以避免氰化物的毒性作用,因为它可以合成由氰化物不敏感的末端氧化酶终止的呼吸链8,12,13,虽然积极的解毒机制也可能发挥重要作用14,15。氰化物生产铜绿假单胞菌在低氧浓度下发生;条件铜绿假单胞菌是否存在于CF肺的粘液层16。
本作者的目的是开发用于测量痰氰化并然后确定氰化物是否在CF肺部产生和感染支气管扩张患者的方法铜绿假单胞菌并且,如果存在的话,无论是用在肺功能任何损害相关联。
材料和方法
成年患者来自皇家布朗普顿医院(伦敦,英国)。每个受试者都获得了知情同意,该研究也得到了英国皇家布朗普顿医院(Royal Brompton Hospital)、哈里菲尔德医院(Harefield Hospital, Middlesex, UK)和英国国家心肺研究所(National Heart and Lung Institute, London)伦理委员会的批准。皇家布朗普顿医院的临床微生物实验室使用API系统,通过选择性培养基、显微镜和生化分析方法,对患者痰液中的感染微生物进行了鉴定(法国梅里埃生物梅里埃,玛西·l’etolie)17,18。所有患者铜绿假单胞菌感染时间≤2年,多数为5-10年;因此,所有患者都有慢性感染。总共有75%的患者有感染加重。一个病人被认为感染了铜绿假单胞菌如果细菌从痰培养≥2年,并在氰化物测定后1周内培养。患者被招募到非-铜绿假单胞菌,感染组,如果他们没有成长铜绿假单胞菌过去2年的任何痰标本。所有患者均为成年人,平均年龄(范围)为31.5岁(19-58岁)(27名CF患者)和58.2岁(52-67岁)(8名非CF性支气管扩张患者)。
从新鲜痰液氰化物浓度铜绿假单胞菌艾滋病患者和铜绿假单胞菌,阴性患者使用氰化物电极进行检测。肺功能数据为CF-铜绿假单胞菌回顾性的队列资料被用来确定氰化物的检测和肺功能下降之间是否有相关性。肺功能数据仅在氰化物测定后2周内可用(通常在几天内)。
新鲜的痰标本收集于50毫升聚丙烯试管中,立即用密封橡胶密封(英国诺丁汉科学实验室用品)并置于冰上。在收集后1小时内测定氰化物浓度。为了提高pH值和捕获氰化物,通过橡胶塞将2×体积/重量0.1 M NaOH注入痰液样品中,并对样品进行涡流处理。氰化物测量立即使用IS-146氰化物离子感应电极(Lazar实验室公司,洛杉矶,加利福尼亚,美国)连接到网络扫描pH计(Eutech仪器,Nijerk,荷兰),如前所述9。The electrode was calibrated after every day of use in cyanide standards made up in 0.06 M NaOH. All cyanide measurements made using an NaOH calibration curve were subsequently converted using the following equation (fig. 1⇓):
实际[氰化物]= 0.6747(表观[氰化物]- 52.643)(1)
肺功能测定是根据美国胸科协会/欧洲呼吸学会指南上EasyOne肺活量计(NDD医疗技术,苏黎世,瑞士)进行188bet官网地址19。测量的功能指数为1秒用力呼气容积(FEV)1)和肺活量(FVC);这些数值以病人的年龄、性别和身高的预测值的百分比表示20。当从何处以上患者时间相比指数,该数据被加权,以反映此进行统计分析时。引用的p值是基于所述加权的装置。
均数比较采用非配对t检验或方差分析。p值<0.05为差异有统计学意义。
结果
的方法的发展,以测定在痰氰化物
