抽象
本研究旨在探讨特发性或硬皮病相关性肺动脉高压(PAH)患者和健康对照者抗成纤维细胞抗体的存在。
右心导管记录肺动脉高压(静息时平均肺动脉压>25 mmHg)。特发性多环芳烃(n = 35)、硬皮病相关多环芳烃(n = 10)患者的血清免疫球蛋白(Ig)G和IgM反应性,采用细胞ELISA和免疫印迹法对正常人成纤维细胞进行无PAH弥漫性(n = 10)或局限性(n = 10)硬皮病和年龄性别匹配的健康人(n = 65)进行检测。
所评估通过ELISA,14的35(40%)患者的特发性PAH和四分之三的10(30%)患者硬皮病相关的PAH表达的抗成纤维细胞IgG抗体。的IgG绑定到一个主要的40 kDa蛋白带的所有个人。的IgG从患者特发性PAH结合两个25-和60-kDa的条带与来自其它个体比IgG更高的强度。
总之,免疫球蛋白G抗成纤维细胞抗体存在的患者的肺动脉高压的血清英寸从患者的特发性肺动脉高血压或硬皮病相关的肺动脉高压免疫球蛋白G表示与成纤维细胞的抗原的反应性不同的简档,这表明不同的靶抗原。
肺动脉高压(PAH)是一种罕见的临床状况导致进行性右心脏衰竭而死亡1。PAH is defined by a mean pulmonary artery pressure >25 mmHg at rest or >30 mmHg with exercise in the absence of a post-capillary process as assessed by right-heart catheterisation2。PAH发生作为肺小动脉继发于功能障碍和血管内皮细胞的增殖,血管平滑肌细胞和成纤维细胞慢性阻塞的后果3。
根据于2003年在威尼斯世界卫生组织分类4,PAH被归类为特发性(IPAH),家族性或与之相关的其他条件:右芬氟拉明治疗1,HIV感染五,门静脉高血压,先天性心脏疾病,和结缔组织疾病,如系统性硬化症(硬皮病)。因此,硬皮病患者的~10-14%PAH发展6,这是负责死亡率很高。
内皮和内部弹性层,称为新内膜肌纤维母细胞之间和细胞外基质的层的形成,是严重的PAH的标志。在缺氧模型中,外膜成纤维细胞似乎是激活的增殖和合成基质蛋白响应于肺高血压刺激第一单元7。
迄今为止,在多环芳烃患者血清中鉴定自身抗体的研究很少。IPAH或SSc相关PAH患者抗内皮细胞免疫球蛋白G抗体的研究进展8。由于成纤维细胞功能障碍已在两个SSC和IPAH,并且由于其能够激活和诱导抗成纤维细胞的抗体被鉴定胶原合成已硬皮病患者的血清中检测到9,目前的作者分析了抗成纤维细胞抗体的反应性特征谱的患者IPAH或SSC-相关PAH和健康人。
材料和方法
耐心
所有患者根据拉萨伯特慈善医院集团(法国巴黎)的伦理委员会递交了书面知情同意书。PAH was detected as systolic pulmonary artery pressure >40 mmHg upon echocardiography, and confirmed by right-heart catheterisation as mean pulmonary artery pressure at rest >25 mmHg. By convention, PAH patients were labelled as having IPAH if they displayed PAH with no evidence of an associated disease (corresponding to sporadic, familial and fenfluramine-associated PAH). SSc patients fulfilled the LeRoy and Medsger10和/或美国风湿病协会11标准。血清是从65名患者获得:连续35名IPAH患者(20散发性PAH,10与右芬氟拉明曝光和五个与家族性PAH相关的PAH)在安托万·贝克利尔医院(法国Clamart)的肺病系;和30名连续的SSc患者中,包括10个与SSC-相关的PAH(SSC-PAH),10限定的皮肤无硬皮病PAH和10与漫硬皮病无PAH,高知医院的内科部门(巴黎,法国)。Disease duration was significantly longer in SSc patients than in IPAH patients (table 1⇓). 所有无PAH的弥漫性SSc患者都有间质性肺病,通过胸部高分辨率计算机断层密度测定进行评估,肺活量预测值<80%,和/或扩散能力预测值<75%。所有患者均未接受皮质类固醇或免疫抑制剂治疗,也未患癌症或其他结缔组织疾病。共有65名年龄和性别匹配的健康献血者作为对照。
免疫球蛋白来源
Serum samples from all patients and healthy controls were stored at -80°C until tested and diluted to IgG and IgM concentrations of 100 and 20 μg·mL-1,分别测试时。IgG和IgM抗体浓度通过比浊法测定。正常人IgG的治疗制剂(静脉注射免疫球蛋白;Tegeline®;LABORATOIRE法语杜Fractionnement Biologique等德生物技术,雷祖里镇,法国),并担任内部标准正常人多克隆的IgM(LABORATOIRE法语杜Fractionnement Biologique等德生物技术)。
ELISA检测抗成纤维细胞的抗体的
以细胞为基础的ELISA对固定和未发酵的成纤维细胞进行检测12。另外,为了调整对于批间变异性,正参考血清的光密度值被任意定义为抗成纤维细胞活性的100%。测试样品的结果表示为这个正参考值的百分比。所有样品一式两份进行测试。
