文摘
铜绿假单胞菌是最主要的病原体在肺囊性纤维化(CF)。因为有真担心克隆在CF传播中心,这项研究调查了铜绿假单胞菌基因型的殖民地居民CF康复中心。
76年的隔离的痰铜绿假单胞菌殖民患者基因分型荧光扩增片段长度多态性在抵达和起飞。
共有71名不同铜绿假单胞菌从749年分离株基因型被确定。49岁的病人有一个基因型,20有两个基因型和七个有三个。44个病人有一个或多个基因型的共同点与其他患者(即。集群类型)。由单个基因型32例殖民不共享任何其他病人。38的患者44集群类型已经进行集群类型菌株(s)的到来。病人传播对8个病人不能被排除在外。五,这种感染是短暂的。没有一个环境铜绿假单胞菌隔离有相似的基因型患者的基因型。
总之,大多数患者被只有一个或两个殖民铜绿假单胞菌基因型和持久的病人传播的风险在研究期间很低(4%)。大多数病人有簇状应变进行这一毒株的到来,表明传输过去发生的可能。没有环境污染能建立。
Pseudomonas绿脓杆菌一直在囊性纤维化的主要病原体(CF)肺部病理学在过去三十年1- - - - - -3。在最初感染之后,多尔的殖民统治(定义的标准等。4)导致肺组织的破坏和减少肺功能,这可能会导致早期死亡。美国CF基础数据库报道,1996年,中位数生存的CF患者殖民铜绿假单胞菌28岁,中位数生存noncolonised患者39岁吗5。损失由Kerem清楚地证实了肺功能等。6,表明患者殖民铜绿假单胞菌7岁的年平均在一秒用力呼气量(FEV1),10%低于noncolonised病人。尽管殖民地黏液状的形态类型的出现是一个比存在nonmucoid不利预后因子铜绿假单胞菌7,后者形成一个重要的微生物mucoidy的水库,细菌生物膜和慢性建立殖民统治8。
预防慢性铜绿假单胞菌殖民的适当的抗生素治疗是现在常见的做法一次“新”感染的生物已被确认9,10。目前,高度传染性病毒的传播在某些CF中心已经引起了很大的关注,特别是当这些菌株多药耐药和负责主要感染11- - - - - -16。然而,其它的研究未能发现克隆传播的证据17- - - - - -20.。
在比利时,许多病人被称为CF康复中心“Zeepreventorium”De Haan短期或长期留下来,为了学习特定的物理疗法的技术,如自生排水。这种情况导致了正当关切病人和医生之间相互传染的风险。因此,在2001年和2002年期间,铜绿假单胞菌从76例患者隔离,与环境隔离,是基因分型研究病人的传播风险。
方法
病人
所有76铜绿假单胞菌殖民的病人参加了康复中心从1月8日到4月30日,2001年,从9月1日,2001年10月31日,2002年,总停留时间8218天(平均63天),参加本研究。患者5 38岁(平均20.5岁),33岁男性(表1⇓)。七个病人住在中心在第一个时期,第二时期42 27两个时期。病人被安置在不同的房间,但餐饮和生活设施共享。患者感染伯克不过复杂的不承认康复中心。病人大多是七比利时CF的中心,但也有一些是来自德国和法国的中心。
从1992年开始,感染控制措施被煽动减少从环境中相互传染,即。去污下沉的每个病人的房间,在理疗根据病人隔离铜绿假单胞菌窝藏殖民化和排斥的患者不过复杂的中心。尽管如此,铜绿假单胞菌,殖民的病人继续共享相同的理疗室,每个病人用他/她自己的nebuliser和理疗的设备,净化后单独每个会话。
抽样
痰液样本取自所有患者至少在抵达和起飞,收集和理疗的会话结束时,确保样品源自更深的航空公司。环境样品(10毫升)在研究期间被从水槽排水管的卧室和娱乐的房间。一些患者在研究期间采样> 20倍。
微生物学
