抽象的
本研究的目的是研究非结核分枝杆菌(NTM)肺疾病患者和健康对照组外周血单核细胞上toll样受体(TLR)2的表达,并评估这些单核细胞对TLR2激动剂的反应分枝杆菌脂磷壁酸(LTA)。
采用逆转录酶- pcr方法分析17例NTM患者和10例健康对照者外周血单核细胞中TLR2 mRNA的表达情况。检测细胞因子IL - 12p40和TNF -α的mRNA和蛋白分泌水平。
刺激后外周血单核细胞的TLR2 mRNA的表达M. Avium.或LTA在NTM患者中低于健康对照。患者的IL-12 P40和TNF-αmRNA和细胞因子分泌水平也比健康对照较低。用抗TLR抗体治疗减少M. Avium.- LTA诱导的IL-12 P40和TNF-α在健康对照中产生,但不含NTM患者。
本结果表明,Toll样受体2的下调和所得的白细胞介素-12p40和肿瘤坏死因子-α降低分枝杆菌或脂磷壁酸刺激可能有助于宿主对非结核分枝杆菌肺病的易感性。
由不泛骨的分枝杆菌(NTM)引起的肺病的发病率似乎在全球范围内升起,但目前尚不清楚这是由于增强的检测或对感染负担的实际增加1- - - - - -4.由于NTM引起的肺病通常发生在结构肺病中,如慢性阻塞性肺病,结核病和肺炎。NTM肺病也发生在女性的情况下,没有明确认可的易感因素5,6.虽然支气管扩张和NTM感染经常在这些患者中共存(结节性支气管扩张),但支气管扩张是否真的由NTM感染引起或是否是有利于NTM感染的易感性仍存在争议1,2.
NTM是普遍存在的环境生物。由于接触这些生物体是普遍的,疾病的发生是罕见的,正常的宿主防御机制必须足够有效,以防止感染5.因此,患有NTM肺病的健康人可能具有导致NTM感染的特定易感性因素7.
toll样受体(Toll-like receptor, tlr)是重要的模式识别受体,在宿主对入侵病原体的先天防御机制中起作用结核分枝杆菌和特种加工8,9.通过这些受体发出信号导致各种细胞因子/介质的转录和翻译10,11.NTM信令需要TLR212,13并增加易感性M. Avium.最近在TLR2敲除小鼠中报道感染14.此外,缺乏骨髓分化因子(MYD)88缺乏的小鼠更敏感M. Avium.感染15.这些结果提示感染是机会性的M. Avium.种通过TLR2和myd88依赖方式控制。
尽管对具有TLR2缺乏和细胞 - 培养研究的动物进行了各种研究,但结果仍然不清楚这些结果是否可靠地反映了人类的发病机制和免疫力的机制,并且可以研究TLR2在NTM感染和免疫中的作用。在本研究中,研究了TLR2的表达对NTM肺病患者的外周血单核细胞和健康对照组。这些单核细胞对TLR2激动剂的反应M. Avium.和脂肪酸碱酸(LTA)来自金黄色葡萄球菌也比较了。NTM肺病患者的TLR2表达较低,因此预计在NTM患者中将抑制外周血单核细胞对TLR2激动剂的响应。
患者和方法
研究人群
本研究包括17名患有Nodular支气管疾病形式的NTM肺病和10名健康志愿者(表1⇓).在17名患者中,八名患者展出M. Avium-intacellulare复合感染9例M.横坐标感染。NTM肺疾病的诊断依据美国胸科协会公布的诊断标准1并且所有患者都有关于高分辨率计算断层扫描的特征调查,例如双侧支气管扩张与多个小结节和分支线性结构相结合16.两组患者在开始抗生素治疗前取外周血30 mL。该研究由韩国首尔三星医疗中心的机构审查委员会批准,并获得了所有参与者的书面知情同意。
外周单核细胞的制备和刺激
