抽象
肺凝血障碍hyperinflammation可能有助于败血症的不利结果。本研究确定在上内毒素血症的大鼠模型支气管止血和炎症凝血天然抑制剂的影响。
雄性Sprague-Dawley大鼠随机接受生理盐水、重组人活化蛋白C (APC)、血浆来源的抗凝血酶(AT)、重组人组织因子通路抑制剂(TFPI)、肝素或重组组织纤溶酶原激活剂(tPA)的治疗。大鼠静脉注射脂多糖(LPS),诱导全身炎症反应和肺部炎症。分别于LPS注射后4 h和16 h灌血和支气管肺泡灌洗,测定凝血和炎症标志物。
LPS注射导致了血栓蛋白- at复合物水平的增加,而纤溶酶原激活剂的活性减弱,无论是在系统上还是在支气管肺泡腔内。APC、AT和TFPI显著限制lps诱导的肺内血栓蛋白复合物的产生,而tPA刺激肺纤溶活性。然而,没有一种药物对肺细胞因子、趋化因子、中性粒细胞内流和髓过氧化物酶活性的产生有显著影响。
凝固的天然抑制剂防止凝血支气管激活,但不引起大鼠内毒素血症的肺部炎症反应的重大变化。
严重脓毒症是一种临床综合征特征在于全身炎症反应和凝血的活化,可能导致相关的凝血因子不受控制消费纤维蛋白和微血管栓塞或出血的血管内沉积1。在生理情况下,凝固的活化是由凝固的天然抑制剂调节,即活化的蛋白C(APC),抗凝血酶(AT)和组织因子途径抑制剂(TFPI)。在脓毒病,这些抗凝剂系统由炎症介质,其形成用于这些天然抗凝血途径的治疗恢复的理由削弱,很可能是由于大量消耗和下调2。不幸的是,血浆来源的AT3和重组人(rh)TFPI4未能减少严重败血症患者的死亡率。在关键性III期临床试验,结果显示rhAPC患者生存显著上升五,但有大约由APC防止死亡的确切机制的辩论。
一个由APC发挥其保护作用而提出的机制涉及包括肺部途径。肺是脓毒症相关的多器官功能衰竭的最经常涉及的器官系统。值得注意的是,APC治疗引起败血症时呼吸衰竭的更快速解决6并限制嗜中性粒细胞的两个凝结和涌入在实验性肺损伤肺隔室7,8。在脓毒症患者数量相对有限,肺保护作用也与AT治疗期间建议9和TFPI10,但这些在更大的Ⅲ期临床试验未证实3,4。本研究采用大鼠内毒素血症模型,假设APC、AT和TFPI对肺凝血和炎症有不同的作用,这可能解释了人类脓毒症的不同结果。
材料与方法
大鼠
Male Sprague-Dawley rats (200–250 g) were purchased from Harlan (The Hague, the Netherlands). The rats were allowed to acclimatise to laboratory conditions for ≥7 days (12/12 h day–night cycle at 22°C). The Institutional Animal Care and Use Committee of the Academic Medical Centre (University of Amsterdam, Amsterdam, the Netherlands) approved all experiments. All animals were handled in accordance with the guidelines prescribed by the Dutch legislation and the international guidelines on protection, care and handling of laboratory animals.
学习规划
Endotoxaemia was induced by administration of 7.5 mg·kg-1脂多糖(LPS)从大肠杆菌0111:在异氟醚(3%)麻醉下,B4(西格玛,美国密苏里州圣路易斯)进入阴茎静脉。该模型的初步研究表明,LPS注射可导致一过性超急性全身炎症反应,在1-2小时内,全身肿瘤坏死因子(TNF)- TNF -,白介素(IL)-6和细胞因子诱导的中性粒细胞趋化剂(CINC)-3水平达到峰值。此后,这些促炎介质在循环中检测不到,对全身和肺凝血功能的影响持续时间≤24 h。注射LPS后16小时,除了中性粒细胞浸润外,肺组织未见重大组织病理学改变。大鼠随机分为安慰剂组(生理盐水组)或天然抗凝剂组:APC、AT或TFPI组(每组8个)。此外,肝素和组织纤溶酶原激活剂(tPA)也参与了随机化过程。4只无内毒素血症的健康大鼠作为对照组。所有药物均以2 mL·kg的丸剂给药-1,注射LPS前30分钟。治疗剂量是根据以前的研究数据确定的4,10-14。All the agents and doses that were used are described in table 1⇓。考虑到血浆的清除,大鼠在注射LPS后16 h处死,在6 h和12 h再注射APC、TFPI、肝素或tPA。所有大鼠均给予等量液体(2ml·kg)-1) at 6 and 12 h.