麦肯基痰样本接种到琼脂(美国),医学博士,正欲涨Cockeysville。经过2天的孵化在37°C,或lactose-negative殖民地采摘,亚文化5%羊血琼脂氧化酶(正欲涨)和测试。使用tRNA-PCR只有oxidase-positive殖民地被进一步研究21。
基因分型
对于每一个病人,铜绿假单胞菌麦肯基分离表现出不同的菌落形态琼脂被任意影射PCR基因分型,使用碱性细胞溶菌作用DNA提取22、随机扩增多态性DNA (RAPD)分析准备珠子(Amersham生物科学AB,乌普萨拉,瑞典)和底漆ERIC2 (AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG)的退火温度35°C,如前所述23。这使随后的分离数量基因分型的更艰苦的荧光扩增片段长度多态性(fAFLP)方法将减少,因为只有单一的代表每个RAPD类型都使用这个过程的基因。
总细菌的DNA来自新鲜文化的孤立在胰蛋白酶的大豆DNA琼脂使用QIAamp迷你包(试剂盒、希尔登,德国)。fAFLP进行如下所述。结合restriction-ligation过程使用,10 ng的总基因组DNA孵化2 pmol EcoRI适配器,20 pmol MseI适配器,1 U EcoRI (Amersham生物科学),1 U MseI(美国新英格兰生物学实验室,贝弗利,MA), 50 mM氯化钠,每µL 50 ng牛血清白蛋白(罗氏、巴塞尔、瑞士)和4 U的T4 DNA连接酶(Amersham生物科学)的总量1×10µL反应缓冲3 h在37°C,之后混合物与三羟甲基氨基甲烷缓冲液稀释20倍(三10毫米,EDTA 0.1毫米,pH值8.0)。限制的选择性扩增片段,5µL稀释restriction-ligation混合物用于放大的一个卷10µL在下列条件:0.4µM 6-tetrachlorofluorescein-labelled EcoRI底漆+ 0,1.2µM MseI+C底漆(E1;Eurogentec、血清、比利时),0.2毫米deoxynucleoside三磷酸,1.5毫米MgCl21×反应缓冲和1 U的金星TMDNA聚合酶(Eurogentec)。2分钟后孵化72°C和94°C, 30年代的自行车条件36周期在94°C, 30年代在65 - 56°C和60年代在72°C。在第一次13个周期,退火温度每周期降低0.7°C。在72°C额外的10分钟孵化后,样品被冷却。PCR引物的概述和适配器序列如表2所示⇓。
结合12µL deionised甲酰胺和0.3µL gs - 400高密度尺寸标准和0.2µL gs - 500标准(既包含ROX-labelled碎片在50 - 500 bp)被添加到每个1µL PCR产物。这混合物在310年然后电泳ABI棱镜(美国应用生物系统公司,培育城市,CA)。
使用BaseHopper项目相似度矩阵计算21,从这一相似性树是由邻居加入,PHYLIP使用计划24。集群> 90%相似的指纹都视觉检查,使最终决定对相似。视觉检查评估软件的指纹等< 90%的相似性表明指纹总是不同于对方至少三个主要的山峰。目视判读的指纹评估软件∼90%相似,在某些情况下,得出的结论是,指纹是相同的。因此,最终决定关于单克隆的隔离拥有指纹相似度≥90%,根据软件,是基于人类的解释。
统计分析
数据意味着±sd或中位数(四分位范围扫描电镜)。流行病学数据的统计分析是使用时未配对t检验进行组态分布和Mann-Whitney rank-sum测试时正常的测试失败了。95%置信区间的差异在时间中位数之间的中心集团与可能的病人传播集团没有传输得到使用引导过程25。
