摘要
烟碱激动剂,包括1,1-二甲基-4-苯基哌嗪(DMPP),具有抗炎特性,在某些情况下有平滑肌放松作用。由于炎症和气道平滑肌收缩是哮喘的两个主要组成部分,本文作者研究了DMPP对哮喘小鼠模型的气道炎症和气道阻力的影响。
小鼠卵清蛋白(OVA)致敏,并经腹腔或鼻内DMPP处理。检测DMPP对气道炎症、气道阻力和支气管平滑肌细胞内钙含量的影响。
在致敏、OVA激发或整个方案中给予DMPP可预防肺部炎症并降低OVA特异性免疫球蛋白e的血清水平。DMPP可减少支气管肺泡灌洗液中总细胞、淋巴细胞和嗜酸性粒细胞的数量。鼻内给药DMPP在减少BAL液中总细胞计数和嗜酸性粒细胞计数方面与地塞米松(DEXA)一样有效。DMPP,而不是DEXA,能减少组织炎症。试验前10分钟给予鼻内DMPP,可降低气道对甲胆碱的反应性。DMPP也减少了细胞内钙的增加,以响应缓激肽。
综上所述,1,1-二甲基-4-苯基哌嗪可减轻哮喘模型小鼠的肺部炎症反应,防止气道高反应性。
哮喘的特征是气道炎症、高反应性和气道重塑1.淋巴细胞、肺泡巨噬细胞和嗜酸性粒细胞参与了疾病的发展和持续2- - - - - -4.许多细胞因子,包括白介素(IL)-4、IL-5和IL-13在哮喘中发挥重要作用1.近年来,联合抗炎和支气管扩张作用的药物已经被开发用于治疗哮喘。
参与哮喘病理生理的炎症细胞和结构细胞表达多种受体,包括烟碱乙酰胆碱受体(nAChRs)。5- - - - - -7.nachr在这些细胞上的作用尚不完全清楚。尼古丁激动剂有抗炎作用在体外和在活的有机体内.在动物模型中,尼古丁,一种尼古丁受体激动剂,抑制炎症疾病的发展,如1型糖尿病8和过敏性肺炎9.在人体内,尼古丁对治疗溃疡性结肠炎有效10.在体外,尼古丁降低肺泡巨噬细胞中IL-1β和肿瘤坏死因子(TNF)的释放,以及血栓素合成酶的活性11.尼古丁还能阻断细胞周期中G0/G1期的淋巴细胞,并影响t细胞受体刺激所激活的细胞内信号级联12.尼古丁可减少淋巴细胞增殖13以及CD28共刺激分子在t细胞上的表达14和肺泡巨噬细胞上的B7分子9.在小鼠模型中,B7分子参与肺泡巨噬细胞对淋巴细胞的完全激活,阻断这一共刺激通路可逆转哮喘的表现15.
尽管尼古丁具有有趣的消炎特性,但它的亲脂特性使其能够穿过血脑屏障,从而导致成瘾;1,1-二甲基-4-苯基哌嗪(DMPP)是一种亲水性较强的合成nAChRs配体。这种分子不会轻易穿过脑血屏障,因此不会导致上瘾16.DMPP可减少离体脾细胞IL-1和TNF的释放17,巨噬细胞释放TNF和IL-618.DMPP还能降低由组胺引起的猫的支气管运动紧张性19.
由于nachr在参与哮喘发展的细胞中表达,并且由于它们的激动剂具有抗炎和支气管扩张作用在体外,目前的作者假设一些nachr激动剂可能有有趣的抗哮喘特性。为了验证这一假设,研究了DMPP对气道炎症和气道反应性的影响在活的有机体内并与地塞米松(DEXA)的作用进行了比较,并考虑了可能的作用机制。
方法
哮喘的诱导和肺部炎症的评估
这些方案由机构伦理委员会(拉瓦尔医院,Ste-Foy, Quebéc,加拿大)批准,并根据赫尔辛基公约实施。将结合2%氢氧化铝的50 μg鸡卵清蛋白(OVA)腹腔注射100 μL生理盐水使18-20 g Balb/c雌性小鼠(Charles River, Québec, Canada)致敏。i.p。).对照组小鼠注射生理盐水。实验中,小鼠经3%异氟醚鼻内麻醉(i.n。), 50 μl 1.5% OVA或生理盐水刺激(图1)⇓).
