摘要gydF4y2Ba
在哮喘和慢性阻塞性肺疾病患者中,添加长效βgydF4y2Ba2gydF4y2Ba-激动剂(LABA)与糖皮质激素(GCS)的联合使用比单独增加GCS的剂量效果更好。在平滑肌细胞和成纤维细胞中,一个明显的潜在机制涉及laba激活糖皮质激素受体(GR)的能力。gydF4y2Ba
本研究探讨了福莫特罗(FORM)、沙美特罗(SALM)和布地奈德(BUD)对支气管上皮细胞GR激活的影响gydF4y2Ba通过gydF4y2Ba肿瘤坏死因子-α刺激的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)释放,GR核易位和GR调节的报告基因活性。gydF4y2Ba
BUD和FORM均抑制GM-CSF释放≤50%。这两种药物的联合使用,在临床相关浓度下,抑制GM-CSF释放85%至未刺激水平。BUD和SALM联合使用也有类似的抑制作用。FORM抑制GM-CSF合成的能力没有因rna介导的GR和FORM的小干扰消耗或salm诱导的GR转位到细胞核而改变。此外,FORM没有激活gr调节的报告基因活性(没有测试SALM),与BUD的明显作用相反。gydF4y2Ba
结论:在支气管上皮细胞中,氟莫特罗和沙美特罗对粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子合成的抑制作用不明显gydF4y2Ba通过gydF4y2Ba先前已证实糖皮质激素受体相关机制,提示这些细胞存在替代通路。gydF4y2Ba
- 抗炎gydF4y2Ba
- 糖皮质激素受体gydF4y2Ba
- 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子gydF4y2Ba
- 长效βgydF4y2Ba2gydF4y2Ba受体激动剂gydF4y2Ba
- 小干扰RNAgydF4y2Ba
- 免疫印迹gydF4y2Ba
糖皮质激素(GCS)和长效βgydF4y2Ba2gydF4y2Ba-激动剂(LABAs)是治疗哮喘最有效的两种药物;它们比单独使用高剂量的GCS能更好地控制哮喘,尤其是联合使用时gydF4y2Ba1gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba.在布地奈德(BUD)中加入福莫特罗(FORM)可改善哮喘的疾病控制gydF4y2Ba1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba还有慢性阻塞性肺病gydF4y2Ba4gydF4y2Ba,gydF4y2Ba5gydF4y2Ba.显然,FORM和其他laba的支气管扩张剂活性有助于这种益处,但最近的证据表明βgydF4y2Ba2gydF4y2Ba-激动剂有助于控制哮喘gydF4y2Ba通过gydF4y2Ba其他机制。例如,βgydF4y2Ba2gydF4y2Ba-激动剂(或其他环磷酸腺苷(cAMP)升高剂)发挥抗炎活性gydF4y2Ba6gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba9gydF4y2Ba并减少气道平滑肌增生gydF4y2Ba10gydF4y2Ba.gydF4y2Ba
βgydF4y2Ba2gydF4y2Ba-激动剂具有在GR配体缺失的情况下激活糖皮质激素受体(GR)的潜力,这是β抗炎活性的机制之一gydF4y2Ba2gydF4y2Ba受体激动剂gydF4y2Ba10gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba12gydF4y2Ba.原代人肺成纤维细胞、气道和血管平滑肌细胞、巨噬细胞和支气管上皮细胞暴露于沙美特罗(SALM)或FORM;这导致GR转位到细胞核,并与糖皮质激素反应元件(GREs)结合。β受体拮抗剂普萘洛尔阻断了这一事件,表明这一过程是受体依赖的。在一项在大鼠肝癌细胞中进行的相关研究中,福斯科林诱导cAMP可在4小时内增加GR蛋白和mRNA水平gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba地塞米松结合试验和RNA印迹杂交,由于GR信息半衰期延长gydF4y2Ba13gydF4y2Ba.