只有71个不同的铜绿假单胞菌基因被发现在749隔离,这表明,在个别病人,隔离不同菌落形态大多属于同一基因型。57中发现的这些基因型只有一个病人(不同基因型),14日被发现在超过一个病人(集群基因型)。超过一半的患者(49)只携带一个基因型,20把两个基因型和七个携带三个基因型。
32例(42%)是由一个或多个殖民地与不同基因型菌株,32名患者(42%)有一个或多个基因型属于至少一个集群,和12例(16%)进行不同和集群菌株。
集群的患者44株,36株,只属于一个集群和8株属于两个集群。有统计差异集群菌株患者的年龄(19±6.95岁(1.05))与患者的年龄不同的菌株(22.3±7.49岁(1.32),p = 0.04)。患者集群应变也有类似的肺功能测试结果相比,那些不同的菌株(FEV1:49.0% (31.5 - -82.5)与35.5% (24.5 - -56.5),p = 0.092;FVC: 76.5±25.7 (4.1)与(4.4)65.3±24.8%,p = 0.065)。
32名患者不同的基因型有中等数量的基因型的1.3,而患者菌株属于一个或多个集群进行平均1.6基因型患者的数量(ns)。32个不同基因型患者的平均持续时间呆在研究所的177天,即。在研究期间和过去,而患者44共享基因型有一个值在研究所的197天(ns)。在研究期间,两组有一个类似的持续时间(集团的不同基因型患者52.5天(35 - 84)与81.5天(40 - 152)与集群基因型组,p = 0.092)。
44集群基因型患者中,有一组10个病人(包括一对兄弟姐妹)具有相同的基因型,一群七个病人,一个六,两个五,四,三,六组两个病人(包括两对兄弟姐妹)。这三个对兄弟姐妹共享至少一个基因型与他们的兄弟姐妹。44集群的患者中,38已经在到达一个共享的基因型。
中值保持在68名患者的研究绝对没有获得铜绿假单胞菌从另一个病人期间是60.5天。八个病人获得一个新的基因型期间。八个新的收购一个集群类型患者在研究期间(10.5%)的平均停留132天(ns)。没有差异的零假设的长度保持在两组之间不能正式拒绝了5%的显著性水平。量化的大小差异,95%置信区间估计的值保持在两组之间的差异与引导过程。这个置信区间是等于14192−5和相当广泛,但很大程度上是高于0,表明延长停留组可能的病人传播。
一个病人可能的病人接受了两集传输(使用两个不同的集群类型),在两个研究周期。至少五个八个病人,新获得的基因型,具有相同基因型的应变出现在另一个病人在停留期间,是短暂的,因为它可以从病人的样本不再是孤立的了离职(表3所示⇓)。这八个新感染的病人,三个最多持续殖民与新获得的菌株(4%)。一个病人继续携带新获得的菌株1年之后,决定从鼻咽吸入肺移植后拍摄的。在其他两个病人,新获得的菌株培养只是在离开康复中心之前,不幸的是,没有进一步的样本可以获得。病人传播发生在第一期两次和7次在第二(最长)研究期间。
只有四个铜绿假单胞菌隔离可以培养来自13个环境采样地点:一个从娱乐卧室水槽和三个房间。然而,这些隔离属于不同的基因型和与病人的基因型也不同。
讨论
争论还在持续是否经常呆在一个CF康复中心有利于CF患者。好处包括运动的机会,强化和优化物理疗法的技术。更注意喂养习惯,同行联系的社会和心理上的好处是显而易见的。然而,一些报道显示重要的CF病原体的相互传染的机会,特别是铜绿假单胞菌和不过复杂的物种。本研究的目的是评估传播的风险铜绿假单胞菌在De Haan比利时康复中心。在比利时,大多数CF患者定期在七医院参考中心之一,偶尔被称为De Haan康复中心,成人患者居住在一起,家里几个星期,单独的卧室,而是分享生活和餐饮设施。年轻的病人住在一起就像在一所寄宿学校。从1992年开始,种族隔离已经练习。病人在一个队列铜绿假单胞菌,消极的或铜绿假单胞菌阳性组理疗的会话期间,自1995年以来,水槽和水每天净化壁橱或者冲洗用醋和液体漂白剂。