使用标准密度梯度离心与Ficoll-hypaque(Sigma,St.Louis,Mo,USA)分离外周血单核细胞与肝素化全血。将细胞培养2小时并用Dulbecco的PBS(Sigma)洗涤以除去非更抗性细胞。为了确定粘附细胞是否是单核细胞,将细胞用抗CD14-荧光素异硫氰酸酯(FITC)标记并通过流式细胞术检查。对于流式细胞术分析,FITC标记的抗CD14购自埃比斯科(SAN Diego,CA,USA),并通过FACSCAN流式细胞仪(Becton Dickinson免疫抑制测定法,圣何塞,CA,USA)来分析流式细胞仪分析。单核细胞(1×106细胞·毫升−1),然后用它刺激米.鸟结核(美国型文化收藏25291; 1×106 colony-forming units·well−1)或LTA来自S.金黄色葡萄球菌(10μg·mL−1;Invivogen,San Diego,CA,USA)在37°C的0,2,4,6和24小时。
总RNA分离、cDNA合成及RT-PCR
用RNAzol分离总RNATM值使用AccessQuick™RNA-PCR系统(Promega, Madison, WI, USA)进行cDNA合成和逆转录酶(RT)-PCR。从总RNA中合成第一链cDNA,在DNA热循环器(Hybaid, Teddington, UK)中,45°C, 45分钟。随后进行40个周期的PCR扩增。扩增的PCR产物在2%琼脂糖凝胶上得到确认,凝胶条带使用带有Bio-1D V.97软件的磷酸化成像仪(Vilber Lourmat, Marne-la-Vallée,法国)进行定量分析。TLR2、白细胞介素(IL)- 12p40、肿瘤坏死因子(TNF)-α cdna的扩增引物见表2⇓.在用TLR2激动剂刺激之前,在刺激后再次在2,4,6和24小时刺激之前进行RT-PCR。
细胞因子测定
在刺激单核细胞后,在0,2,4,6和24小时,米.鸟结核或LTA,收集无细胞(清除)上清馏分并分析细胞因子释放情况。上清液在-70°C下等量保存,直至用于实验。使用市售ELISA试剂盒(Biosource, Camarillo, CA, USA)测定IL-12 p40和TNF-α的浓度。
添加抗人类TLR2抗体
进行抗人TLR2抗体的阻断实验以检查TLR2信号传导障碍是否会降低TLR2激动剂诱导的细胞因子产生。前米.鸟结核或LTA刺激,将外周血单核细胞与抗TLR2抗体预孵育(10μg·mL−1;eBioscience)室温保存30分钟。然后用这种方法刺激细胞米.鸟结核或LTA 24小时。进行RT-PCR和细胞因子测定以分别测定IL-12 P40和TNF-αmRNA和蛋白质分泌水平。
统计分析
大多数数据不是正态分布的。因此,所有的值都表示为中位数和四分位区间(25和75个百分位),数据采用非参数分析。患者与对照组之间各变量的差异用Mann-Whitney u检验进行评估。p值<0.05被认为有统计学意义。
结果
外周血单核细胞TLR2 mRNA的表达
本文作者首先检测了健康对照组外周血单核细胞对两种不同TLR2激动剂反应时TLR2 mRNA表达的动力学,米.鸟结核和lta。TLR2 mRNA的水平在感染后2小时内增加M. Avium..RT-PCR分析显示,健康对照组中TLR2 mRNA表达呈时间依赖性增加(图1)⇓).在这些对照单核细胞中,LTA诱导的TLR2 mRNA表达程度与由LTA诱导的TLR2 mRNA表达程度相似米.鸟结核(数据没有显示)。
