摘要
本研究的目的是观察原发性自发性气胸(PSP)患者和健康对照(经胸腔镜治疗交感神经松解治疗的原发性多汗患者)在胸膜腔内进行胸腔灌洗的炎症反应。分析灌洗液、外周血和胸膜壁层活检的细胞和溶质组成。
PSP灌洗液显示所有分化的白细胞增加,但最明显的是嗜酸性粒细胞和中性粒细胞。PSP患者血液中白细胞总数及嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和单核细胞的绝对数量也显著增加。胸膜腔内空气的存在时间与灌洗液、胸膜壁层和血液中嗜酸性粒细胞的增加呈正相关。灌洗后嗜酸性阳离子蛋白升高,与灌洗嗜酸性粒细胞的绝对数量密切相关。化疗和细胞因子分析显示,灌洗液中白细胞介素(IL)‐5、IL‐6、IL‐8、IL‐12p40、肿瘤坏死因子‐α和RANTES的浓度存在差异,但eotaxin没有差异。令人惊讶的是,还测量了高水平的脂多糖结合蛋白。
原发性自发性气胸与大量胸膜炎症反应有关。作者推测,机械拉伸因子、脂多糖结合蛋白/脂多糖复合物或其他环境成分触发了原发性自发性气胸后的胸膜炎症。
医院内科和呼吸科支持这项工作
原发性自发性气胸(PSP)是指在临床上没有明显肺部疾病的个体的胸膜腔内自然发生的空气1.PSP最常发生在身体虚弱的男性身上。吸烟也与PSP的发病机制密切相关2.既往研究表明,支气管、肺部和胸膜腔的炎症变化可能与PSP的病理生理机制有关。支气管和肺的解剖和组织学改变,如。emphysema-like变化3.和慢性细支气管炎4,5在PSP和Askinet al。6在PSP患者中观察到反应性嗜酸性胸膜炎,提示胸膜腔内的空气似乎与胸膜腔内的嗜酸性炎症反应有关。胸腔积液是罕见的,但胸腔积液嗜酸性粒细胞增多(定义为>占胸腔积液中白细胞总数的10%)7在大多数病例中都有观察到吗8.Smitet al。9观察到PSP引起胸膜液中嗜酸性粒细胞细胞的时间相关增加,这似乎是由白细胞介素(IL)‐5介导的。PSP患者通常没有胸腔积液。因此,作者开发了一种胸腔镜方法(胸腔灌洗)。10以微创方式进入胸膜腔,并对正常存在的小体积胸膜液进行分析10.
本研究的目的是通过胸腔镜胸膜灌洗和胸膜壁层活检对PSP患者胸膜腔和胸膜壁层发生的炎症变化进行表征,并与接受胸腔镜治疗原发性多汗症的其他健康对照受试者进行比较。
材料和方法
患者人群
本研究共对29例PSP患者(男性21例,女性8例,平均年龄36±16岁)和30例健康对照(男性9例,女性21例,平均年龄30±15岁)进行了研究。PSP组有21名吸烟者(72%),对照组有10名吸烟者(33%)(p=0.006)。记录气胸症状的发作时间,并考虑空气进入胸腔的开始时间。详细的病史、体格检查、胸片和完全肺功能检查证实,除手掌和/或腋下存在原发性多汗症外,所有对照组受试者健康状况良好。在纳入PSP患者之前,除了原发性自发性气胸外,所有PSP患者的其他肺疾病检测也呈阴性。每个患者都得到了口头知情同意,当地伦理委员会批准了这项研究。
胸腔灌洗技术
胸膜灌洗包括在PSP患者滑车手术前和对照组在胸腔镜交感神经松解手术前从胸膜腔注射和提取150ml生理盐水。所有程序均在严格的无菌条件下进行。关于这种技术的更多细节在其他地方描述10.