抗成纤维细胞和抗的HEp-2细胞的抗体的免疫印迹法检测
使用具有正常的人成纤维细胞和HEp-2细胞半定量免疫印迹技术抗体反应进行分析。
Cellular protein extraction was performed in a buffer containing 4% sodium dodecyl sulphate (SDS), 1.45 M 2-mercaptoethanol, 125 mM Tris/HCl pH 6.8, 1 μg·mL-1aprotinin, 1 μg·mL-1pepstatin and 1 μg·mL-1leupeptin and then sonicated 4×30 s. Equal amounts of solubilised proteins were subjected to preparative SDS–polyacrylamide gel electrophoresis through 10% polyacrylamide gels. The proteins were transferred to nitrocellulose membrane for 1 h at 0.8 mA·cm-2使用半干electroblotter(模型A; Ancos,Hojby,丹麦)。After blocking with PBS-0.2% Tween for 90 min, the membranes were incubated with sera for 4 h at room temperature, at 100 μg·mL-1IgG or 20 μg·mL-1IgM抗体在盒Miniblot系统(Immunetics公司,剑桥,MA,USA)。They were then extensively washed before being incubated with either secondary rabbit anti-human crystallisable fragment (Fc)-γ or Fc-μ antibody coupled to alkaline phosphatase (Dako, Glostrup, Denmark) for 90 min at room temperature. Immunoreactivities were revealed using the nitroblue tetrazolium–5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate substrate (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA). Immunoreactivities were quantified by scanning the membranes with a densitometer (Epson Perfection 1200S; Seiko Epson Corporation, Nagano-Ken, Japan). The membranes were then stained with colloidal gold (Protogold®; Biocell, Cardiff, UK) and subjected to a second densitometric analysis to quantify transferred proteins. This approach allows the immunoreactivity repertoires to be compared by referring to their respective protein peaks corrected for electrophoretic migration defects by superimposing corresponding protein peaks using computer analysis. Standard IgG or IgM preparations, included in each blot, allow rescaling of the membranes transferred with a given protein extract and adjustment for the intensity of labelling on different membranes13,14。
统计分析
用于ELISA的数据的分析,两个组的平均相对光密度用t检验进行比较。免疫印迹数据提交给多元统计分析,因为大量的反应性的揭示。因此,IGOR软件(伊戈尔临3.16,Wavemetrics公司,奥斯威戈湖,OR,USA)特别设计的包和SYSTAT软件(版本11.0,SYSTAT软件公司,里士满点,CA,USA),使用。每个病人和对照对每一个不同的蛋白质提取物的IgG和IgM的反应性的光密度的曲线被分成围绕每个基片上的免疫反应性的各个峰部分。选择八至十个部分,这取决于所使用的蛋白提取物和数量在印迹确定抗体反应的。进行比较的数量是有限的临床相关性的基础上,并为IgG和IgM的反应性均进行了五次比较:所有PAH患者对健康对照组;IPAH患者对健康对照组;SSC-PAH患者对健康对照组;IPAH患者对SSC-PAH患者;和SSC-PAH患者对硬皮病患者无肺动脉高压。为了(由两个与患者和对照的两组患者)比较个体的基团,每个比较,每名受试者的因子分数整个数据的执行因子分析后计算8,15。因子得分要么提交给配对的Wilcoxon检验对患者反应性的剧目比较年龄和性别匹配的健康对照,或到曼 - 惠特尼U检验两个比较的两名病人反应性的剧目。数和促进蛋白质条带的分子量向变根据测试抗原的源极和两组相比8,13。