但是,增加了绑定gydF4y2Ba3.gydF4y2Bah -地塞米松也可能反映了由camp活化蛋白激酶A (PKA)诱导的GR磷酸化状态的改变。已知GR上有7个不同的磷酸化位点调节GR的非活性、非激素结合形式和活性gcs结合受体之间的转换gydF4y2Ba14gydF4y2Ba,gydF4y2Ba15gydF4y2Ba.此外,“活性”磷酸化状态的改变可以进一步增强GR的激活状态,从而产生更有效的受体,例如,更大的转激活能力gydF4y2Ba14gydF4y2Ba.Doucas的一项研究进一步支持了这一点gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba16gydF4y2Ba,其中PKA被证明与GR相互作用,从而改变其活性(可能通过对GR的磷酸化),随后与核因子(NF)-κB结合。gydF4y2Ba
气道上皮细胞通过产生多种介质,包括粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素-8,放大哮喘的炎症gydF4y2Ba17gydF4y2Ba.气道上皮细胞也是最先暴露于治疗性GCS和β的细胞gydF4y2Ba2gydF4y2Ba这两类药物的联合作用减少了促炎介质的分泌gydF4y2Ba9gydF4y2Ba,gydF4y2Ba18gydF4y2Ba,gydF4y2Ba19gydF4y2Ba.在本研究中,前面描述的FORM抗炎活性背后的机制gydF4y2Ba9gydF4y2Ba研究了FORM激活GR的概念是否也适用于人类支气管上皮细胞。在缺乏或存在BUD的情况下,以临床相关浓度和临床相关比例研究FORM和SALM。主要发现是,与单独使用任何一种药物相比,BUD和FORM联合应用对正常人支气管上皮细胞肿瘤坏死因子(TNF)-α触发的GM-CSF释放具有更好的抑制作用。低(10gydF4y2Ba−12gydF4y2Ba米芽/ 10gydF4y2Ba−10gydF4y2BaM FORM)和高(均为10gydF4y2Ba−6gydF4y2BaM)浓度组合。观察到的影响不能归因于FORM对GR的激活,例如,小干扰(si)RNA和GR核易位。用SALM也得到了类似的结果。与早期的出版物相比gydF4y2Ba11gydF4y2Ba,gydF4y2Ba12gydF4y2Ba关于不同类型的细胞,本文提出的证据表明,另一种机制是负责FORM在正常人支气管上皮细胞中的抗炎活性。gydF4y2Ba
材料与方法gydF4y2Ba
细胞培养gydF4y2Ba
原代正常人支气管上皮细胞(NHBE) (Clonetics NHBE 7310;Clonetics, San Diego, CA, USA)从Biowhittaker (Västra Frölunda,瑞典)获得,并根据制造商说明书(Clonetics)在支气管上皮细胞生长培养基(BEGM)中培养。在实验过程中,细胞生长在不完全的BEGM培养基中,缺乏氢化可的松、维甲酸和肾上腺素,以下简称-BEGM培养基。在汇合度为60%时,实验开始,在-BEGM培养基中使细胞饥饿24小时;然后,TNF-α、FORM、SALM和/或BUD以不同浓度加入不同时间。实验在80-90%合流时结束,要么用冰冷的PBS (Western blot)清洗细胞一次,要么对细胞培养基取样并测量相应孔中的DNA含量(ELISA)。在不同传代号(p3-p6)下重复实验。gydF4y2Ba
人支气管上皮细胞株ChaGo-K1来自美国类型培养收藏(Rockville, MD, USA)。ChaGo-K1细胞在含有谷氨酰胺的RPMI 1640培养基(Invitrogen, Paisley, UK)中繁殖gydF4y2BaTMgydF4y2Ba1 (gydF4y2BalgydF4y2Ba-analyl -gydF4y2BalgydF4y2Ba谷氨酰胺;Invitrogen),添加10%胎牛血清(FCS;Gibco,奥克兰,新西兰),1%非必需氨基酸(Invitrogen), 1%丙酮酸钠(Invitrogen)和1% 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙基磺酸(Invitrogen)。