灌洗液分析
滴入混合良好的灌洗液至Bürker室,计数白细胞总数。将灌洗液离心(10分钟,2000转/分)(TJ‐6离心机,Beckman, Gent, Belgium),取出10 mL上清液,在−70℃冷冻,以便稍后分析。细胞颗粒用1ml磷酸缓冲盐水(PBS)‐1%牛血清白蛋白(BSA;Becton Dickinson, erembodegeme - aalst,比利时),然后用PBS‐5%的BSA重悬,直到悬液∼2×106细胞·毫升−1获得了。用细胞离心机(Cytospin 3, shandong Scientific Ltd, Astmoor, UK)分离细胞旋,用May-Grünwald-Giemsa染色。染色片上进行细胞计数,光镜计数300个细胞(×1,150)。
剩下的灌洗细胞悬浮在1体积PBS和9体积RNA中,之后(Sanbio, Uden, Netherlands)进行RNA保存,并在−70℃冷冻用于RT-PCR分析。
血液分析
于胸腔灌洗当日采血。使用自动细胞计数器(cell - dyn 4000, Abott, Louvain-la-Neuve, Belgium)对外周血细胞进行总数和差异计数。
胸膜壁层
在胸腔镜下使用5mm活检钳共对胸膜壁层进行了5次活检。标本用Bouin固定,石蜡包埋。切片用苏木精-伊红-藏红花染色,骨髓过氧化物酶和白细胞共同抗原染色。用光学显微镜按高功率场计数细胞,即。放大为×400时,电场上的细胞数。
溶质的分析
采用放射免疫法(Pharmacia&Upjohn, Brussels, Belgium)测定非浓缩灌洗液上清中的嗜酸性阳离子蛋白(ECP)浓度。采用市售ELISA试剂盒定量:eotaxin(敏感性试验:<2.2 pg·mL−1)、公/γ干扰素(干扰素γ应承担的;< 4 pg·毫升−1)、肿瘤坏死因子−α (TNF−α;1.7 pg·毫升−1),白细胞介素(IL)‐1β (<1 pg·mL−1)、RANTES (<3 pg·mL−1), IL‐2 (0.1 U·mL−1)、IL - 5 (<4 pg·mL−1), IL‐6 (5.5 pg·mL−1), IL‐8 (<5 pg·mL−1)、生物活性IL‐12 (<0.8 pg·mL−1), IL‐12p70 (<4 pg·mL−1) (Biosource, Nijvel, Belgium)和脂多糖(LPS)结合蛋白(LBP) (1 ng·mL−1;Sanbio、Uden、荷兰;粘质沙雷菌脂多糖(100 pg·mL−1;Sigma-Aldrich chemie, Schnelldorf, Germany)的测量是由Peterfi和Kocsis描述的11.
微生物分析
对灌洗液样本进行了细菌和真菌检测。
统计分析
细胞数据用中位数和四分位数范围表示(IR: P25-P75)。PSP数据和对照组数据之间的比较采用非参数双侧Mann-Whitney检验。采用spearman相关系数(r)分析数据之间的相关性。p<0.05时接受显著性检验。
结果
所有灌洗过程都很顺利。灌洗仅延长胸腔镜时间1 ~ 3min,无并发症发生。
气胸的持续时间
气胸的持续时间(表示为症状发生和胸腔镜干预之间的小时数)与观察到的细胞差异计数的变化相关。嗜酸性粒细胞相对数量与胸腔内空气存在时间相关(r=0.85, p<0.001)。
胸膜壁层的炎症