表1给出了处理时间的说明⇓.在第1个方案中,小鼠接受了治疗i.p。DMPP的剂量为0.01-0.5 mg·kg−1在OVA挑战期间。在方案2中,小鼠被处理i.p。0.5 mg·公斤−1DMPP可以在敏化(2A),挑战(2B)或整个方案(2C)。方案3中,小鼠灌胃2.0 mg·kg−1i.n。仅在第21、22和23天使用DMPP (3A)或DEXA (3B)。适当的阳性和阴性对照与治疗组并行进行。
第24天,过度暴露异氟醚致小鼠死亡,气管切开,支气管肺泡灌洗(BAL)。计数细胞总数,制备细胞旋蛋白。通过Diff-Quik®染色获得差异计数。
ova特异性免疫球蛋白E滴度测定
在祭祀当天,采集了2号规程小鼠的血液通过眼眶窦(3%异氟醚麻醉后)。血清OVA特异性免疫球蛋白(Ig) E测定如前所述20.,但稍加修改;在斑块上涂布抗小鼠IgE (BD Pharmingen, Missisauga, ON, Canada),并以任意光密度单位表达OVA特异性IgE水平。
组织病理学研究
DMPP的肺切片i.n。将处理过的小鼠固定在Bouin溶液中,石蜡包埋,切0.5 μm切片,苏木精-伊红染色。由资深肺病理学家盲目评估肺组织(支气管周围、血管周围和实质浸润的炎症细胞)的炎症参数。计算总组织学评分并从0 - 4分,0 =正常肺,4 =弥漫性最大炎症。
气道阻力评估
敏感的老鼠i.n。处理0.5 mg·kg−1第24天,在异丙胆碱(MCh)攻毒前10分钟注射DMPP(第4号方案如表1所述)⇑),或第21、22、23天,第24天,MCh攻毒前10分钟(方案编号5)i.n。DMPP(协议号6A)或DEXA(协议号6B) 2.0 mg·kg−1第21、22和23天,第24天,MCh挑战前10分钟。
第25天,小鼠麻醉剂量为10 mg·kg−1甲苯噻嗪/ 5.85 mg·公斤−1戊巴比妥,气管切开,用18G导管插管。用Flexivent仪器(SCIREQ, Montreal, Québec, Canada)测量气道阻力。呼吸频率设置为160次·min−1潮气量0.2 mL,呼气末正压2-4 mL H2O运用。增加MCh浓度(0 ~ 31.25 mg·kg−1)管理通过颈静脉。每15秒记录一次气道阻力。基线耐药性在给予后续剂量的MCh之前恢复。
细胞内钙离子测量
人支气管平滑肌细胞系(BSMC;采用Cambrex Corporation, East Rutherford, NJ, USA),验证DMPP对小鼠的影响在体外平滑肌细胞内钙运动。在平滑肌细胞基础生长培养基(Cambrex Corporation)中保持培养。细胞(2×106)置于2.5 cm培养皿中,用2.5 μM Fura-2在37℃下孵育30分钟。用160 μM DMPP预处理或不预处理细胞24 h,用10 nM缓激肽刺激细胞。细胞内钙浓度的变化2+离子随后使用Imagemaster系统(Photon Technology International, Monmouth Junction, NJ, USA)耦合到徕卡DM IRB荧光显微镜(徕卡加拿大公司,St-Laurent,魁北克,加拿大;40×)。激发波长分别为353和374 nm,发射波长为510 nm。353和374 nm激发波长引起的荧光之间的比率被计算并用作细胞内钙指示剂。
统计数据
使用方差分析表和Fisher事后检验对细胞发现和每个MCh剂量进行统计分析,以确定组间的统计学意义(显著结果= p<0.05)。
结果
DMPP对血清BAL细胞及OVA特异性IgE水平的影响