用pSV-β-半乳糖苷酶报告载体(Promega, Madison, WI, USA)稳定转染的ChaGo-K1细胞用于监测GRE和12-gydF4y2BaOgydF4y2Ba- tetradecanoylphorbol13 -acetate反应元件(TRE)介导的效应:ChaGo-GRE与工程pMAMneo载体,包括调控序列4×GRE TATA融合到编码报告基因lacZ的质粒DNA, ChaGo-TRE与工程pMAMneo载体,包括调控序列5×TRE TATA融合到编码报告基因lacZ的质粒DNA。将融合细胞暴露于不同浓度的4-β-磷-12-肉豆蔻酸-13-乙酸酯(PMA)、FORM和/或BUD 24小时,浓度为60%。通过添加颜色底物以停止β-半乳糖苷酶活性(报告基因测定),实验在80-90%合流时终止。gydF4y2Ba
核转染gydF4y2Ba
目前研究中使用的所有siRNA双核苷酸都是通过Dharmacon Research, Inc. (Lafayette, CO, USA)预先合成并订购的。分别在6孔或24孔板中培养人支气管上皮细胞(ChaGo-K1和NHBE细胞),使用Oligofectamine将人GR siRNA双核苷酸转染到细胞中gydF4y2BaTMgydF4y2Ba(Invitrogen),根据制造商的说明进行以下轻微改动。转染前,细胞用1 mL无FCS培养液(ChaGo细胞)或1 mL无BPE培养液(NHBE细胞)洗涤一次,随后再用600 μL新鲜的无FCS/BPE培养液重新喂养,然后在每孔中加入400 μL适当的转染混合物。然后细胞在CO中孵育4小时gydF4y2Ba2gydF4y2Ba培养箱(5% CO)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba, 95%湿度,37°C)。孵育后,每孔加入1ml含有双FCS/BPE的新鲜培养基,然后重新孵育细胞。转染24小时后,用PBS(不含钙、镁和碳酸氢钠)清洗细胞两次,用1ml -BEGM培养基使细胞饥饿,开始实验。转染48小时后,收集总蛋白进行Western blot分析,以确定GR的抑制,或进一步繁殖以进行功能实验(报告试验和ELISA)。gydF4y2Ba
GR易位的Western blot分析gydF4y2Ba
根据Eickelberg的方法,在指定的时间点制备受刺激或未受刺激细胞的核和细胞质提取物gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba11gydF4y2Ba.将细胞从60mm培养皿中刮取到Eppendorf管中,置于200µL低盐缓冲液(20 mM羟乙基哌酸乙烷磺酸(HEPES), pH 7.9;10mm KCl;0.1 mM NagydF4y2Ba3.gydF4y2Ba签证官gydF4y2Ba4gydF4y2Ba;1mm EDTA;0.2% Nonidet P-40;10%甘油补充一套蛋白酶抑制剂(完全gydF4y2BaTMgydF4y2Ba;罗氏诊断,曼海姆,德国))。冰孵育10 min后,13000 ×离心gydF4y2BaggydF4y2Ba4°C浸泡2 min,取上清液为胞浆提取物。含核球团在高盐缓冲液(20 mM HEPES, pH 7.9;420 mM NaCl;10mm KCl;0.1 mM NaVOgydF4y2Ba4gydF4y2Ba;1mm EDTA;20%甘油,补充CompletegydF4y2BaTMgydF4y2Ba),以冰摇30min提取核蛋白。样品在13000 ×离心gydF4y2BaggydF4y2Ba4℃浸泡10 min,取上清液作为核提取物。为了确定siRNA转染细胞后GR的下调,分离出细胞总蛋白gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba.细胞从六孔板刮入Eppendorf管中,100µL裂解缓冲液pH为6.5 (50 mM HEPES, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgClgydF4y2Ba2gydF4y2Ba, 10mm NagydF4y2Ba3.gydF4y2Ba签证官gydF4y2Ba4gydF4y2Ba, 0.1% Nonidet P-40, 0.5 mM二硫苏糖醇和100 μ M NaF,补充CompletegydF4y2BaTMgydF4y2Ba),在冰上孵育10分钟。将裂解物冷冻,使用前通过16000 ×离心解冻并清除gydF4y2BaggydF4y2Ba4°C 10分钟。为了加载等量的蛋白质用于凝胶分析,使用Bradford方法测定蛋白质浓度(Dc蛋白测定;Bio-Rad,赫拉克勒斯,CA,美国)。4× Laemmli样品缓冲液分别检测细胞质蛋白(80 μg)、核蛋白(20 μg)和细胞总蛋白(30 μg)。样品煮沸8分钟,并装入10%的聚丙烯酰胺凝胶。将蛋白质转移到硝化纤维中(Amersham Pharmacia Biotech, Amersham, UK),然后将膜在5%牛奶/0.05%吐温-20中在4℃的PBS中阻塞过夜。膜在PBS/0.05%吐温中洗涤两次5分钟,并与抗GR的一抗在PBS/0.5%吐温/5%牛奶中孵育1.5小时,室温下摇床。膜在PBS/0.5%吐温中洗涤三次15分钟,并与过氧化物酶偶联二抗在PBS/0.5%吐温/5%牛奶中室温孵育1小时。在用PBS/0.5%吐温洗涤三次10分钟后,最后在PBS中洗涤一次,根据制造商的说明(Amersham Pharmacia Biotech),用化学发光法检测偶联过氧化物酶。作为蛋白质负载量的控制,膜的肌动蛋白进行评估,肌动蛋白是一种不受药物影响的细胞骨架蛋白。 To quantify the nuclear import of GR, the density of the lanes was measured and analysed通过gydF4y2BaImageQuant (Amersham/GE Healthcare,乌普萨拉,瑞典),并以图形形式展示。gydF4y2Ba
报告基因分析gydF4y2Ba
报告基因分析基于在96孔板中培养的ChaGo-K1细胞的两种稳定转染物制备的裂解物中的β-半乳糖苷酶活性。将BUD暴露于ChaGo-GRE细胞诱导GRE调控启动子序列,导致报告酶分子β-半乳糖苷酶的激活。ChaGo-TRE细胞暴露于10 ng·mLgydF4y2Ba−1gydF4y2BaPMA刺激,gydF4y2Ba通过gydF4y2Ba转录因子激活蛋白(AP)-1, TRE启动子序列,随后导致β-半乳糖苷酶活性。刺激24小时后,用适当的底物:ChaGo-GRE和邻硝基苯-β-在37℃处理细胞1小时gydF4y2BadgydF4y2Ba和ChaGo-TRE与4-甲基伞形基β-gydF4y2BadgydF4y2Ba-galactoparanoside。在此期间,β-半乳糖苷酶将无色底物水解为邻硝基酚(黄色)或7-羟基-4-甲基香豆素(粉红色)。在水解反应终止后,在420 nm处测量ChaGo-GRE裂解物的吸光度,而荧光水平(激发量360/40;测定ChaGo-TRE裂解物的发射量460/40)。gydF4y2Ba
DNA测定及ELISAgydF4y2Ba
测定了DNA的数量gydF4y2Ba通过gydF4y2Ba纳入Hoechst H33342 (Sigma Aldrich,斯德哥尔摩,瑞典),在激发下测量荧光(λgydF4y2Ba前女友gydF4y2Ba)和发射(λgydF4y2Ba新兴市场gydF4y2Ba)波长λgydF4y2Ba前女友gydF4y2Ba360 /λgydF4y2Ba新兴市场gydF4y2Ba460,根据布拉赫塔的修正方法gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba21gydF4y2Ba.将培养皿离心并除去细胞培养基后,将24孔培养皿冷藏,如下所示。在孔中加入600 μL PBS(或标准曲线样品),然后加入400 μL (10 μg·mL)gydF4y2Ba−1gydF4y2BaH33342。用锡纸覆盖培养皿,在室温下孵育30分钟。测定荧光,计算DNA含量,单位为μg·mLgydF4y2Ba−1gydF4y2Ba.根据制造商的说明,使用研发系统公司(Abingdon, UK)的ELISA试剂盒测定每种实验条件下的GM-CSF水平。GM-CSF以μg·mL为单位表达gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba与每孔DNA含量有关。所有样品分析一式两份。gydF4y2Ba