大鼠were sacrificed with intraperitoneal injections of ketamine 80 mg·kg-1(Eurovet, Bladel, the Netherlands) and medetomidine 0.5 mg·kg-1(Novartis, Arnhem, the Netherlands) at 4 and 16 h after LPS injection. Blood was collected from the inferior vena cava in citrated (0.109 M) vacutainer tubes. The right lung was ligated and the left lung was lavaged three times with 2 mL ice-cold normal saline. Right lungs were weighed and homogenised in four volumes (即无菌盐水的四倍肺重量(毫克),在μL),使用均化组织(Biospec产品,Bartlesville的,OK,USA)。每个灌洗样品中总细胞数目通过自动细胞计数器(; Coulter电子海厄利亚,FL,USA库尔特计数器)确定。在灌洗液中性粒细胞计数在姬姆萨染色细胞分离制剂进行。
用于凝结测定,血浆和从支气管肺泡灌洗的无细胞上清液中。For cytokine and chemokine measurements in lungs, supernatants were used from lung homogenates which were diluted 1:1 in lysis buffer (150 nmol·L-1氯化钠;15 mmol·L-1三;1 mmol·L-1MgCl2-H2O;1 mmol·L-1氯化钙2;1%的Triton X-100;and 100 μg·mL-1胃蛋白酶抑制剂A,亮肽素和抑蛋白酶肽)。
测定
凝血酶 - 抗凝血酶复合物(TATC;贝林,马尔堡,德国)和纤维蛋白降解产物(FDP; Asserachrom d-狄; Diagnostica公司Stago公司,塞纳河畔阿涅勒,法国)用ELISA法测定。AT,纤溶酶原激活物活性(PAA)和纤溶酶原激活物抑制剂(PAI)-1活性通过自动化酰胺分解测定测量15-17。使用ELISA(R&d系统,阿宾登,UK)测定TNF-α水平,IL-6和CINC-3。髓过氧化物酶(MPO)活性通过测定为H确定2Ø23,3依赖性氧化',5,5'-四甲基联,并表示为每克肺组织的活动18。
统计分析
所有数据都表示为平均值±SEM或中值(四分位数间距)适当。使用单向ANOVA或Kruskal-Wallis检验进行的实验组和盐水治疗安慰剂组之间的比较,随后事后杜纳氏或唐恩的测试,具体取决于数据的分布。p值<0.05被认为是统计学显著。
结果
凝血和纤溶
与未注射脂多糖的对照组相比,内毒素血症导致TATc生成增加(图1)⇓),而APC、AT和TFPI在LPS注射后的第4和16小时均减弱了该效应(图1a)⇓)。等离子体PAA LPS注射后显著下降;tPA的增加PAA到水平超过最大测定在两个时间点(p<0.001与盐水;图。 1b⇓)。AT治疗前后血浆PAA均显著高于盐水治疗(p<0.01)与盐水;图。 1b⇓)。
Furthermore, bronchoalveolar levels of TATc were increased by endotoxaemia (fig. 2⇓)。APC、AT和TFPI限制了脂多糖诱导的支气管肺泡TATc的生成(p<0.001与盐水两种时间点;图。 2a⇓), thereby preventing a decrease in AT activity and limiting FDP generation (figs 2b⇓和c)。Heparin treated rats also showed less bronchoalveolar TATc but only at 4 h (fig. 2a⇓), while AT activity was not different from saline treated rats (fig. 2b⇓)。Pulmonary PAA in lungs was significantly reduced by endotoxaemia, with concurrently enhanced PAI-1 activity in lungs (fig. 3⇓)。tPA的增加支气管PAA和FDP水平(均P<0.001与盐水两种时间点;figs 3a⇓和2c⇓),而废除增强PAI-1活性(对<0.001与盐水两种时间点;图。 3b⇓)。
炎症反应
