文摘
呼出的气息凝结(EBC)可能是一个有吸引力的非侵入性支气管镜检查,支气管肺泡灌洗和诱导痰肺部疾病的诊断和监测。本研究的目的是确定蛋白质EBC的质谱分析。蛋白质EBC的特点是凝胶电泳冻干EBC样本,和个人的蛋白质被质谱鉴定。
唾液,环境空气冷凝(AAC)和EBC收集从正常人类志愿者有或没有一个过滤器来去除空气粒子。在某些情况下,EBC凝聚了压缩空气呼吸。样本冻干,sds - page和肽质量指纹图谱分析。
三大乐队被EBC和AAC格式,通过肽质量指纹识别。的概率Mowse分数是重要的只有细胞角蛋白(CK) 1, CK2 CK10。t(在人类细胞角蛋白的目录,CK2 CK9、CK10 keratinising表皮中描述。唾液不含有角蛋白和压缩空气EBC中明显更少的角蛋白。吸气过滤不去除污染角蛋白。
总之,皮肤角质呼出的气息凝结来源于环境空气而不是从呼吸道。
分析蛋白质,尤其从肺细胞因子,可以有诊断价值和帮助疾病严重程度和活动的分类1。呼出的气息凝结(EBC),最近的美国胸科学会/欧洲呼吸学会工作组188bet官网地址2,通过收集浓缩液体从冷阱的呼出一口气。这种温柔的抽样程序的一个优点是重要的救济为病人。它可以重复使用在同一病人在门诊设置来帮助诊断炎症1、传染病3和肿瘤4疾病。
白细胞介素- 6在EBC ELISA测定了强烈的炎症反应指标5- - - - - -9,探测范围为0 - 3 pg·毫升−1。使用蛋白质凝胶,另一种方法是识别和确认的主要序列肽质量指纹图谱。角蛋白CK1、CK2 CK9和CK10(分子量为67、65、64和56.5 kDa,分别10,11)是常见的污染物的蛋白质鉴定工作12。CK1和CK10仅限于表皮上皮细胞发生皮肤类型分化发展角质层10,13并不断地流到环境中10,14。他们没有被表达在肺15。CK7, CK8、CK18和CK19表达alveolae, CK5/6、CK14 CK17 bronchii表达11,15。蛋白质从EBC只有很少的特征16。当前作者试图发现lung-derived蛋白质凝胶电泳的冻干EBC样本,并识别蛋白质的肽质量指纹图谱。
方法
EBC收集样本,Jaeger Ecoscreen(美国,Viasys医保,肯肖霍肯PA) 30分钟从六个健康不吸烟的工人医院(两个男性,四个女性,年龄28-55年)呼吸空气(EBC)或压缩空气从医院供应(EBCC),从环境空气冷凝(AAC)样本。该项目是在当地伦理委员会注册。在一些实验细菌/病毒过滤(肺机能图、白金汉宫、英国)的负载降低99.99%的粒子> 10−6米或UFTD过滤器(唐纳森,鲁汶,比利时)绝对保留粒子> 2·10−6进气口前插入。当压缩空气被吸入产生EBCC,前插入阀Ecoscreen允许过量空气在潮汐呼吸逃逸到环境中。
等效样本(2±0.2毫升)被冻结干燥速度休假装置(莎凡特SVC100、仪器Inc .)法明岱尔,纽约,美国),并通过sds - page分析17- - - - - -19。彩色带的凝胶,用胰蛋白酶消化,脱盐,使用C18 ZipTip(微孔,哥本哈根,丹麦)和筛选了直接到样板的质谱仪使用α-cyano-4-hydroxycinnamic酸(4毫克·毫升−1组织在70%乙腈/ 0.1%)。样本随后分析matrix-assisted激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)使用Q-Tof天涯全球质谱仪(Micromass /水域Corp .,曼彻斯特,英国)。仪器校准结束了质荷比(m / z)范围50 - 3000使用聚乙二醇混合物和glu-fibrinopeptide B(分子量1570.677 kDa;σ,Brøndby,丹麦)锁质量。反射器模式被激活,所有样品在正极性模式下进行分析。激光枪(10 Hz)积累直到得到一个满意的信噪比是结合时,平滑。碰撞能量在串联质谱实验是50 - 120 eV和氩作为碰撞气体。质量精度是所有女士分析一般< 30 ppm。质谱是在正离子模式范围800 - 3000 m / z。的确定质量SwissProt / TrEMBL肽用于查询20.使用吉祥物搜索引擎或NCBInr蛋白质数据库(矩阵科学,伦敦,英国)21。肽质量公差的搜索进行50 ppm, carbamidomethyl修改半胱氨酸残基,并允许一个错过了胰蛋白酶的乳沟。只有重大打击所定义的吉祥物概率分析和至少5场比赛的肽质量被接受。后天MALDI-Q-TOF数据从MassLynx Version 4.0 (Micromass /水域corp .)和序列处理的大规模光谱数据进行了使用GPMAW软件(灯塔数据,欧登塞,丹麦)22。
结果