据作者所知,这是首次使用离子选择电极测定痰中氰化物的研究,因此,有必要开发一种合适的方法。为了检验现有方法的准确性,进行了氰化物尖刺实验,以确定痰中氰化物的含量是否准确。氰化物被添加到a的痰中铜绿假单胞菌,uninfected patient and the cyanide assay clearly demonstrated that it was possible to measure cyanide added to sputum (fig. 1a⇑)。然而,该方法高估了氰化物的浓度,因为电极是在NaOH中校准的,而不是在唾液中。由于供应有限的氰化物阴性痰液,在痰液中常规校准电极是不实际的。在使用三个不同病人的痰进行的三个独立的痰峰试验中,高估值是相同的。这些数据表明,实际氰化物和被测氰化物之间的关系是线性的,因此可以得到描述实际氰化物和被测氰化物之间关系的方程(图1b)⇑)。该方程用于将所有的氰化物测量值转换为实际的氰化物浓度。
氰化物的痰中检测铜绿假单胞菌来华的病人
已经建立的方法从25测量氰化物痰,痰铜绿假单胞菌艾滋病患者和10铜绿假单胞菌-阴性患者随后进行检测。25人中有15人有痰铜绿假单胞菌阳性患者检测呈阳性的氰化物。与此相反,没有从任何10的样品铜绿假单胞菌-阴性患者可检测到氰化物(图2⇓;p < 0.001)。均值中的氰化物浓度检测呈阳性的患者是72±6.6μMμM最多130。
患者年龄与痰中氰化物阳性率(平均年龄±)无相关性SD氰化物阳性和阴性分别为35±3.2年和32±3.3年)或测定的氰化物水平。没有发现在殖民的长度和HCN水平之间的相关性。此外,虽然铜绿假单胞菌氰化物阳性组的负荷范围为103.-10年7cfu·毫升−1在美国,细菌负荷和氰化物水平之间没有相关性(数据未显示)。的病人铜绿假单胞菌-阳性组,~ 75%有感染加重,而氰化物阴性和氰化物阳性样本在有或无感染加重的患者中比例相似。在本研究中,根据敏感性测试和临床考虑,患者被开了一系列的抗假性抗生素,但没有区分氰化物阳性和阴性患者组的模式。
除此之外,还发现了其他种类的微生物铜绿假单胞菌在痰液样本。痰氰酸阳性组和痰氰酸阴性组的平均微生物负荷无显著差异(106cfu·毫升−1两组)。有可能是存在或不存在共感染微生物影响了痰中氰化物的水平,但没有发现这方面的证据。数据如图3所示⇓,示出了平均痰氰化物浓度如何影响一个特定的感染微生物的存在或不存在,证明:1)的存在铜绿假单胞菌是用于检测痰氰化物绝对的要求,即。如果铜绿假单胞菌被检测到不存在无痰氰化物;和2),该氰化物的检测中不与任何其它共感染微生物相关联,指示没有间接作用伯克cenocepacia,金黄色葡萄球菌,假丝酵母白色念珠菌要么烟曲霉在氰化物积累。
痰氰化物与CF患者降低肺功能相关
铜绿假单胞菌感染被广泛认为对肺功能有负面影响。混合氰化痰液阳性和氰化痰液阴性的患者中铜绿假单胞菌-阳性队列使本作者能够检查痰中是否有氰化物本身对肺功能有影响。本研究所有CF患者的肺功能资料均为回顾性资料。为了使影响肺功能的其他因素的差异最小化,我们从CF-中分析肺功能数据铜绿假单胞菌艾滋病患者群体。氰化物阳性组(n = 11)的肺功能指数明显低于氰化物阴性组(FEV)1%预计:26.8±3.8与46.0±6.7%,P <0.01;FVC%预解码值:44.4±4.9与60.1±7.7,p < 0.05;图4⇓这不能用年龄的差异来解释(图4d)⇓)、性别或总微生物病原体计数(图4c⇓)。当检测这些患者在氰化物测定时间前6个月至后6个月的肺功能数据时,氰化物阳性组的平均肺功能指数仍明显低于氰化物阴性组(FEV)1% pred: 35±4.6与54.0±7.0%,P <0.05;FVC%预解码值:44±3.08与64±7.05,p < 0.05;图5⇓)。
讨论