DMPP 0.1和0.5 mg·kg−1显著减少了细胞总数(图2a)⇓;p = 0.03;N = 8),嗜酸性粒细胞(图2b⇓;P≤0.02)和淋巴细胞(图2b⇓;p≤0.02),与OVA致敏组比较。在挑战期间(21-23天)、致敏(1-20天)或整个方案(1-23天),DMPP治疗显著减少了BAL中的总细胞数量(图3)⇓;p≤0.009;n = 8)和血清中ova特异性IgE水平(图4)⇓;p≤0.02;N = 8),与未治疗组比较。DMPP给定i.n。2.0 mg·公斤−1细胞总数显著减少(p = 0.003;n = 8;图5⇓)、嗜酸性粒细胞(p = 0.0006)和淋巴细胞(p = 0.004)(图5b⇓).有效剂量为2.0 mg·kg−1用。
DMPP给药对气道阻力的影响
观察不同时间给予DMPP对气道阻力增加的影响注射。妇幼保健。在三天的OVA挑战中,给药DMPP没有显著改变对MCh的反应(数据未显示)。的i.n。24天MCh攻毒前10分钟给药DMPP与未治疗的对照组相比对MCh诱导的气道阻力有显著的抑制作用。(图7⇓;MCh剂量<0.05,>3.5 mg·kg−1;n = 4)。在OVA攻毒3天和MCh给药前10分钟的治疗对气道阻力的增加也有显著的保护作用(图7b)⇓;MCh剂量<0.05,>3.5 mg·kg−1;n = 4)。与DMPP相比,在OVA激发3天和MCh前10分钟给予DEXA并没有显著降低对MCh的反应(图8)⇓).
BSMCs的细胞内钙运动
用缓激肽刺激离体平滑肌细胞可引起细胞内钙的快速移动,DMPP可使其延迟236±31 s (p<0.0001;n = 12)。与未处理的细胞相比,DMPP也降低了响应峰值强度43.4±14.9% (n = 9;p = 0.03;图9⇓).
讨论
本研究旨在验证nAChR激动剂DMPP是否对哮喘小鼠模型的气道炎症和反应性具有保护作用,并评估其可能的作用机制。这些结果支持了这些激动剂对气道炎症和反应性有保护作用的假设,这种作用可能与抗原致敏和钙代谢有关。综上所述,这些结果证实了目前作者和其他人发表的其他数据8,9,10,21.
将尼古丁激动剂(如尼古丁)的特定抗炎作用与吸烟的整体免疫抑制作用分开是很重要的。目前的作者不希望表明吸烟可能对哮喘患者有益。然而,有证据表明,尼古丁激动剂的使用可能是有效的治疗一些炎症性疾病8,9,10.由于尼古丁穿过血脑屏障,从而导致上瘾,因此它不能作为一种潜在的化合物用于治疗哮喘或任何其他慢性疾病。DMPP和其他可能不通过血脑屏障的水溶性化合物与尼古丁有很大的不同,因此,在治疗哮喘方面有潜在的好处。
DMPP是管理i.n。以检验直接的给药途径。这条路径被鼻毛细血管吸收,并流入上腔静脉。血液在流经肝脏之前进入肺循环22.然而,大部分是给予的i.n。被动物吞下,被消化道吸收,在进入肺部之前通过肝脏在门静脉系统循环。因此,目前的作者认为,在i.n。DMPP处理的动物可能来自于DMPP的全身效应,DMPP被消化道吸收。
事实上,小鼠对OVA致敏和挑战的反应不同于另一种方案,这可能是由于一些因素。的有效性i.n。给药依赖于麻醉水平,这在技术上在不同方案之间是不可重复的。此外,方案1至6分别使用新的OVA蛋白溶液进行;在不同的OVA制备之间,OVA抗原性可能存在差异。
正如先前关于烟碱激动剂的报道,目前的结果也显示DMPP与DEXA具有明显的抗炎作用。至于之前的研究23- - - - - -26给予大剂量DEXA (2.0 mg·kg)−1).这是一个高剂量的皮质类固醇,比通常给治疗甚至最严重的人类哮喘病例16.不过,2.0毫克·公斤−1的i.n。DMPP在减少BAL中总细胞和嗜酸性粒细胞的数量方面与高剂量的皮质类固醇一样有效。此外,DEXA没有降低BAL中的淋巴细胞数量和总组织学评分,而DMPP有此作用。DEXA仅显示出总组织学评分下降的趋势,这一事实令人惊讶,可能是由于组内的一些差异或2.0 mg·kg−1而其他研究使用了更高的剂量25,27.