一个代表性的凝胶如图1所示⇓(EBC-labelled车道)。乐队的分子量为66 kDa包含CK1 CK2,包含CK10 55个kDa的乐队和分子量。乐队在6日至14日kDa包含CK2的片段。蛋白质的可能的肺动脉起源肽检测如表1所示⇓。排除唾液的角蛋白来源,分析了唾液在SDS凝胶(图1 c⇓)。主要乐队相同分子量的乐队中确定α-amylase EBC中裂解酶和溶菌酶,由质谱分析。没有唾液中的角蛋白肽,无论是α-amylase还是发现了溶菌酶在EBC。
识别蛋白质出席水平不是由silver-stained sds - page检测,一个整除的EBC冻干的,大小和分离排除列成分数更大,小于30 kDa。这两个分数被质谱分析。没有在低分子量肽被确定分数,而角蛋白K1和K10再次确认在高分子量部分(没有显示)。
作为EBC没有角质的类型通常与肺癌和唾液中发现,肺外调查可能的来源。水溶性蛋白的头皮冲洗一个参与者包含类似的蛋白质模式EBC 50 - 66 kDa之间与大型乐队,和一个小乐队在6日至14日kDa(图1 d⇑)。
表明EBC源于环境空气中的角蛋白,疲软的真空源在EcoScreen画环境空气的呼吸区域通过冷阱实验对象没有抽到人类的肺。冷凝收集到的环境空气的体积(3.29±1.43毫升)小于EBC收集在同一时间(7.58±1.70毫升)。集中和分析类似EBC,和包含CK1 CK2(图1⇑)。
的角质EBC似乎源于环境空气,肺活量描记器过滤器或UFTD过滤器前被放在线Ecoscreen从环境空气进气移除碎片。过滤器没有把数额可观的蛋白质从EBC或AAC(没有显示)。
环境空气含有污染角质,EBC从主题浓缩呼吸压缩空气从医院空气供给。这大大减少了角蛋白的EBC样本(图1 b⇑)。甚至没有液体可以从压缩空气冷凝收集时间延长至2 h时,可能是因为没有干燥压缩空气中的水分。EBC压缩在压缩空气的体积(6.72±1.66毫升)类似于压缩空气。
讨论
在试图确定小说在EBC的蛋白质凝胶电泳,当前作者只有成功地发现皮肤角质,十有八九碎片从人类环境空气(表2中角质层⇓)。从皮肤角质,流不断,是一个无处不在的污染物的蛋白质鉴定工作12。目前作者的知识,这是第四个出版16,24,25文档,角蛋白是蛋白质的主要成分中发现EBC,第一要考虑的角蛋白发现源于皮肤,因为它不是表现在肺。随着角质负载不能减少过滤器去除病毒和细菌,keratin-containing碎片必须小。也是第一次减少角质内容记录在空气吸入代EBC不是环境空气,但压缩空气,可能含有更少的角蛋白。EBC压缩在压缩空气的体积很小,压缩空气,说明激发空气湿润均匀度的航空公司。
蛋白质乐队在67年、65年和56.5 kDa包含CK1 CK2、CK10,分别构成完整的角蛋白。变量乐队< 20 kDa可能代表降解产物。从其他一些蛋白质,肽包括角质,EBC(表1中发现⇑),但是软件分配的身份带t确定最可能的候选人,CK2 CK1010。虽然肺来源的肽的蛋白质被发现,概率的Mowse得分只有重要的角蛋白K1, K2和K10。
目前的数据表明,大多数蛋白质EBC实际上是分子碎片脱落的角质层吸入了空气。激发空气湿润,相对寒冷的角蛋白分子可以作为焦点的水分子凝结。溶菌酶和α-amylase唾液样本中发现而不是EBC,确认没有唾液污染时收集EBC Ecoscreen。本研究在健康受试者中执行。相似的研究特征明显的肺病患者应该执行。
支气管肺泡灌洗和EBC角蛋白含量按重量相似25。EBC的吸烟者包含大量CK9和CK10升高24。皮肤的吸烟者往往比不吸烟者的年龄和周转更快,因此吸烟者会有更多皮肤碎片环境空气。
当前作者没有发现任何细胞因子在呼出的气息凝结。肽质量指纹可能不够敏感,蛋白质的检测极限由可视化乐队在sds - page,最多140 pg·毫升−1(1 ng 7毫升的呼出的气息凝结)19。ELISA检测极限的人类白细胞介素- 6由开曼化学(爱沙尼亚塔林),通常被用于分析呼出的气息凝结,是1.5 pg·毫升−1,这是敏感100倍。白细胞介素- 6的浓度在呼出的气息凝结是< 3 pg·毫升−15- - - - - -9。因此,120 - 700毫升的呼出的气息凝结需要想象白细胞介素- 6在呼出的气息凝结在凝胶肽质量指纹图谱。细胞因子只有被ELISA和记录,作为蛋白质的主要重量分数呼出的气息凝结来源于环境空气,它就变成了重要决定细胞因子以EBC源自肺或他们是否喜欢角质,从环境空气碎片。
感兴趣的语句
没有宣布。
确认
I.B. Thøgersen(部门的分子生物学、奥尔胡斯大学奥尔胡斯,丹麦)提供优秀的技术援助和d·克努森(丹麦奥尔胡斯,IDWorks)援助与图1所示。
- 收到了2007年5月16日。
- 接受2007年10月14日。
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