抽象
阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征(OSAHS)具有升高的肿瘤坏死因子(TNF)-α的循环水平。在这项研究中假设是OSAHS可能与TNF-α(-308A)基因多态性,这导致提高的TNF-α生产相关。这一假说OSAHS患者,他们的兄弟姐妹和人群对照检查。
共有206名受试者招募。均经睡眠研究和临床审查,并随后被归类为OSAHS或不依赖于呼吸暂停低通气频率,性别,年龄和症状。所有受试者都收集血液和进行基因分型DNA上从外周血白细胞提取。一些192随机英国献血者被用作人群对照。
的results demonstrated a significant association for TNF-α (−308A) allele carriage with OSAHS (OR = 1.8; 95% Confidence interval: 1.18–2.75) when compared with population controls. Siblings with OSAHS were significantly more likely to carry the TNF-α (−308A) allele. In addition, 21 pairs of male siblings discordant for carriage of the −308A allele showed a significant level of discordance for the OSAHS phenotype.
总之,这项研究表明协会肿瘤坏死factor-α(308−)运输与阻塞性睡眠apnoea-hypopnoea综合症,这表明炎症可能与这种疾病的发病机理。
阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征(OSAHS)是第二个最常见的呼吸系统的疾病,影响中年人群的~0.3-4%。它是日间嗜睡症状和睡眠期间呼吸障碍的客观措施的基础上确定1,2。OSAHS有一个独立于肥胖的家族因素3.,越来越多的证据表明OSAHS与炎症有关。c反应蛋白水平的升高,hypercytokinaemia和肿瘤坏死因子(TNF) -α已报告在低4- - - - - -6。提高血清TNF-α水平独立于肥胖和与系统性血压5,7,8。此外,TNF-α还促进嗜睡,OSAHS的主要特点9。
产量增加TNF-α的两个在体外和体内已报道与功能性TNF-α基因多态性相关联,由鸟嘌呤(G)与腺嘌呤(A)替换在位置-308的启动子区10,11。因此,有人假设,可能OSAHS与TNF-α(-308A)基因多态性相关联。这是OSAHS患者,他们的兄弟姐妹和人口控制测试。
方法
1997年1月至2002年12月,在苏格兰睡眠中心(英国爱丁堡)进行了一项病例对照研究,其基础是招募OSAHS患者及其兄弟姐妹。总共192名英国匿名献血者被用作额外的人口控制。该研究获得了当地研究伦理委员会(英国爱丁堡)的批准。
受试者招募
共有557个连续的患者参加苏格兰睡眠中心低的症状和apnoea-hypopnoea指数(AHI)≥15被要求参与这项研究作为索引的情况下,并被要求与他们的兄弟姐妹联系让他们完成一个睡眠问卷调查,参与睡眠研究并提供血液样本。在312名愿意参与研究的指标受试者中,有155人有兄弟姐妹。大约有44个兄弟姐妹没有出席,8对兄弟姐妹的数据在技术上没有得到充分的收集。共有103对sibo -pair(206名受试者)成功完成了研究。所有受试者均为白人。
数据收集
在给予书面的知情同意后,所有受试者都测量了他们的身高、体重、颈围和血压,并被要求填写一份标准的睡眠问卷(包括Epworth嗜睡评分(ESS))12)。主题had 20 mL of blood collected. All siblings had overnight polysomnography (PSG) using standard techniques13。研究在隔音和电屏蔽的卧室在爱丁堡睡眠中心(英国)执行。
使用来自氯化银表面电极的双极信号,用脑电图(EEG)、电oculography (EOG)和肌电图(EMG)记录睡眠。从两个头皮位置(Cz/Pz)记录脑电图。额叶脑电图也用包含脑电图/EOG信号(Cz/Fp1, Cz/Fp2)的“混合”通道记录。EOG是通过放置在眼球外眼角和Fp1、Fp2位点的电极记录的。颏下肌电图是通过放置在膝舌肌腹部的两个电极来记录的。接地电极放置在Fpz上。放置在左右胫前肌的电极记录腿部肌电图。所有信号都记录在Compumedics W-series和R-series系统上(Compumedics,墨尔本,澳大利亚)。
指标患者使用Edentrace有限睡眠研究系统(EdenTec型号3711数码记录仪)进行了夜间PSG研究(103例中有87例)或家庭研究(103例中有16例);奈尔科,伊甸草原,美国明尼苏达州),这已被广泛验证与PSG14,15。此设备的记录口鼻气流使用由电阻抗的热电偶,胸壁运动,使用心电图和手指脉搏血氧饱和度心脏速率;没有脑电图记录。
表现型
OSAHS表型使用AHI和嗜睡定义,如由ESS测量。Table 1⇓示出了基于对白种人规范数据的AHI的临界值2,18,19。每个主题的AHI首次得分为要么绝对不正常的,不确定的或性别和年龄的基础上,绝对正常。然后每个受试者的ESS(总数的24)中的溶液评价为任一困(ESS≥11出的24)或不正常困(ESS <11的24个)。ESS的截止值是基于针对白种人规范数据20,21。
然后根据表2所示的算法,将OSAHS分为绝对存在、不确定或绝对不存在⇓。