结果
ELISA检测的抗成纤维细胞IgG抗体
在血清IgG的反应性,以IPAH患者,硬皮病患者具有或不具有PAH和健康对照的成纤维细胞,使用基于细胞的ELISA测试。使用IPAH患者通过两个标准偏差超过健康个体的IgG的反应性,14的35(40%)的平均光密度定义的阈值,四分之三的10(30%)SSC-PAH患者,十分之一的(10%) limited cutaneous SSc without PAH patients, three out of 10 (30%) diffuse SSc without PAH patients and two out of 65 (3.1%) healthy individuals had anti-fibroblast antibodies (fig. 1⇓)。当阈值被转移到三个标准偏差超过健康对照的平均光密度,10的35(28.6%)IPAH患者,四分之三的10(30%)SSC-PAH患者,十分之一的(10%)limited cutaneous SSc without PAH patients, two out of 10 (20%) diffuse SSc without PAH patients but none of the healthy controls had anti-fibroblast antibodies (fig. 1⇓)。The mean IgG anti-fibroblast antibody serum levels of patients with IPAH, SSc-PAH patients and diffuse SSc without PAH patients were significantly higher than those of healthy individuals (fig. 1⇓),而平均IgG抗成纤维细胞,而不限于PAH皮肤硬皮病患者的抗体血清水平没有。患者的不同群体的IgG抗成纤维细胞抗体的平均血清水平之间没有观察到显著的差异。
免疫印迹检测的抗成纤维细胞的IgG的反应性
血清IgG反应模式,每组中的健康者和患者之间均匀。然而,从一些健康的个人和各组患者IgG抗体绑定到具有高强度的独特带。IgG from all patients and healthy individuals bound to one major protein band of 40 kDa (figs 2⇓和3⇓)。的IgG从IPAH患者结合两个25-和60-kDa的条带与来自其它个体比IgG更高的强度。在addition, IgG antibodies from healthy controls and all patients except those with limited cutaneous SSc without PAH bound to a 30-kDa fibroblast protein (table 2⇓)。
抗的HEp-2细胞的IgG抗体的免疫印迹检测的
为了记录的IgG反应活性的成纤维细胞特异性,使用从HEp-2细胞中,抗核抗体的鉴定的参考基底的蛋白提取物进行了另外的实验。健康人与患者IPAH表示反应性低的数字,有一个主要的IgG反应指向一个40 kDa蛋白带。在contrast, SSc patients in the different groups expressed a large number of IgG reactivities, with two major protein bands of 75 and 85 kDa in SSc-PAH patients or in patients with limited cutaneous SSc without PAH, and two major protein bands of 70 and 95 kDa in patients with diffuse SSc (fig. 4⇓;table 2⇑)。
IPAH患者血清抗成纤维细胞和抗HEp-2细胞IgG反应因子分比较
IgG anti-fibroblast reactivities differed significantly between PAH patients and healthy controls and between IPAH patients and healthy controls, but not between SSc-PAH patients and controls (table 3⇓)。Anti-HEp-2 cell IgG reactivities did not differ significantly between healthy controls and PAH patients (table 3⇓)。IgG抗成纤维细胞的反应性没有差别IPAH和SSC-PAH患者之间或SSC-PAH患者和硬皮病患者无PAH之间显著,而IgG抗的HEp-2细胞的反应性显著相同的基团之间为因子1和3不同analysis corresponding to reactivities of 25, 30, 35, 50, 75 and 85 kDa for factor 1 and 70 and 95 kDa or 25, 35 and 40 kDa for factor 3, respectively (table 4).