数据分析gydF4y2Ba
实验至少重复了三次。所有报告基因活性和细胞因子数据均以算术平均值±表示gydF4y2Ba扫描电镜gydF4y2Ba.载体处理细胞作为对照。统计学分析采用不等方差非配对t检验,以p≤0.05为显著性。gydF4y2Ba
计算GRE活性的上调和TRE活性的抑制如下:gydF4y2Ba
%上调= ((Abs药物/Abs控制)-1)×100 (1)gydF4y2Ba
%抑制= (1 - (λgydF4y2Ba新兴市场gydF4y2Ba药物/λgydF4y2Ba新兴市场gydF4y2BaPMA控制))×100 (2)gydF4y2Ba
其中Abs是吸光度。gydF4y2Ba
结果gydF4y2Ba
布地奈德和福莫特罗抑制TNF-α诱导的NHBE细胞GM-CSF释放gydF4y2Ba
BUD和/或FORM的效果(10gydF4y2Ba−12gydF4y2Ba-10年gydF4y2Ba−6gydF4y2Ba用TNF-α (10 ng·mL)刺激NHBE细胞后,研究NHBE细胞对GM-CSF释放的影响gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba).平均而言,TNF-α诱导GM-CSF水平增加6倍,从~ 200 pg·mL开始gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba至1100 pg·mLgydF4y2Ba−1gydF4y2Ba.BUD或FORM以浓度依赖的方式将GM-CSF的释放减少≤50%(图1a)gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba).SALM也有类似的浓度依赖性抑制(数据未显示)。10时FORM的效果次优gydF4y2Ba−11gydF4y2Ba≥10时为最佳gydF4y2Ba−10gydF4y2BaM。10时BUD的疗效次优gydF4y2Ba−9gydF4y2BaM和最大值≥10gydF4y2Ba−8gydF4y2BaM。当以不同浓度和比例用BUD和FORM组合处理细胞时,观察到GM-CSF进一步减少85%,甚至低于基础水平(图1bgydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba).因此,与单独使用药物获得的部分抑制相比,BUD与FORM联合使用完全阻止了GM-CSF释放的触发,即使在较低浓度的组合下也是如此。gydF4y2Ba
临床常用的BUD/FORM比例为35:1,也用BUD的比例为10进行了测试gydF4y2Ba−8gydF4y2BaM和FORM在2.8×10gydF4y2Ba−10gydF4y2BaM或10倍以下浓度的固定组合(bud10gydF4y2Ba−9gydF4y2Bam,来自2.8×10gydF4y2Ba−11gydF4y2BaM) 24小时(图1cgydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba).至于其他浓度,与单组分相比,BUD和FORM联合使用对TNF-α诱导的GM-CSF释放具有更强的抑制作用。当BUD与SALM在10时联合使用时,也观察到类似的效果gydF4y2Ba−9gydF4y2Ba和10gydF4y2Ba−8gydF4y2BaM(图1cgydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba).gydF4y2Ba
福莫特罗对GR激活可能影响的试验gydF4y2Ba