与对照组相比,NTM患者未受刺激的单核细胞显示TLR2 mRNA水平下降,尽管这种差异没有统计学意义。刺激后米.鸟结核, TLR2 mRNA水平略有升高,呈平缓的斜率。与对照组相比,患者TLR2 mRNA水平在感染后4 h显著降低(p<0.05在4、6和24 h;图1⇑).LTA刺激对TLR2 mRNA表达的影响类似于M. Avium.感染(数据未显示)。
il - 12p40和TNF-α mRNA的表达
比较分析M. Avium.- 在NTM患者和健康对照中进行细胞因子基因表达。在健康的控制中,米.鸟结核刺激导致IL-12 p40和TNF-α的mRNA水平以时间依赖性的方式增加。表达在未受刺激和米.鸟结核患者的刺激单核细胞显着低于健康对照(在所有时间点P <0.05;图2⇓).LTA刺激与那些相似的效果M. Avium.感染(数据未显示)。
IL-12 p40和TNF-α分泌
本作者还比较了患者的IL-12 P40和TNF-α产生响应并对照单核细胞进行刺激M. Avium.或LTA,使用ELISA套件。IL-12 P40和TNF-α的浓度在未刺激和米.鸟结核-刺激的单核细胞显著低于对照组(除4 h TNF-α水平外,其他时间点均p<0.05;图3⇓).LTA刺激产生了类似的结果(数据未显示)。
抗tlr2抗体对il - 12p40和TNF-α产生的抑制作用
最后,对单核细胞进行刺激米.鸟结核或在存在或不存在抗TLR2抗体中的LTA。如图4所示⇓,抗体治疗基本上抑制了米.鸟结核在健康对照组中,IL-12 p40的抑制水平远高于在患者中观察到的水平(50与8%的抑制)。抗体治疗也降低了米.鸟结核-诱导的TNF-α合成在对照组中的程度大于患者(51与24%)。此外,治疗后细胞因子分泌显着降低(IL-12 P40和TNF-α的六倍和两倍),用于来自健康对照的单核细胞而不是来自患者的单核细胞。然而,抗体治疗没有显着改变患者单核细胞的IL-12 P40或TNF-α分泌反应与刺激米.鸟结核或本公司。
讨论
据目前作者所知,目前的研究是第一次检测NTM肺病患者TLR2 mRNA表达及其与细胞因子反应的关系。目前的数据表明,两者都是M. Avium.和LTA诱导来自健康对照的外周血单核细胞中的TLR2 mRNA表达,随后上调IL-12 P40和TNF-α表达和生产。然而,在NTM患者的外周血单核细胞中,TLR2 mRNA表达(和IL-12 P40和TNF-α表达和生产)的诱导发生在显着较小程度上。因此,目前的研究结果表明,响应的诱导TLR2表达损害M. Avium.或LTA刺激可能有助于宿主对NTM肺病的敏感性。
由于非结核分枝杆菌是普遍存在的有机体,大多数动物对NTM感染具有抗性,除非它们的防御机制发生了医源性改变。然而,使健康人易患NTM肺病的免疫功能障碍的确切性质尚不清楚。一些研究比较了NTM患者和健康对照组外周血单个核细胞的免疫激活17,18已经表明,患者响应于各种抗原而产生较低浓度的IL-12和TNF-α和更高浓度的IL-10。这些结果表明,抑制了NTM患者的T辅助细胞(TH)1型免疫应答,而TH2型反应增强。因此,1型细胞因子级联的缺陷可能会增强对NTM感染的易感性。然而,负责这种免疫不平衡的机制仍然是未知的。
TLR2在NTM感染的免疫应答中至关重要,是诱导IL-12所必需的,IL-12在促进Th1应答中起主要作用8- - - - - -11.鼠巨噬细胞的感染米.鸟结核以前显示出上调TLR2 mRNA表达12,13并且TLR2激活诱导来自特定吞噬子子集的IL-12和TNF-α的早期生产。以前的在体外研究表明,TLR2刺激负责米.鸟结核-诱导小鼠巨噬细胞促炎Th1细胞因子的上调12,13,19.此外,TLR2在控制动物研究中的NTM感染方面发挥着重要作用。例如,控制牛分枝杆菌芽孢杆菌在老鼠中的Calmette-guerinI.P.感染依赖于TLR220.和冯et al。15发现TLR2缺陷的小鼠的细菌负荷增加,易感性增加M. Avium.与野生型小鼠相比感染。