献血者
DNA从英国白种人人随机对照DNA面板(产品编号HRC-1 96阵列和No. HRC-2 96阵列;欧洲细胞培养物收集,HTTP://www.ecacc.org.uk)作为第二组的对照。所有捐助者签署知情同意书的用于研究目的的血液。
等位基因歧视分析
使用Wizard®R基因组DNA纯化试剂盒(TM050;(英国南安普顿Promega)或核子提取和纯化协议(用于从10ml全血中提取DNA;核子BACC3 RPN 8512;Amersham plc, Little Chalfont,英国)。
所述的TaqMan系统用于研究的-308(A-G)的单核苷酸多态性(SNP)。测定按DESIGN®(Applied Biosystems公司,福斯特市,CA,USA)来设计探针和引物。
每10µL包含10µg的基因组DNA, PCR 900µM底漆,250µM探针和2.5µL TaqMan普遍PCR反应混合液(应用生物系统公司)。使用自动液体处理机器人将溶液注入96或384孔板的每口井中。
扩增采用Peltier热循环仪(PTC-225 DNA四分体PCR仪;MJ研究,威豪,美国)。利用ABI棱镜7900HT序列检测器(Applied Biosystems)检测PCR前后各孔的荧光,并绘制散点图。等位基因的阅读和分类的情节由两个读者独立盲主体地位。
统计分析
间组使用卡方检验和未配对和配对的t-检验进行比较。使用广义估计方程逻辑回归模型被用来测试一个等位基因计数的基础上(假设Hardy-Weinberg平衡和乘法风险模型)上OSAHS的与TNF-α滑架的关联22。通过McNemar对称检验,利用每个家庭的一对兄弟姐妹来估计基因型不一致的兄弟姐妹对之间OSAHS频率差异的显著性。协会和连锁分析的低TNF-α(308−)SNP是SIBASSOC使用公式执行计划23。SIBASSOC进行使用最基因型不同的未受影响的兄弟为每种情况下的控制的卡方检验。该FBAT24程序来检查与基因型数量性状的关联。功率是使用由梅钦描述的公式确定et al。25用于病例对照研究,比较两个比例并使用优势比(OR)。采用以下公式对哈迪-温伯格平衡进行了检验: 在人口等位基因分布,主要和次要等位基因频率与已发表的频率进行比较。
假定值都是为双尾测试,并被认为是α= 0.05的显著水平。
结果
63名受试者没有OSAHS,其中40人被确定为OSAHS中度先验(tables 1⇑和2⇑)。明确OSAHS和明确无OSAHS的研究对象的人群特征见表3⇓)。被划分为OSAHS不确定(n = 40)的受试者未纳入后续分析。
308 (g)−SNP基因分型结果TNF-α可供190英国献血者控制(99%)和200年的206个研究对象(97%)。供血对照组中,男性95例(50%),平均±SD年龄38±8岁。
等位基因频率和基因型的分布在明确诊断为OSAHS的受试者和英国人群中存在显著差异(表4)⇓)。对照组(190例献血者)的等位基因分布处于Hardy-Weinberg平衡。
逻辑回归显示一个重要TNF-α协会(308−)等位基因运输低(或1.82(95%置信区间)(1.18 - -2.75);p = 0.006)。
数量性状(AHI和体重指数(BMI))分析与OSAHS的诊断无关,与基因型无关(p = 0.4和p = 0.5)。这是基于35个信息丰富的兄弟姐妹群体。
第四5对兄弟姐妹(男性和女性)是不和谐的用于OSAHS的诊断(剩余部分为一致的诊断或兄弟姐妹之一具有中间表型)。的re was a significantly higher prevalence of the −308A allele in the siblings with OSAHS (p = 0.04) using SIBASSOC. Anthropometric and sleep variables in this group are shown in table 5⇓。
数篇论文表明,可能有两性异形的先天免疫反应,包括TNF-α的分泌26- - - - - -28。Logistic regression analysis corrected for sex still showed significant association of the −308A allele with OSAHS (1.64 (1.06–2.55); p = 0.023). Further analysis was undertaken using McNemar's test in 21 pairs of male siblings discordant for carriage of the −308A allele. Fifteen subjects in this group who were A-allele positive had OSAHS whilst their siblings did not (p = 0.001). There was no significant difference between the 21 sib-pairs with and without the −308A allele with regard to BMI (28±3与28±5 kg·m−2)或年龄(50±9)与51±9 yrs). Female sib-pairs in the study were either concordant for OSAHS or one of the pair had an intermediate phenotype, precluding similar analysis.