尼古丁激动剂对平滑肌的影响从文献中还不清楚。一些研究显示平滑肌松弛28另一些则出现收缩29.一项研究表明,DMPP降低了猫的支气管运动张力19.目前的结果清楚地支持在小鼠模型中的支气管保护作用。这个bronchoprotection,即。高反应性降低妇幼保健,似乎并没有完全是因为DMPP的影响炎症的抗炎作用用DMPP的政府在3天卵子的挑战(数据未显示)没有诱导bronchoprotection相似。用i.n。在MCh试验前10分钟给药,证实该药物具有直接平滑肌松弛作用。这种直接效应在DMPP给药后长达4小时都可以观察到(数据未显示)。
不同时间的i.p。以验证DMPP是否能抑制OVA诱导的致敏,以及重复DMPP政府将是否能防止OVA刺激引起的炎症。事实上,DMPP (0.5 mg·kg−1,从第1-20天(致敏)给予,在OVA挑战期间不进行治疗)显著减少BAL中的细胞计数,表明DMPP部分阻断了对OVA的致敏。DMPP降低ova特异性IgE血清水平进一步支持了这一假设。这是非常有趣的,因为对过敏原的过敏先于过敏性哮喘的发展1.由于在整个方案中DMPP治疗(包括增敏和刺激)与单独刺激期间的治疗具有相同的抗炎作用,持续使用DMPP治疗似乎不会导致nachr的脱敏。
DMPP的调控机制尚不清楚。由于MCh引起支气管痉挛,且DMPP给药后10min即有支气管保护作用,因此该药物必须直接作用于气道平滑肌,而不是仅作用于气道平滑肌通过其抗炎作用。平滑肌细胞收缩的主要步骤之一是细胞内钙的动员30..DMPP延迟和减少由缓激肽引起的细胞内钙离子的增加,这一事实可以解释,至少部分地在活的有机体内在本模型中观察到DMPP对支气管的保护作用。解释这些钙动员现象的确切机制尚不清楚。一些研究表明,尼古丁,另一种尼古丁激动剂,可以耗尽淋巴细胞内的钙储存13.这些储备的消耗会导致细胞内钙增加的延迟和减少。烟碱激动剂对总体钙动员的下调作用可能是这些分子的抗炎和支气管保护作用的原因。
DMPP能刺激nAChR各α亚基。需要进一步的研究来验证哪些特定的亚基参与了观察到的效果。先前在作者的实验室中获得的结果(使用甲卡胺和海甲铵)表明,DMPP的抗炎和平滑肌松弛作用都是选择性激活烟碱受体的31,32.在抗炎和支气管保护作用的亚单位的识别可能导致开发更具体的激动剂,以更有效地治疗哮喘。
结论
综上所述,1,1-二甲基-4-苯基哌嗪对哮喘小鼠模型具有较强的抗炎和支气管保护作用。炎症和气道高反应性是哮喘的两个主要组成部分。因此,该分子和其他潜在的针对特定烟碱乙酰胆碱受体亚型的烟碱激动剂可能提供一种新的治疗哮喘的方法。
致谢
作者要感谢研究所Robert-Sauvé en Santé et Sécurité au Travail(加拿大蒙特利尔)和加拿大健康研究所(加拿大渥太华)的财政支持。他们还要感谢M. Fournier在病理研究方面的帮助,M. Laviolette提供了BSMC细胞系,M. Olivier(麦吉尔大学,蒙特利尔,加拿大)捐赠了生物素化卵清蛋白。
- 收到了2004年10月7日。
- 接受2005年4月4日。
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