During rat endotoxaemia, TFPI treatment enhanced IL-6 generation in lungs at 16 h (p<0.01与盐水;图。 4b⇓);所有其他试剂不诱导TNF-α,IL-6和CINC-3的水平肺显著变化。Inflammatory cell influx into the lungs was not observed at 4 h after LPS injection. There was an increase in neutrophil counts in the lungs during endotoxaemia at 16 h, but there were no differences in the number of neutrophils between the anticoagulant groups and the saline group (table 2⇓)。Finally, MPO in lung tissue was not influenced by any treatment (table 2⇓)。
讨论
本作者已经表明系统性抗凝血药涂改支气管凝固的内毒素血症中的应用。APC,AT和TFPI对限制凝血酶生成,全身也可在支气管车厢重大影响。然而,各种药剂对肺部炎症非常有限的影响,这表明炎性反应不显著通过肺凝血本身改变定向,至少不会在内毒素血症的本大鼠模型。这个问题:“什么样的机制考虑与各种抗凝策略在临床结果的差异?”仍然没有得到解决。
内毒素性肺损伤的发病机制,具有重要作用已被归因于嗜中性粒细胞。Uchibaet al。19证明内毒素诱导的Wistar大鼠肺血管损伤主要是由中性粒细胞激活介导的。利用该模型,验证了APC的可行性20在有或无肝素联合给药21和TFPI15对活化的中性粒细胞有抑制作用,从而限制了内毒素给药后1小时内中性粒细胞的积累、MPO活性和细胞因子的产生。此外,研究还表明,向肺内内毒素挑战的健康志愿者输注rhAPC可显著抑制中性粒细胞内流7。在本大鼠模型,中性粒细胞聚集和MPO活性在肺不显著任何给予代理商的改变。这与以往的研究差异可能是由内毒素交货,品种,调查时间点,并在实验模型中性粒细胞参与后续的不同角色差异引起的。值得注意的是,在大多数以前的研究中,抗炎作用是在超急性期研究内毒素攻击后(例如1 h). The present results illustrate that it is relevant to include later time-points in which the local host response may significantly be altered, although systemic effects have subsided.
肝素是一种广泛使用的抗凝剂,它通过结合AT和促进其抗凝血活性的作用。肝素曾在羊内毒素血症期间已显示出发挥肺保护作用16,而低分子量肝素已经能够在endotoxaemic猪限制肺损伤17和老鼠18。In the present experiment, heparin had a mild anticoagulant effect and a modest antifibrinolytic effect: pulmonary TATc and systemic PAA were decreased at 4 h after LPS injection, while pulmonary PAI-1 activity was increased after 16 h. This is in contrast with在体外数据表明,肝素具有促纤溶作用22。肝素的抗凝血剂的限制作用可能已经造成剂量不足,但它也有可能是增加AT消费导致了抗凝血活性受损。值得注意的是,与肝素治疗没有导致肺里改变炎症反应。反对抗凝策略的tPA来刺激纤维蛋白溶解。增加纤维蛋白溶解活性没有影响中性粒细胞涌入肺,也没有ALTER的炎症介体。
本研究的一个最重要的局限性是内毒素血症的大鼠模型。气管内直接灌注内毒素或气管内直接灌注内毒素的肺损伤模型通过内毒素血症已被常规的实验研究中使用,由于其相对容易,重复性好。应当指出的是,内毒素引起的肺损伤是肺炎患者或败血症急性肺损伤的简化模型。如果急性肺损伤有关,感染过程,凝血干扰理论上可以限制初级感染的遏制,促进微生物的传播23。此外,抗凝剂是通过一次性注射,而不是持续静脉注射。大剂量注射抗凝剂可以限制支气管肺泡的凝固;然而,抗炎作用(例如中性粒细胞迁移)7连续输注,需要以保持恒定的血浆水平。尽管本模型的局限性,应该指出的是,目前的结果是符合患者从研究数据腹部手术继发性腹膜炎后24。在该研究中,患者表现出在外科手术之后的短暂的全身炎症反应综合征,其随后在肺部产生深远的促凝血响应24。目前的模型至少在部分程度上模拟了这种临床模式:大鼠内毒素血症也引起了短暂的全身炎症反应,同时在稍后的时间点诱导肺凝血病变。这一发现是有趣的,特别是在病人在危重疾病中可能遇到的多重伤害过程。
综上所述,研究表明,在大鼠内毒素血症模型中,全身应用天然抗凝剂可显著抑制凝血过程中的支气管肺泡活化,但对细胞因子和趋化因子的产生以及中性粒细胞的迁移和活性没有明显影响。目前尚不清楚控制肺凝血是否对患者预后有显著影响,因此需要在适当的临床试验中确定。
- 收到2006年12月20日。
- 公认2007年5月14日。
- ©ERS Journals Ltd