讨论
在这项研究中,TNF-α(308−)等位基因明显与诊断阻塞性睡眠有关,在这两种情况与随机人口控制和兄弟姐妹。TNF-α之间的明显协会(308−)等位基因和低的男性sib-pairs不和谐的低强烈表明,这种关系是重要的。然而,这种等位基因在OSAHS的发展过程中并不是必需的,因为在总体OSAHS组中其患病率为28%,而在人口控制组中为18%。
OSAHS的炎症很常见,包括循环中促炎细胞因子水平升高。TNF-α和白介素6 (IL)在低高,独立于肥胖,TNF-α分泌的昼夜节律中断29。此外,其他炎症介质也升高,包括细胞内粘附分子-1和c反应蛋白三十。TNF-α,c反应蛋白和il - 6产生有害影响,诱导内皮功能障碍。TNF-α损伤内皮细胞,使这些细胞的凋亡和触发器促凝血的活动和纤维蛋白沉积。TNF-α也增强了活性氧的生产,包括诱导一氧化氮和降低心肌收缩性剂量依赖性的方式31。
睡眠中断可能是OSAHS患者易患心血管疾病的原因之一。遗传倾向于增加TNF-α生产可能会进一步加剧这些影响。OSAHS促炎细胞因子升高的驱动力可能与自主神经系统两个分支活动性增加、间歇性缺氧、口咽局部炎症导致细胞因子诱导增加、内脏脂肪增多有关三十。
在本研究中,TNF-α(-308A)SNP与OSAHS的诊断已被证明的独立相关性。这表明疾病促进作用,表现为敏感性增加症状(嗜睡和疲劳)和加重上呼吸道的炎症。这项工作的进一步扩展将包括在所有受试者,其目前的研究设计排除循环TNF-α,血清可溶性TNF受体和P55血清的可溶性受体的p75的血清水平的测量。
本研究的优势包括同胞对设计与附加的人口控制,所有记录的得分无视病例或等位基因的地位和先验商定的案件状况分类。这项研究有几个潜在的局限性。AHI只是在一个晚上测量的,而这个晚上可能会有所不同32;然而,一个晚上的研究是评估志愿者(或病人)研究中睡眠呼吸障碍的标准和唯一现实的方法。所有的研究参与者都在同一个实验室进行调查,使用相同的标准化技术来设置、记录和评分事件。在不考虑受试者状态的情况下,分析结果的内部和内部重复性很高。的先验使用一个不确定的评分,通过对有明确睡眠呼吸暂停和绝对没有睡眠呼吸暂停的患者进行广泛的区分,减少了分类错误。ESS允许在日常生活情况下评估嗜睡,而更客观的测试可能不允许12。这是一般的临床和科研使用的最简单,最实用,最广泛的验证和测试使用。此外,嗜睡是OSAHS的主要出现的症状33。
虽然群体分层为OSAHS和TNF-α之间的观察到的关联的可能解释,许多因素减少这种可能性。基因型频率用于非OSAHS组均处于Hardy-Weinberg平衡,减轻对基因分型或显著群体分层误差。继普里查德和罗森伯格34,谁主张使用未连接的遗传标记的检测在关联研究中,两个多态性群体分层(血清素受体2A T102C和生长激素受体+ 561G / T),不知道是在与TNF基因连锁不平衡,检测为与OSAHS关联。整个组中的基因型分布均Hardy-Weinberg平衡和检测用OSAHS没有关联。然而,现有标记的整体数量是不够的,开展群体分层的正式测试。许多研究还考察了分层是否真的是在流行病学研究中的一个重大问题,发现错误率是非常小35,36。
TNF-α基于种族等位基因频率对于在本研究中正常受试者没有显著不同与公开的英国数据白种人相比,不含偏压37。的power of the study was also adequate to determine a difference in allelic frequency (two-group continuity corrected Chi-squared test of equal proportions showed power of 99% at α = 0.05 level) for the analysis between subjects with OSAHS and blood donor controls. Although the OSAHS status of the latter group was unknown, this would tend to dilute the reported difference (by inclusion of OSAHS cases as normals) rather than strengthen it. Furthermore, blood donors in the UK are screened to be in good health and the taking of most medicines prohibits donation. Finally, lack of an independent association of genotype with quantitative traits for OSAHS using FBAT may be a reflection of low power in this population with respect to this statistical method本身。
TNF-α(-308A)与人类白细胞抗原(HLA)类连锁不平衡I和II等位基因,III类区域编码补体系统和主要组织相容性IV类簇的几个部件,其包括淋巴毒素α(的TNF基因座内的5个微之一)和淋巴毒素β38。TNF-α协会(308−)与低,因此,是由于直接影响SNP的问题和/或由于连锁不平衡与其他基因多态性在TNF-α或HLA系统内的其他基因。
总之,这是第一个已知的研究,探讨了肿瘤坏死因子α-308(A-G)的单核苷酸在阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征的受试者的多态性。在科目-308A等位基因与本病的发病率增加支持了其与炎症相关的参数。需要进一步的研究,探讨在阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征促炎性细胞因子基因多态性进行风险分层的效用,这将为潜在的治疗策略,如肿瘤坏死因子α单克隆抗体的方式
致谢
这项研究由睡眠医学部、遗传学核心威康信托临床研究机构(英国爱丁堡)和K. Matthews(统计学)的工作人员提供帮助。
- 收到二零零四年十一月十五日。
- 接受2005年7月1日。
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