的风险和频率铜绿假单胞菌相互传染CF患者仍然是有争议的。基因分型技术,如macro-restriction分析结合pulsed-field凝胶电泳、RAPD和fAFLP使得合理准确的克隆关系的决心铜绿假单胞菌隔离病人在一个CF或地区中心26- - - - - -29日。
然而,不同的结论对这种病原体的传播能力来自两个最近从两个大的分子流行病学研究中心在澳大利亚没有种族隔离政策16和加拿大20.。澳大利亚的横断面研究发现一个普遍的克隆的铜绿假单胞菌118年55%的感染者在儿科CF诊所16。相比之下,加拿大的纵向研究,跑过去二十年中,表现出低风险病人传播的174名患者,除了患者长期和密切接触者,如兄弟姐妹20.。先前的研究支持两组的位置,并指出的困难一般陈述这个高度多样化的和自适应的病原体。横向和纵向研究在利物浦12,14,曼彻斯特13,30.,31日和谢菲尔德32为高度传染性病毒的传播提供了令人信服的证据。在挪威CF中心,45%的患者殖民铜绿假单胞菌进行相同的应变15;这些患者之前的联系人在夏令营和培训课程。这再一次提出了这个问题相互传染的风险与CF假日营地。Oyeniyi等。33先前表明,5人铜绿假单胞菌负患者参加了一个冬令营一起在西班牙17个病人已经殖民铜绿假单胞菌所有获得的铜绿假单胞菌菌株与那些由殖民的病人。Hoogkamp-Korstanje的结果等。34是完全不同的。九十一CF患者参加了CF营地呼吸文化上执行,2周后,2个月后,定期。相互传染的发病率为7%铜绿假单胞菌,消极的人。新和持久的发病率铜绿假单胞菌殖民∼2%。作者得出的结论是,收购的整体风险是与发生在社区,这是简单而明显的喜悦和社会效益来自度假营地。巴西的一项研究35在一个CF门诊部还得出结论,相互传染的风险很低。
在这项研究中,基因型的多样性铜绿假单胞菌隔离最初被确定通过RAPD分析,然后与fAFLP在代表隔离患者个体的不同的RAPD类型培养。通过包括多个隔离从个体患者,先前的结果报告26,得出的结论是,歧视性的RAPD和fAFLP相似,是证实。在所有情况下研究,分离与相同的RAPD指纹也有相同的fAFLP指纹,确保没有不相关的隔离分成相同的RAPD基因型。对于每一个病人,所有的RAPD产品获得相同的热循环和电泳运行期间,为了避免由于有限的再现性技术差异。fAFLP通常更可再生的和,由于指纹的自动数字化,它使大规模比较数以百计的指纹,奋进号,RAPD分析是不可能的。这结合使用快速和廉价的初步筛查技术(RAPD)和更复杂的、可再生的和数字化,但也更昂贵的和艰苦的技术(fAFLP),使作者基因型大量隔离在一个负担得起的,相当方便,高度可靠和歧视性的方式。此外,建立图书馆fAFLP CF的指纹铜绿假单胞菌菌株可用于进一步的比较和长期研究。
作者的知识,这是第一份研究在CF康复中心相互传染的风险,患者密切和长时间生活在一起。在749铜绿假单胞菌隔离检查,故意包括个别病人身上不同的菌落形态类型,只发现了71种不同的基因型。在大多数长期殖民统治的患者,观察不同菌落形态类型在主隔离板,但在大多数情况下,这些属于同一基因型。Hoogkamp-Korstanje等。34也观察到隔离不同的宏观表象和不同的血清型,pyocin类型和噬菌体类型,可以是相同的,独特的基因型。Da Silva球场支持了这一结论等。35。