为了探索FORM是否能够激活GR, FORM的抗炎作用是否被调节gydF4y2Ba通过gydF4y2Ba进行GR、Western blot检测(研究GR从细胞质转位到核区室)、GRE/ tre调控报告基因检测(研究GR转录激活),并完成GR消耗实验gydF4y2Ba通过gydF4y2Ba核。gydF4y2Ba
BUD在15分钟内诱导GR的浓度和时间依赖易位进入细胞核,在那里它至少停留了4小时。6小时时,核信号恢复正常(图2)gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba).都不是FORM(图3)gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)或SALM(图4 .gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)在任何检测的时间点或浓度诱导易位。此外,FORM没有改变BUD诱导的GR易位(图5)gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba).gydF4y2Ba
为了研究BUD和FORM可能的加性效应,采用GRE和TRE报告系统。GRE报告系统由抗炎GR调节,TRE报告系统由fos-jun异源二聚体AP-1激活。在gre依赖的系统中,FORM没有独立的活性(除非在最高浓度时),也没有正向或负向影响BUD的激活(图6)gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba).测试了各种浓度组合(数据未显示);所有的结果都是FORM对BUD提高GRE成绩的能力同样没有影响。gydF4y2Ba
当化合物在tre依赖的报告系统中测试时,BUD和FORM都表现出适度的、浓度依赖的基因表达抑制(数据未显示)。当它们以各种组合添加在一起时,抑制作用比单独的任何一种成分都要大,证实了在NHBE细胞中看到的结果。这些结果证明,FORM对GRE活性的缺乏影响不是由于毒性,而是由于FORM不能(进一步)激活GR。gydF4y2Ba
为了测试BUD或FORM对细胞因子合成的抑制是否依赖于GR的功能,用siRNA转染NHBE细胞对抗GR,结果在48小时内GR的表达几乎完全降低(图7agydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba为转染后72 h的Western blot)。这种减少是由于sirna介导的GR的抑制,而不是由于非特异性毒性,因为用scramble和lamin sirna处理的细胞显示出明显的GR带。此外,通过目测,GR siRNA处理后细胞的一般形态没有改变。gydF4y2Ba
在对照转染的细胞中,BUD和FORM都能抑制TNF-α诱导的GM-CSF水平,导致细胞暴露于这两种药物时产生加性抑制。通过特定siRNA降低GR水平仅抑制了BUD对TNF-α诱导的GM-CSF水平的影响,而FORM的影响未变(图7)gydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba).gydF4y2Ba
讨论gydF4y2Ba
β的基本原理gydF4y2Ba2gydF4y2Ba-激动剂在哮喘中的使用主要基于其支气管扩张特性;然而,对支气管上皮细胞和炎症细胞的其他影响可能有助于在低GCS浓度下更好地控制哮喘gydF4y2Ba22gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba24gydF4y2Ba.例如,βgydF4y2Ba2gydF4y2Ba-激动剂抑制肥大细胞释放组胺,通过阻止内皮细胞分离减少血浆渗出,抑制支气管上皮细胞和成纤维细胞释放细胞因子,阻断感觉神经激活gydF4y2Ba8gydF4y2Ba,gydF4y2Ba9gydF4y2Ba,gydF4y2Ba22gydF4y2Ba.其中一个潜在的机制是β激活GRgydF4y2Ba2gydF4y2Ba-激动剂,如前所述,在人肺成纤维细胞和气道/血管平滑肌细胞gydF4y2Ba10gydF4y2Ba,gydF4y2Ba11gydF4y2Ba.此外,Usmani最近的一篇论文gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba12gydF4y2Ba在哮喘患者的痰源性上皮细胞和巨噬细胞中证实了GR易位。gydF4y2Ba