检测抗纤维母细胞反应性的IgM
采用细胞ELISA法检测IPAH、SSc-PAH患者、无PAH的SSc患者及健康对照者血清IgM对成纤维细胞的反应性。使用两个标准差定义的高于健康个体IgM反应平均光密度的阈值,没有患者和健康对照组表达抗成纤维细胞抗体(数据未显示)。
当通过免疫印迹测试,血清IgM的反应性模式是健康个体和各组患者中是均匀的。IgM抗体从几个健康个体和患者必然要高强度唯一带各小组。IgM from all patients and healthy individuals bound to one major protein band of 40 kDa (table 2⇑)。
血清抗成纤维细胞和抗HEp-2细胞IPAH患者的IgM的反应性,硬皮病患者具有或不具有PAH和健康对照的因素得分的比较
PAH患者与健康对照组、IPAH患者与健康对照组之间IgM抗成纤维细胞反应性差异显著,而SSc-PAH患者与健康对照组之间差异不显著(表3)⇑). 健康对照组和多环芳烃患者的抗核IgM反应性无显著差异(表3⇑)。IgM anti-fibroblast and anti-HEp-2 cell reactivities did not differ significantly between IPAH and SSc-PAH patients or between SSc-PAH patients and SSc patients without PAH (table 4⇓)。
讨论
本研究中已经证明了第一次IgG和IgM的抗成纤维细胞抗体存在的患者血清中的PAH,与IPAH和SSC-相关的PAH不同反应性模式。
它是公认的系统性硬化症患者表达抗成纤维细胞抗体9,16,17。在目前的研究中,抗成纤维细胞抗体已证实系统性硬化症患者的25%,无肺动脉高压和系统性硬化症患者的PAH的30%,而Chizzolini等。9检测抗成纤维细胞抗体的SSc患者的58%使用基于细胞的ELISA。在硬皮病患者,抗成纤维细胞抗体先前已被证明诱导成纤维细胞活化体外和促粘合剂和这些细胞的促炎性表型9。因此,IgG结合到成纤维细胞的表面可以诱导分泌细胞因子如白介素1α,白介素1β和IL-6,这反过来又可以上调细胞间粘附分子(ICAM)的表达的-1成纤维细胞表面上9。关于抗成纤维细胞抗体的特异性,很少有研究已经发表。在SSC,DNA拓扑异构酶1最近被鉴定为抗成纤维细胞抗体的靶标,具有的证据表明,抗拓扑异构酶1个抗体通过与决定在成纤维细胞表面反应显示抗成纤维细胞的活性17。
要在当前作者的知识,以前没有的IPAH患者的血清中检测到抗成纤维细胞抗体。PAH病理生理学经典依赖于内膜的血管收缩剂和血管扩张剂的不平衡,钾通道的表达降低,腱生蛋白的外膜表达增加,炎症,血管生成被误导和高凝状态18。遗传易感性是PAH重要的,因为在2型转化生长因子(TGF)-β突变受体基因存在于网状损伤的约30%19。骨形态发生蛋白受体(BMPR)-II,所述TGF-β受体家族的一个成员的种系突变,在家族性,特发性和芬氟拉明相关的PAH是有据可查的。有趣的是,没有该基因编码BMPR-II的突变已在硬皮病患者的PAH确定20。