尽管这些发现强烈表明TLR2表达的调节是NTM肺病易感性的重要决定因素,但NTM肺病与TLR2和细胞因子表达之间的关系尚未被研究过。在本研究中,我们发现M. Avium.和LTA下调TLR2 mRNA表达,IL-12 P40和TNF-α在NTM患者的外周血单核细胞中产生。此外,用抗TLR2抗体的治疗阻止米.鸟结核- 和LTA诱导的细胞因子基因产生和随后的健康对照中的细胞因子分泌,但在患者的那些中只有很小的效果。这些结果表明米.鸟结核- 和LTA诱导的IL-12 P40和TNF-α的激活主要通过TLR2介导。
IL-12是干扰素-γ产生的主要刺激,并且它在形成先天和适应症之间的主要联系方面发挥着关键作用21,22.TNF-α对于针对分枝杆菌病的保护性的发展是必不可少的23.与NTM患者的细胞因子谱一起服用17,18,目前的数据表明,TLR2的下调可能在介导宿主防御损伤中发挥关键作用,并支持TLR2缺陷在宿主易感性NTM肺病中发挥重要作用的假设。
最近对TLR2多态性的研究表明TLR在人体分枝杆菌疾病中的重要性。TLR2的Arg677TRP多态性与Lepromatous Leprosy相关24和肺结核25,TLR2的Arg753gln多态性与结核病有关26.此外,TLR2基因内含子II中的鸟嘌呤-胸腺嘧啶重复多态性与结核病的发生有关27.然而,这些基因多态性是否决定了NTM肺病的易感性尚不清楚28.
目前的研究有几个重要的局限性。外周血细胞中的基因表达可能不能反映NTM实际感染部位肺中的基因表达反应。外周血单核细胞可以反映气道细胞的免疫反应性,但外周血单核细胞的免疫反应可能由于肺中缺乏局部免疫调节机制而受到干扰29,30..因此,需要进一步研究TLR2 mRNA的表达和随后使用支气管肺泡灌洗细胞或肺组织的细胞因子免疫反应。
此外,尽管TLR2的下调导致IL-12 p40和TNF-α的生成减少M. Avium.或发现NTM肺病患者的LTA刺激,这种关系的性质仍然不确定。本数据与TLR2的下调导致或促进NTM肺病的发育的下调通过减少IL-12 p40和TNF-α的产生。另外,TLR2的下调可能是一种次级现象。也有可能是NTM感染导致了本研究中观察到的差异。需要对NTM肺病治疗成功后的患者进行进一步的研究。
综上所述,toll样受体2 mRNA的表达响应于刺激分枝杆菌或者脂质单胞质在非萎缩的神经肺病患者的外周血单核细胞中较低,而不是来自健康对照的那些。Lipoteichoic acid-和分枝杆菌诱导的mRNA表达、白细胞介素-12 p40和肿瘤坏死因子-α的产生也低于对照组。因此,目前的研究结果表明,toll样受体2的下调和随后的白细胞介素-12 p40和肿瘤坏死因子-α的减少分枝杆菌感染可能有助于宿主对不泛骨神经治疗肺病的影响。这种疾病与大量发病率有关;目前使用慢性,多药治疗的策略无效,可具有各种副作用。理解负责的细微介素-12p40和肿瘤坏死因子-α产生的对接触性受体2的下调和相关减少负责的精确机制可以促进免疫调节策略的发展,以治疗或预防非泛植物神经治疗肺病。
- 已收到2007年4月3日。
- 接受2007年6月3日。
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