49岁的76名患者(64%)只携带一个单一的基因型,20把两个基因型(26%)和七进行三种类型(10%)。这证实了Mahenthiralingam的数据等。27报道,20名患者中有15个是由一个殖民地菌株和5个20殖民与两个或两个以上的压力。这也是符合Hoogkamp-Korstanje的结果等。34。
三兄弟对在当前研究中怀有至少有一个共同点。这些发现也支持Speert的数据等。17,他发现10的12个兄弟姐妹对携带相同的应变。Grothues等。36说,兄弟姐妹之间的相互传染是很常见的,表明在三的五情况只有一个兄弟包庇铜绿假单胞菌,兄弟姐妹住在单独的房子。
44岁的病人进行应变,也出现在其他患者,38已经把这个压力到达CF中心。因此,压力可以从一个共同的来源获得的或从另一个病人在前面的呆在CF中心,在更严格的感染控制措施。例如,当考虑到Y集群,十之八九的病人已经殖民相同的应变在研究期间的开始。尽管第十病人可以新收购他的Y-cluster应变(因为它不能培养的示例在到达),这一毒株是孤立的零星和间歇性地从五个36隔离,来自16个样品这个病人在8个月。可能这个病人把Y-cluster应变到来,但只是在较低的数字。8的10基因型Y隔离患者参加了中心在研究期间,这些以前的重叠呆至少53,最多242天,共1583天的重叠。因此,相互传染可能发生在该中心以前的保持。然而,两个孩子携带此集群应变以前从未在康复中心。有可能获得这一毒株的CF中心通过接触其他Y-cluster病人。
在研究期间,九集在8个病人指出新感染的病人住院期间重叠基因型已经由另一个病人。在这种情况下难以避免的结论是,病人发生传播。
的环境作为一个来源的角色铜绿假单胞菌收购在纤维化患者很难证明和仍然是一个有争议的问题。大多数以前的研究16,37- - - - - -39无法识别铜绿假单胞菌在医院病房或发现只有一小部分隔离,不同于CF菌株。不过,多尔等。40联系几株从医院下沉到那些由病人痰,手上,喉咙、鼻子和肛门,在工作人员的手中。由于严格的消毒措施,的存在铜绿假单胞菌在环境样品中心在这项研究中心可能低。此外,基因分型结果显示,这些隔离不同于那些病人。
对于大多数患者携带隔离相同的基因型,很难评估是否直接病人传播,这是由于在环境中持久的感染源或殖民患者持续的再污染环境,这就增加了感染的风险从一个环境来源。De Haan中心,环境似乎是一个不太可能的来源,因为很少铜绿假单胞菌培养环境隔离都不同于病人隔离。此外,大型基因型多样性环境中可以看出铜绿假单胞菌隔离不预测的发生数相同的隔离患者,当这些隔离已经获得独立于环境。因此,似乎一个重要的储层负责铜绿假单胞菌收购是受感染的CF患者,一个假设加强的大量相同的菌株兄弟研究发现,包括这个报告。
总之,这些研究结果证实,不同的殖民形态类型铜绿假单胞菌从相同的囊性纤维化患者通常属于同一基因型。自从38的患者44共享基因型已经到来,进行他们的基因型病人传播会发生在过去,在以前的保持。在研究期间的风险patient-to-patient-transmission(总呆8218天)相对较低(10%),和坚持殖民的风险在研究期间的新获得的菌株也低(4%)。毒株特异性差异的影响铜绿假单胞菌遗传性、感染控制实践或收购从环境水库(自然或污染)在本研究收集的数据尚不清楚。然而,似乎可以得出合理的结论,所有这些因素都应该考虑在辩论围绕着流行的争议,管理和风险铜绿假单胞菌相互传染。
确认
作者要感谢J.R.W.戈万(大学医学院,爱丁堡,苏格兰,英国)的批判阅读手稿。
- 收到了2004年4月28日。
- 接受2004年10月13日。
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