本研究的重点是TNF-α刺激GM-CSF的产生,因为该细胞因子由哮喘患者的支气管上皮细胞大量分泌,并通过支持激活的嗜酸性粒细胞的流入来促进气道炎症的发病机制gydF4y2Ba25gydF4y2Ba,gydF4y2Ba26gydF4y2Ba.GM-CSF能够促进嗜酸性粒细胞和其他炎症细胞的分化、激活和存活,这一过程是由TNF-α、环境颗粒、氧化剂等多种刺激触发的gydF4y2Ba等gydF4y2Ba,从而激活促炎转录因子,如NF-κB和AP-1,并随后由气道上皮细胞转录GM-CSFgydF4y2Ba18gydF4y2Ba,gydF4y2Ba27gydF4y2Ba,gydF4y2Ba28gydF4y2Ba.在本文中,BUD、FORM和SALM浓度依赖性地降低了GM-CSF水平约50%。联合使用时,它们的疗效至少是加性的,导致GM-CSF降低到基础水平。当以临床上最常见的Symbicort®(阿斯利康,隆德,瑞典)的比例(35:1)给药BUD和FORM时,可以观察到剂量-反应曲线的移位,例如BUD/FORM组合为10gydF4y2Ba−9gydF4y2Ba米/ 2.8×10gydF4y2Ba−11gydF4y2BaM降低受刺激的GM-CSF水平到类似程度,高浓度组合10gydF4y2Ba−6gydF4y2Ba米/ 10gydF4y2Ba−6gydF4y2BaM。这非常符合所描述的临床观察,即在BUD中加入FORM比单独使用浓度高4倍的BUD具有相同或更好的哮喘控制效果gydF4y2Ba1gydF4y2Ba.gydF4y2Ba
本作者接下来研究了NHBE细胞中LABAs的这种抗炎功能是否通过配体独立的GR激活来调节。核易位和β激活GRgydF4y2Ba2gydF4y2Ba-激动剂已在人肺成纤维细胞、气道/血管平滑肌细胞和痰源性上皮细胞和巨噬细胞中被描述gydF4y2Ba10gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba12gydF4y2Ba.然而,在本研究的NHBE细胞中,FORM和SALM在任何测试的时间点或浓度都没有将GR转移到细胞核中。这反映在FORM的报告系统中缺乏GRE活动。正如预期的那样,BUD同时诱导GR核易位和GRE活性。FORM并没有增强BUD诱导的GR的核易位,这在GRE报告结果中再次得到了反映。这些结果与Usmani的结果相冲突gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba12gydF4y2Ba其中,SALM在痰上皮细胞中发生GR核易位(尽管非常微弱,仅为8%),SALM可增强丙酸氟替卡松(FP)诱导的GR核易位(与单独使用FP相比提高了12%)。在同一项研究中gydF4y2Ba12gydF4y2Ba单独使用SALM对支气管上皮细胞株BEAS2B GR易位无影响;此外,这些细胞中的GRE报告基因不受影响,尽管SALM增强了FP诱导的这些效应。类似地,在更早的时候,SALM和FORM都被证明可以增强地塞米松诱导的GR与GRE的结合,以及地塞米松诱导的分泌性白细胞蛋白酶抑制剂的产生(一种GR依赖的过程),但SALM和FORM都没有发现可以增强GR易位gydF4y2Ba29gydF4y2Ba.gydF4y2Ba
在本研究中,FORM和BUD能够独立降低ap -1调节的TRE活性30-40%。当FORM和BUD联合使用时,获得了附加的TRE抑制,这与GM-CSF生产的结果一致。在其他实验中,GR主要是通过GR特异性siRNA被敲除的,实验证明,在去除GR后,FORM对GM-CSF的抑制作用仍然持续。这与先前获得的结果一致,即GR拮抗剂RU486没有改变FORM对GM-CSF的还原能力gydF4y2Ba9gydF4y2Ba.然而,由于在某些情况下,RU486已被证明具有激动剂的作用,使用siRNA的新技术证实了结果,阐明了机制。综上所述,这些结果证实了GR在支气管上皮细胞FORM的抗炎活性中缺乏参与。