在胸腔镜干预期间,PSP人群中偶尔出现水泡。没有发现破裂或出血的迹象。PSP患者胸膜壁层的炎症变化不变。血氧线-伊红-藏红花染色清楚地显示嗜酸性粒细胞的存在,以及间皮增厚和胸膜增殖。髓过氧化物酶染色和白细胞共同抗原染色显示中性粒细胞增多,壁层胸膜全白细胞增多。健康对照组的胸膜壁层中没有嗜酸性粒细胞或中性粒细胞。而在PSP患者中,每高功率场有1-34个嗜酸性粒细胞(中位数6个)和6 - 12个嗜中性粒细胞(中位数7个)(p<0.001)。胸膜壁层嗜酸性粒细胞数量与灌洗液中嗜酸性粒细胞数量相关(r=0.76, p=0.002)。
嗜酸性粒细胞激活
PSP患者灌洗液中嗜酸性阳离子蛋白(ECP)浓度升高(中位数:19;红外光谱:9-43)µg·L−1而对照组的ECP浓度不明显(<2µg·L−1).ECP浓度与灌洗液中嗜酸性粒细胞的绝对数量呈正相关(r=0.96, p<0.001)。
胸膜液上清中细胞因子、趋化因子及其他生物分子的浓度
测定PSP患者和对照组灌洗液中几种趋化因子和细胞因子的浓度。PSP后IL - 5、IL - 6、IL - 8、TNF - α和LBP浓度显著升高(图2)⇓),而RANTES有所下降。TNF - α/IL - 6和TNF - α/IL - 8之间存在微弱但显著的正相关(p=0.04;r = 0.41, p = 0.03;r = 0.43)。IL - 12是一种70kda (p70)的淋巴因子,由一个40kda的亚基(p40)和一个35kda的亚基(p35)通过二硫化物桥连接而成。PSP患者灌洗液中IL‐12 (p40+p70)浓度升高(中位数:23.9;IR: 8.3-43.6),中位数:8.9;IR: 6.2-9.9),但IL - 12 (p70)未见升高,提示仅存在p40亚基。IFN‐γ、IL‐1β、IL‐2、eotaxin和LPS的浓度没有显著差异(数据未显示)。然而,两组吸烟者之间的脂多糖浓度存在显著差异(p=0.03)。 The concentration of LBP (ng·mL−1)的发病率较高(中位数:97.3;IR: 91.8-101.2),中位数:0.7;红外光谱:0.4 - 1)。
微生物分析
健康对照组和PSP患者的所有样品培养细菌和真菌均为阴性。
讨论
这是第一项前瞻性研究,对连续的PSP患者进行胸腔镜胸膜灌洗、胸膜活检和外周血检查,并与健康对照受试者进行比较。该研究显示PSP患者存在大量胸膜炎症反应,其特征是胸膜液和胸膜壁组织嗜酸性粒细胞和中性粒细胞增多,并与一种典型的细胞因子模式相关。
以前只有两篇关于PSP患者胸膜细胞计数的报道被发表8,9,显示了总的和差异细胞计数的增加,这与我们的PSP患者的结果相当。目前的研究结果证实,PSP与大量嗜酸性粒细胞流入胸膜腔有关,但也与中性粒细胞流入有关。我们的结果也证实了之前证实的胸膜液中嗜酸性粒细胞数量和气胸持续时间之间的关系。
同时检测PSP后外周血中炎症细胞的变化。两个案例报告8介绍了PSP与胸腔积液相关的血细胞计数,分别为8200和11300 WBC·mm−3,分别为5%和3%的嗜酸性粒细胞,70%和80%的中性粒细胞,23%和16%的淋巴细胞,2%和1%的单核细胞,但没有与对照组进行比较。作者观察到,与正常受试者相比,白细胞总数显著增加(9,750与7800·毫米−3)、嗜酸性粒细胞(255与90·毫米−3),中性粒细胞(5259与.4032·毫米−3)和单核细胞(765与430·毫米−3)。血液和灌洗液中嗜酸性粒细胞的绝对数量之间也存在相关性。