有一些证据表明,在PAH的自体免疫过程中发挥作用21。事实上,PAH是自身免疫性疾病如硬皮病,混合性结缔组织病和全身性红斑狼疮的常见并发症4。肺动脉病变的从PAH患者与结缔组织疾病相关的肺是类似于在IPAH发现3。这种相似性在病理解剖可以建议类似的机制。除了膜肥厚,内膜“洋葱鳞茎”病变特征glomoid样网状损伤,酷等。22有报道说,患者SSC-相关PAH,单核炎性细胞围绕丛状生长的血管部位,但不无干血管或血管外肺结构。在体外实验中,从患者的结缔组织疾病,包括抗U1核糖核蛋白抗体和抗双链DNA抗体,诱导上调ICAM-1的表达,内皮白细胞粘附分子1和主要组织相容性复合物类的自身抗体人肺的内皮细胞的表面上的II类分子,这表明这样的炎症过程可能导致增殖和炎性肺血管病变23。
相比之下,较少的数据关于PAH患者的其他亚群检测自身抗体是可用的。然而,IPAH患者的显著比例有自身免疫和/或活动性炎症,包括检测循环自身抗体的证据8,24中,促炎细胞因子白细胞介素(IL)-1和IL-6,血清水平升高和增加血小板衍生的生长因子或趋化因子表达的肺3. 一些研究表明IPAH与自身免疫性甲状腺疾病密切相关,进一步支持PAH自身免疫机制的可能性25。在本研究中,IPAH患者血清中鉴定的抗成纤维细胞的抗体显示出表达与60-kDa的蛋白条带的主要反应,而IgG的反应性朝向70-,75-和95-kDa的条带是特定于硬皮病的患者,因为这些都不是用IgG从特发性肺动脉高压患者共享。在的HEp-2细胞的提取物的60 kDa带不存在的IgG免疫反应性表明IgG抗成纤维细胞的抗体在患者IPAH成纤维细胞特异性。然而,目前的作者以前曾报道说IgG抗体来自相同患者IPAH也势必在大血管内皮细胞中的60-kDa蛋白,尽管这60-kDa条带不存在时血清微血管肺和皮肤内皮细胞中测试8。Moreover, the present experiments were performed at an IgG concentration of 100 μg·mL-1,whereas previous experiments regarding anti-endothelial cell antibodies in IPAH patients were performed at an IgG concentration of 200 μg·mL-1。最后,目前的作者都未能表现出从IPAH患者和硬皮病患者的PAH,以及硬皮病PAH患者和健康对照组之间的抗体反应之间有任何显著差异。这没有显著差异可能是少数测试硬皮病患者的后果。
在PAH抗成纤维细胞抗体的靶抗原尚未确定。所以能够推测,由于IgG抗成纤维细胞的抗体结合unpermeabilised成纤维细胞通过ELISA来评估,即靶抗原(多个)可以是成纤维细胞的膜的一部分。是否这些抗成纤维细胞IgG抗体作为产生细胞表面抗原的过度表达在上下文中具有结果的增加成纤维细胞增殖,或从初级自体免疫反应,是猜测的问题。一个有吸引力的假说将这些抗成纤维细胞抗体与细胞表面受体的结构异常可能导致的遗传性异常链接即的TGF-β受体超家族基因。IgG和IgM抗成纤维细胞抗体的靶抗原需要的特征一样,其潜在的致病作用。因此,无论其确切的靶抗原的,但据推测,这些自身抗体可以诱导激活信号导致细胞增殖和介质的释放,包括细胞因子,趋化因子和生长因子,其可能有助于PAH的发展3。
这是第一次,目前的作者提供的证据表明,特发性肺动脉高压和肺动脉与系统性硬化症相关的高血压表达抗成纤维细胞抗体。靶抗原和这些抗体的潜在致病作用仍有待确定16。在这些患者中的抗体在发展中国家肺动脉高压,如系统性硬化症患者和患者的肺动脉高血压家族病史的风险预测值,可查的需求。
致谢
笔者想感谢F. Batteux,谁提供的HEp-2细胞。
- 收到2005年12月28日。
- 公认2006年5月29日。
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