在他们最近的论文中,聂gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba描述了β抗炎活性的另一种机制gydF4y2Ba2gydF4y2Ba受体激动剂。在人气道平滑肌细胞中,SALM被证明可以抑制组蛋白H4乙酰化和NF-κB (p65)与DNA的结合,导致TNF-α诱导的eotaxin释放减少。这种抑制不是由于p65核易位的减少,而是表明在CREB结合蛋白(CBP)/p300上存在核相互作用。GR和/或CREB与CBP/p300的结合可以干扰NF-κB与GR的相互作用或募集,阻断其组蛋白乙酰转移酶(HAT)活性,使启动子无法与NF-κB结合。这与伊藤的发现非常吻合gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba31gydF4y2Ba,当GR以去乙酰化的形式存在时,它们表现出更好的抗炎功效。因此,如果HAT活性被阻断,组蛋白H4和GR都不会被乙酰化,从而导致炎症减轻。这一机制可能适用于本研究;地塞米松并没有阻止HeLa细胞中p65向细胞核的易位,TNF-α添加到bud刺激的细胞中也没有改变GR核易位(数据未显示),这表明所有的抑制相互作用都发生在细胞核中。gydF4y2Ba
从目前的实验可以得出结论,FORM在人支气管上皮细胞中的抗炎作用不能归因于GR的激活。各种替代机制可以解释β的抗炎作用gydF4y2Ba2gydF4y2Ba-激动剂和改善抗炎活性的βgydF4y2Ba2gydF4y2Ba-激动剂/GCS组合观察到较低的BUD浓度已被描述。例如,βgydF4y2Ba2gydF4y2Ba-激动剂可以增加GR的mRNA半衰期,导致GR水平增加,从而增加GCS的易感性gydF4y2Ba13gydF4y2Ba.似乎没有任何证据表明在NHBE细胞中发生了这种机制,因为在测量的6- h时间尺度内,Western blot分析没有观察到GR量的变化。然而,由于没有检测到mRNA,也没有研究超过6 h的时间点,不能完全排除这种机制。此外,PKA改变了GR的磷酸化状态,β激活gydF4y2Ba2gydF4y2Ba-激动剂,导致更敏感的GR,改善GCS/GR或GR/NF-κB结合gydF4y2Ba13gydF4y2Ba,gydF4y2Ba16gydF4y2Ba.由于FORM没有改变GR易位或由BUD诱导的GR激活,因此FORM是否改变配体激活GR的磷酸化状态尚不确定gydF4y2Ba2gydF4y2Ba-激动剂能够激活转录因子cAMP反应元件结合蛋白,cAMP反应元件结合蛋白与促炎转录因子NF-κB和AP-1相互作用,或干扰其信号转导途径,从而减轻炎症gydF4y2Ba22gydF4y2Ba.PKA抑制剂可以阻断FORM对TNF-α诱导的GM-CSF的抑制作用,这一事实为信号转导途径的存在和cAMP的抗炎作用提供了支持。这一信号转导途径可以解释本研究的结果,并可能是β的一种可能途径gydF4y2Ba2gydF4y2Ba-激动剂在支气管上皮细胞中传递抗炎活性。gydF4y2Ba
综合目前和早期发表的结果来看,βgydF4y2Ba2gydF4y2Ba-激动剂对糖皮质激素受体信号传导的影响在不同的细胞类型中涉及不同的机制。虽然其在正常支气管上皮细胞中的作用机制尚未明确,但目前的研究表明,在哮喘治疗中,布地奈德和福莫特罗联合使用会比单独使用任何一种成分在更大程度上限制支气管上皮细胞炎症诱导的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的产生,且浓度更低。gydF4y2Ba
致谢gydF4y2Ba
作者要感谢C. Hall-Jackson对siRNA实验的投入和专业知识,M. Juhlin对实验的贡献,以及E. Wieslander和D. Silberstein对手稿的科学投入和帮助。gydF4y2Ba
- 收到了gydF4y2Ba2006年10月4日gydF4y2Ba
- 接受gydF4y2Ba2007年6月21日gydF4y2Ba
- ©ERS期刊有限公司gydF4y2Ba
参考文献gydF4y2Ba
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