胸膜壁层嗜酸性粒细胞和嗜中性粒细胞数量增加也有报道6,7,但尚无定量数据。作者观察到对照组胸膜壁层中没有嗜酸性粒细胞或中性粒细胞,而PSP术后胸膜壁层中大量存在这些炎症细胞。此外,胸膜壁层嗜酸性粒细胞的数量与PSP患者灌洗液中嗜酸性粒细胞数量的增加相关。
ECP,嗜酸性粒细胞激活的标记12,13<2µg·L−1),而在PSP患者中观察到ECP浓度升高(中位数:19;红外光谱:9-43µg·L−1).ECP浓度与胸膜灌洗液中嗜酸性粒细胞的绝对数量有良好的相关性,提示活化的嗜酸性粒细胞是ECP的来源。
PSP后发生胸膜炎症的确切机制尚不清楚。IL‐5,一种嗜酸性粒细胞特异性细胞因子,刺激嗜酸性粒细胞的化学吸引和激活12,13,14可能在炎症过程中起关键作用[9,15,目前的研究],而其他嗜酸性细胞特异性细胞因子和趋化因子(如。eotaxin, RANTES)似乎没有参与。本研究观察到胸膜灌洗液中中性粒细胞数量的增加和IL - 8浓度的增加,也表明炎症反应的非特异性成分。Penidoet al。16有报道称,在LPS胸膜内刺激后,嗜酸性粒细胞迁移到胸膜腔可独立于eotaxin、RANTES和IL - 5发生。LPS是细菌内毒素的一种成分,是一种有效的细胞激活诱导剂,诱导分泌大量促炎细胞因子16,17.在脂多糖诱导的炎症中,呼吸道上皮细胞产生LBP,这是一种急性期蛋白,是对抗细菌内毒素最重要的防御物18.LBP与LPS形成复合物,巨噬细胞对其产生TNF - α和IL - 1。随着这些细胞因子的释放,炎症级联反应开始,包括IL‐6和IL‐8的产生,进而导致LBP的产生增加19.虽然在对照组和PSP患者灌洗液中LPS浓度没有差异,但在主动吸烟的受试者中,与对照组相比,PSP后灌洗液中的LPS浓度显著升高,而LBP浓度在所有PSP受试者中也显著升高。因此,根据之前的观察,作者假设,ps诱导的胸膜腔暴露于环境空气中可能导致炎症反应(通过胸膜的机械拉伸,或通过一种或多种污染物(如LPS或烟草烟雾)的促炎症作用),它的特征是嗜酸性粒细胞的流入16以及LBP的生产18.前者可能刺激IL - 5的产生20.而后者可能刺激TNF - α、IL - 1、IL - 6和IL - 8的产生。另外,由于除2例患者外,其余患者在胸腔镜检查前均行胸管引流,胸膜腔内异物的存在可能也导致了所观察到的炎症变化。为了排除这一假设,PSP患者应该接受过胸腔镜检查,没有吸入性胸管引流。然而,这种情况在临床实践中很少发生,仅在两名PSP患者中进行。有趣的是,这些患者的胸膜和血液分析与接受胸管治疗的患者相似。
不出所料,PSP人群中吸烟者较多。吸烟无疑与PSP的发病机制有关2然而,它在PSP后发生的胸膜炎症中的作用,本研究的主题,还不清楚。观察到吸烟PSP患者胸腔灌洗液中的LPS浓度高于吸烟和健康对照组,以及香烟烟雾是已知的LPS来源21,可能支持上述假说。
作者认为,原发性自发性气胸与大量胸膜炎症反应有关,其特征是嗜酸性粒细胞和中性粒细胞流入(和激活)胸膜腔和胸膜壁层,以及外周血白细胞总数的增加。胸膜灌洗液中白细胞介素‐5、白细胞介素‐6、白细胞介素8、肿瘤坏死因子‐α、白细胞介素‐12p40和脂多糖结合蛋白显著升高。这种炎症模式可能是由脂多糖介导的防御反应引起的。
致谢
作者要感谢血液学/免疫学和微生物实验室的工作人员。
- 收到了2003年7月9日。
- 接受2004年2月11日。
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