本研究首次证实慢性阻塞性肺疾病和非慢性阻塞性肺疾病合并支气管扩张患者的痰中存在氰化物铜绿假单胞菌。Up to 130 µM cyanide was measured in sputum from CF and bronchiectasis patients with an average concentration of 72 µM. This concentration is of potential clinical significance in comparison with a concentration of 40 μM, which is considered a toxic or lethal blood cyanide level21。
铜绿假单胞菌是良好的生氰菌和在实验室培养积累氰化物浓度高达300 - 500μM吗7,9。低氧和高人口密度的条件铜绿假单胞菌在CF肺的经验是否有助于最大限度地产生氰化物8,16。与痰中氰化物存在相关的唯一因素是铜绿假单胞菌感染;氰化物只有在铜绿假单胞菌是存在的,从来没有发现它的缺席。无论是病人的年龄,还是与其他微生物的共同感染,都不会对氰化物存在的可能性或其含量产生任何影响。因此,对目前的发现最可能的解释是铜绿假单胞菌synthesises氰化物CF和支气管扩张患者的肺部。
一些铜绿假单胞菌感染不会导致氰化物在痰液中积聚,但这不仅仅是细菌负荷的反映;没有区别铜绿假单胞菌菌落形成单位计数之间的病人与未检测到氰化物。因此,这一发现的原因仍然未知,但一种解释是,一些菌株已经失去或大大降低了制造氰化氢的能力。显然,从基因型和表型来看,CF患者痰标本中的细菌种群是混合的22- - - - - -25。关于氰化物,一项167例临床分离的研究铜绿假单胞菌从CF患者中发现74%的菌株可以产生HCN,在103例患者中,83%感染了至少一种可以产生氰化物的菌株在体外26;但显然在CF肺中发现了不产生氰化物的菌株。
群体感应是通过许多细菌,包括所用的调节机制铜绿假单胞菌,这涉及到利用细胞外信号分子来调节表型,以响应种群密度。已知氰化物的产生部分是由这种细菌的聚量感应控制的27- - - - - -29凭借其在合成人口密度高而引起的。然而,尽管铜绿假单胞菌负载范围103.-10年7cfu·毫升−1在氰化物阳性组的痰中,细菌负荷和氰化物水平之间没有相关性。这里有很多问题。首先,主要的气道培养物,如痰培养物,可能不能反映肺中存在的所有细菌,特别是不能反映肺周围的细菌三十。虽然目前的作者没有对氰化物分析的痰标本中的菌株进行分类,但一个有趣的可能性是,氰化物的产生与病人肺部细菌群中特定克隆的存在有关,而不是简单的总数铜绿假单胞菌加载。在这一背景下,有趣的是,利物浦的CF流行株的分离部分铜绿假单胞菌过量产生某些群体感应调节exoproducts,诸如绿脓素和蛋白酶LASA,但没有确定氰化物25,31。然而,LASR群体感应活性降低的突变体也经常在中国被发现铜绿假单胞菌在CF肺部感染期间22。此外,它不是简单的从痰从培养和数据得到的数据之间的外推。还有就是10之间有很大的区别3.细菌菌落·毫升−1在液体培养和不均匀的CF肺环境中分布均匀,产生的痰标本具有相同的净种群密度。造成这种异质性的原因是,细菌会出现在菌落或生物膜结构中16,从而产生高特异性的种群密度,刺激群体感应调节的途径,从而为氰化物的生产创造有利的条件。
除了群体感应,低O2水平也调节HCN合成在体外通过O的作用2传感调节器Anr(精氨酸脱氨酶和硝酸还原酶厌氧调节器)。各种各样的啊2水平预期到CF肺的粘液,这可能进一步调节HCN生产中存在7,16,32。
虽然可能性不大,但不能完全排除痰中氰化物来自非微生物来源的可能性。氰化氢可以由神经组织在应对特定μ-opiate受体激动剂,导致老鼠大脑的平均浓度氰化物6.9μM33。氰化物也已经在健康的气息检测,不吸烟的大部分氰化物的受试者通过唾液在口咽形成34。最有趣的是,人类白细胞受到葡萄球菌epidermidis有报道说会产生氰化氢吗在体外35- - - - - -37。这项工作还没有后续研究,特别是,还没有研究表明有白细胞介导的氰化物产生体内。不能排除氰化物是由宿主的反应引起的P.绿脓杆菌由此引起的气道炎症增多铜绿假单胞菌感染导致白细胞产生氰化物。然而,如果目前作者在痰中检测到的氰化物是由白细胞激活引起的,那么无论感染细菌的性质如何,氰化物的积累都是可以看到的,而不是不能看到的;氰化物生产铜绿假单胞菌具体。此外,未在从痰10检测出的事实氰化物铜绿假单胞菌-阳性患者与此解释不一致。
氰化物时,会产生示范原位在铜绿假单胞菌肺部感染可能是一个重要的临床发现。它提出了一个问题,哪些症状的疾病是由于长期暴露在氰化物的肺组织。氰化物抑制许多代谢过程,但最常见的毒性机制是它与细胞色素的结合和抑制c氧化酶,导致:细胞呼吸的停止;移位到无氧代谢;并在细胞ATP水平的降低21,38- - - - - -40。这总是与细胞毒性缺氧和乳酸性酸中毒有关41。氰化物在本研究中发现的浓度将预期抑制在CF肺部的局部环境细胞呼吸,包括在气道上皮细胞和肺泡巨噬细胞,以及其他入侵的微生物。氰化物将抑制其它含血红素和金属 - 酶,包括超氧化物歧化酶和黄嘌呤氧化酶21而且还可能抑制关键的免疫保护酶,如诱导型一氧化氮合酶的能力铜绿假单胞菌造成慢性感染。然而,cyanide (2 mM) has been found to stimulate the respiratory burst of polymorphonucleates upon phagocytosis42,43,而如果它在肺中发生慢性铜绿假单胞菌感染,可能会导致炎症反应增加和组织损伤增加。在人类,它认为rhodanese(硫代硫酸盐sulfurtransferase)和α-mercaptopyruvate sulfurtransferase有助于消除氰化物的主要途径,将它转换为硫氰酸有毒越少44- - - - - -46。
这是有趣的铜绿假单胞菌感染,以及氰化物在肺内的积聚,与肺功能的显著下降有关。两组肺功能指标均有明显下降铜绿假单胞菌感染的CF患者氰化物阳性痰类似感染患者的氰化物阴性痰比较。最大的影响是对FEV1。在阻塞性肺疾病中,FEV是公认的1与植被覆盖度不成比例地减少,是流量限制的一个指标。虽然HCN的存在与肺功能之间的相关性不能证明氰化物对肺功能的直接影响,但有可能表明这是氰化物在肺环境中作用的直接后果。同样相关的是,在进行氰化物测量的18个月内,研究中的5名患者死亡,其中4人来自氰化物阳性组。
宿主防御系统未能消除铜绿假单胞菌从CF肺部感染知之甚少,它是可能的氰化物生产及其对上皮细胞和免疫细胞功能的影响可能会起到一定的作用。氰化物生产铜绿假单胞菌可能是其控制CF肺内菌群和建立终身感染的能力的一个因素,这加速了肺功能能力的下降1,2。长期接触氰化物可能产生的全身效应铜绿假单胞菌感染需要考虑。
目前的研究虽然是初步的,但已经产生了有趣和重要的数据。为了进一步研究这些发现,未来的工作将需要使用纵向测量来观察氰化物水平如何随时间变化,以及如何反过来影响肺功能。从第一个循环开始跟踪病人铜绿假单胞菌非感染受感染,将有助于因果关系和关联之间确定相对于铜绿假单胞菌、炎症、氰化物和肺功能。
综上所述,本研究表明该菌感染了产氰菌铜绿假单胞菌囊性纤维化和支气管扩张患者的肺部与痰中氰化物的积累有关。此外,氰化物的存在与肺功能下降有关。
支持声明
B.赖亚尔是由来自英国生物技术与生物科学研究理事会助学金支持。
感兴趣的语句
没有宣布。
致谢
本文作者要感谢参与本研究的患者和英国伦敦皇家布朗普顿医院临床微生物实验室的工作人员。
- 收到了2007年11月26日。
- 接受2008年4月21日。
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